يصف هذا البروتوكول الطرق التي تسمح للمحققين بالتعبير عن CDNAs أو SIRNAs في ظهارة المسالك البولية في المثانة الأصلية. المزايا الرئيسية لهذه التقنية هي بساطتها النسبية ، والقدرة على التعبير عن cDNAs ، siRNAs في الظهارة البولية بكفاءة عالية ، وخلال فترة زمنية قصيرة نسبيا. الجزء الأصعب من هذه التقنية هو القسطرة.
ومع ذلك ، فإن التقنية الشاملة سهلة نسبيا لإتقانها بمجرد تعلمها. سيكون جيوفاني رويز ، أخصائي الأبحاث الرابع في مختبري. للبدء ضع الماوس المخدر على وسادة تدفئة بجوار مخاريط الأنف.
الحفاظ على الحيوان تحت التخدير طوال مدة البروتوكول. تأكد من تخدير الماوس تماما بقرصة إصبع القدم. لمنع دخول الهواء إلى المثانة ، املأ جزء القسطرة البلاستيكية من القسطرة الوريدية والمحور المرتبط بها ب PBS المعقم باستخدام ماصة نقل أو حقنة معقمة.
مع الحيوان في موقف ضعيف مسحة الصماخ مجرى البول الخارجي مع 70 ٪ الكحول. ثم أمسك برفق الأنسجة التي تشكل صماخ مجرى البول الخارجي وقم بتمديده عموديا بعيدا عن الحيوان باستخدام ملقط دقيق. أدخل القسطرة المعقمة في الصماخ الخارجي.
باستخدام اليد الأخرى ، أدخل القسطرة عموديا بعناية حوالي ثلاثة إلى أربعة ملليمترات في صماخ مجرى البول. ثم قم بخفض القسطرة التي يتم إدخالها في الصماخ الخارجي باتجاه ذيل الحيوان ، مما يسهل دخوله إلى جزء مجرى البول الذي يمر أسفل عظم العانة وفي النهاية إلى المثانة. اسمح للبول في المثانة بالتسرب.
قم بإزالة أي بول متبقي عن طريق إجراء مناورة Crede عن طريق التدليك والضغط برفق على نتوء المثانة في منطقة أسفل البطن. لجعل الظهارة البولية متقبلة للتنبيغ ، اغسل الفأر أو مثانة الفئران عن طريق ربط حقنة معقمة واحدة ملليلتر مملوءة ب PBS بمحور القسطرة. حقن 100 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني معقم في المثانة الماوس.
بعد فصل المحقنة عن تركيب القسطرة ، اترك برنامج تلفزيوني بالتصريف. غرس 100 ميكرولتر من 0.1٪ N-dodecyl-beta-D-maltoside المذاب في PBS ومرشح 0.2 ميكرومتر معقم في مثانة الماوس باستخدام حقنة معقمة سعة ملليلتر واحد. احتفظ ب N-dodecyl-beta-D-maltoside في المثانة لمدة 10 دقائق عن طريق ترك المحقنة في مكانها.
قم بإزالة N-dodecyl-beta-D-maltoside من المثانة عن طريق فصل المحقنة والسماح لها بالتصريف. لإدخال الفيروس في المثانة ، قم بتوصيل حقنة معقمة بحجم ملليلتر واحد إلى مركز القسطرة وغرس 5،000،000 إلى 100،000،000 IVP من الفيروس الغدي المخفف في 100 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني معقم للفئران ، أو 450 ميكرولتر للفئران في المثانة. بعد 30 دقيقة ، افصل المحقنة واسمح لمحلول الفيروس بإخلاء المثانة على وسادة يمكن التخلص منها.
امسح أي محلول فيروسي متبقي بمنديل ماص أثناء التخلص من الضمادة وامسح النفايات الخطرة بيولوجيا. من أجل السماح للحيوان بالتعافي ، توقف عن تدفق الأيزوفلوران. اسمح للحيوان بالتعافي والحركة الكاملة قبل إعادته إلى قفصه ، خاصة إذا كانت الحيوانات مجمعة.
تحليل آثار التعبير الجيني المحور بعد 12 إلى 72 ساعة من العلاج باستخدام طرق مثل تهجين mRNA في الموقع أو اللطخة الغربية أو التألق المناعي. كشف تحليل اللطخة الغربية لمحللات الظهارة البولية عن تعبير هرمون النمو البشري الموسوم ب V5 في ظهارة البول للمثانات المتحولة ، ولكن ليس في تلك غير المحولة. تم تأكيد التعبير أيضا من خلال التألق المناعي باستخدام الأجسام المضادة التي تعرفت على هرمون النمو البشري ، أو علامة V5 epitope.
أكد تحليل اللطخة الغربية تعبير Claudin-2 في الفئران التي تم تحويلها بالفيروس الغدي ، ولكن ليس في تلك التي تم تحويلها باستخدام فيروس ترميز GFP خاضع للرقابة. أكد تحليل التألق المناعي كذلك تعبير Claudin-2 الخارجي في خلايا مظلة الظهارة البولية المنقولة بتشفير الفيروس Claudin-2 cDNA. كشف الكشف عن Claudin-2 الخارجي في بروتين التقاطع الضيق 1 عن طريق التألق المناعي والفحص المجهري متحد البؤر للظهارة البولية المركبة أو المستعرضة بالكامل عن وجود تقاطع ضيق وتراكمات داخل الخلايا من Claudin-2 في سيتوبلازم الخلية.
يظهر حقل الصورة أن حساب عدد الخلايا المظلة المستحثة يكشف عن كفاءة تقترب من 95٪وفي كامل جدار المثانة يتم تحويل الظهارة البولية فقط ، ولا يتم استهداف أي نسيج آخر بواسطة الفيروس الغدي المغروس. القسطرة أمر بالغ الأهمية لكي يعمل البروتوكول على النحو المنشود. تسمح هذه التقنية للباحثين بدراسة بيولوجيا الظهارة البولية الطبيعية ، وكذلك فهم الحالات التي يؤدي فيها الإفراط في التعبير عن البروتين ، أو نقص التعبير ، إلى المرض.
