Questo protocollo consente l'isolamento di composti da molluschi con proprietà anti-criptococciche. Questa tecnica offre un approccio imparziale per identificare e isolare composti da molluschi con potenziali proprietà, compresa l'uccisione dei patogeni fungini umani. Ci sono altri composti, come gli inibitori della proteasi dell'HIV, usati per trattare i pazienti affetti da HIV.
Tuttavia, l'espansione ad altri agenti patogeni, così come lo studio delle fonti naturali, rappresenta nuove strade di scoperta. L'ultimo passaggio è il passaggio più difficile poiché i campioni potrebbero non essere filtrati. Di conseguenza, potrebbe essere necessario diluire i campioni per il filtraggio.
Inizia raccogliendo molluschi come Cipangopaludina chinensis da un'area naturale designata e approvata. Selezionare specie autoctone e invasive per valutare una vasta gamma di potenziali effetti antifungini. Rompere delicatamente il guscio del C.chinensis usando un pestello e un mortaio e rimuovere i pezzi solidi con un paio di pinzette.
Generalmente, 10 molluschi sono raggruppati per il protocollo. Raccogliere e pesare circa 15-20 grammi del campione e usare le forbici per tagliare gli organi in piccoli pezzi di circa 0,5-un centimetro. Flash congelare i campioni di organi sezionati e tagliati usando azoto liquido prima di macinare i campioni di organi in una polvere fine usando un pestello e un mortaio.
Una volta fatto, aggiungere circa 15 grammi di polvere per campioni di organo a 30 millilitri di acqua distillata fredda per ottenere un rapporto da uno a due. Versare due millilitri del campione in tubi da due millilitri ad alto impatto e aggiungere circa 500 microgrammi di perline di acciaio inossidabile da tre millimetri a ciascun tubo. Omogeneizzare per tre minuti a 1.200 RPM in quattro gradi Celsius usando un frullatore di proiettili o un battiperline.
Centrifugare il tubo a 12.000 G per 20 minuti a quattro gradi Celsius. Raccogliere il surnatante in un tubo fresco da 50 millilitri e scartare il pellet. Filtrare sterilizzare il surnatante utilizzando una membrana da 0,22 micrometri e conservare i campioni su ghiaccio prima di chiarire l'estratto.
Porre il campione surnatante in un bagno termale a 60 gradi Celsius per 30 minuti e raffreddarlo immediatamente trasferendo il campione in un secchio pieno di ghiaccio per 20 minuti. Centrifugare i campioni freddi a 15.000 G per 45 minuti a quattro gradi Celsius. Raccogliere il surnatante in un tubo fresco da 50 millilitri e scartare il pellet.
Filtrare i campioni con un filtro a membrana da 0,22 micron e quindi conservarli su ghiaccio. Una volta fatto, determinare la concentrazione proteica nel grezzo e gli estratti chiarificati utilizzando un test di quantificazione. L'intervallo di concentrazione proteica ottimale è da quattro a otto microgrammi per millilitro.
Incubare i campioni su ghiaccio per un massimo di un'ora o congelarli in azoto liquido prima di conservarli a meno 20 gradi Celsius fino al momento del bisogno. In una piastra a fondo piatto a 96 pozzetti, incubare 10 microlitri di quattro milligrammi per millilitro di estratto proteico di mollusco grezzo o chiarificato, 10 microlitri di subtilisina A, avente una concentrazione all'interno dell'intervallo lineare misurato, e 220 microlitri di 100 millimolari tris cloridrato di 8,6 pH per 10 minuti a 25 gradi Celsius. Quindi aggiungere 10 microlitri di N-succinil-alanina, alanina, prolina, fenalanina, p-nitroanilina, il substrato per la subtilisina A, ad una concentrazione finale di un KM per un volume di reazione finale di 250 microlitri.
Una volta fatto, misurare l'attività enzimatica monitorando la densità ottica a 405 nanometri ogni 15 secondi per tre minuti. Assicurarsi che i pozzetti senza estratti producano una curva diritta durante la lettura. Per determinare l'attività enzimatica residua, calcolare il rapporto tra l'attività enzimatica in presenza di estratto di mollusco e quella in assenza dell'estratto.
Se si osserva attività inibitoria, misurare il valore della concentrazione inibitoria 50 o IC50 utilizzando un intervallo di concentrazioni degli estratti. Introdurre una singola colonia di C.neoformans H99 wild type in cinque millilitri di estratto di lievito peptone destrosio o mezzo YEPD utilizzando una punta di pipetta da 10 microlitri e incubare per 16-18 ore a 30 gradi Celsius e 200 RPM. Raccogliere 500 microlitri della coltura in una cuvetta e misurare la crescita leggendo la densità ottica a 600 nanometri.
Diluire la coltura con base di azoto di lievito o mezzo YNB fino a una densità ottica finale di 0,02. Co-coltura C.neoformans cellule con diverse concentrazioni di estratti grezzi e chiarificati mescolando 10 microlitri degli estratti con 190 microlitri della coltura C.neoformans diluita in una piastra a 96 pozzetti. Misurare la crescita leggendo la densità ottica a 600 nanometri utilizzando un lettore di piastre ogni 15 minuti a un'ora per 72 ore a 200 RPM e 37 gradi Celsius.
Gli estratti di C.chinensis sono stati in grado di inibire l'attività proteolitica della subtilisina A, che è correlata alla virulenza nei neoformans di Cryptococcus con un valore IC50 di 5,3 microgrammi per millilitro negli estratti grezzi e 4,53 microgrammi per millilitro negli estratti chiarificati. La valutazione degli estratti di C.chinensis rispetto ai processi associati alla produzione di fattori di virulenza di C.Neoformans, compresa la crescita fungina, ha mostrato che vi era una significativa riduzione della crescita fungina a 37 gradi Celsius in presenza degli estratti grezzi e chiarificati di C.chinensis. La valutazione degli estratti rispetto alla capsula, alla produzione di melanina e alla formazione di biofilm ha mostrato che non vi sono stati cambiamenti nella produzione di capsule o melanina in presenza di estratti di C.chinensis grezzi o chiarificati.
Tuttavia, è stata osservata una significativa riduzione del 70-80% nella formazione di biofilm ad alte concentrazioni degli estratti grezzi e chiarificati rispetto al controllo non trattato. Il successo del protocollo dipende dalla corretta procedura di estrazione, compresa la macinazione, l'aggiunta della quantità appropriata di enzima e la semplice lettura dopo l'aggiunta del substrato. La tecnica si concentra sulla tolleranza termica come importante fattore di virulenza criptococcica.
Tuttavia, altri fattori di virulenza possono essere valutati come la produzione di melanina e capsule, nonché la formazione di biofilm. Questi risultati aprono nuovi percorsi che costituiscono nuovi approcci sulle strategie antifungine utilizzando composti naturali che offrono maggiore stabilità, specificità e sono meno inclini alla resistenza. L'obiettivo a lungo termine è quello di trovare nuovi metodi contro questi patogeni fungini e ridurre al minimo i meccanismi di resistenza.
