Этот протокол описывает методы, которые позволяют исследователям экспрессировать КДНК или МИРНК в нативном уротелии мочевого пузыря. Основными преимуществами данной методики являются ее относительная простота, способность экспрессировать кДНК, миРНК в уротелии с высокой эффективностью и в относительно короткий промежуток времени. Самой сложной частью этой техники является катетеризация.
Тем не менее, общую технику относительно легко освоить после изучения. Продемонстрирует процедуру Джованни Руис, специалист по исследованиям IV в моей лаборатории. Для начала положите обезболиваемую мышь на грелку рядом с носовыми колбочками.
Держите животное под наркозом в течение всего срока действия протокола. Подтвердите, что мышь полностью обезболивается, ущипнув палец ноги. Чтобы предотвратить попадание воздуха в мочевой пузырь, заполните пластиковую катетерную часть внутривенного катетера и связанного с ним концентратора стерильным PBS с помощью стерильной пипетки или шприца для переноса.
При нахождении животного в положении лежа на спине промазывают наружный мочеиспускательный канал 70%-ным спиртом. Затем аккуратно захватите ткань, образующую наружный проход уретры, и вытяните ее вертикально от животного с помощью тонких щипцов. Вставьте стерильный катетер в наружный проход.
Другой рукой осторожно введите катетер вертикально примерно на три-четыре миллиметра в проход уретры. Затем опустите катетер, введенный в наружный проход, к хвосту животного, что облегчит его вход в ту часть уретры, которая проходит ниже лобковой кости и, в конечном итоге, в мочевой пузырь. Дайте моче в мочевом пузыре вытечь.
Удалите остатки мочи, выполнив маневр Креда, массируя и осторожно надавливая на шишку мочевого пузыря в нижней части живота. Чтобы сделать уротелий восприимчивым к трансдукции, промойте мочевой пузырь мыши или крысы, присоединив стерильный шприц объемом один миллилитр, наполненный PBS, к концентратору катетера. Введите 100 микролитров стерильного PBS в мочевой пузырь мыши.
Отсоединив шприц от штуцера катетера, дайте PBS стечь. Закапывают 100 микролитров 0,1% N-додецил-бета-D-мальтозида, растворенного в PBS, и 0,2-микрометрового фильтра, стерилизованного в мочевой пузырь мыши с помощью стерильного шприца объемом один миллилитр. Удерживайте N-додецил-бета-D-мальтозид в мочевом пузыре в течение 10 минут, оставив шприц на месте.
Удалите N-додецил-бета-D-мальтозид из мочевого пузыря, отсоединив шприц и позволив ему стечь. Чтобы ввести вирус в мочевой пузырь, прикрепите стерильный шприц объемом один миллилитр к концентратору катетера и закапывайте в мочевой пузырь от 5 000 000 до 100 000 000 IVP аденовируса, разведенного в 100 микролитрах стерильного PBS для мышей или 450 микролитров для крыс. Через 30 минут отсоедините шприц и дайте раствору вируса эвакуироваться из мочевого пузыря на одноразовую прокладку.
Промокните любой остаточный раствор вируса впитывающей салфеткой, выбросив прокладку, и протрите биологически опасные отходы. Для того чтобы дать возможность животному восстановиться, прекратите поступление изофлурана. Дайте животному восстановиться и быть полностью мобильным, прежде чем возвращать его в клетку, особенно если животные содержатся в группе.
Проанализируйте эффекты экспрессии трансгенов через 12–72 часа после лечения, используя такие методы, как гибридизация мРНК in situ, вестерн-блоттинг или иммунофлуоресценция. Вестерн-блоттинг-анализ уротелиальных лизатов выявил экспрессию V5-меченного гормона роста человека в уротелии трансдуцированных мочевых пузырей, но не в нетрансдуцированных. Экспрессия также была подтверждена иммунофлуоресценцией с использованием антител, которые распознавали гормон роста человека, или эпитопную метку V5.
Вестерн-блоттинг подтвердил экспрессию клаудина-2 у крыс, трансдуцированных аденовирусом, но не у крыс, трансдуцированных контролируемым вирусом, кодирующим GFP. Иммунофлуоресцентный анализ дополнительно подтвердил экзогенную экспрессию клаудина-2 в уротелиальных зонтичных клетках, трансдуцированных вирус-кодирующей кДНК клаудина-2. Обнаружение экзогенного клаудина-2 в белке плотного соединения 1 с помощью иммунофлуоресценции и конфокальной микроскопии целого смонтированного или поперечного уротелия выявило наличие плотного соединения и внутриклеточных скоплений клаудина-2 в цитоплазме клетки.
Поле изображения показывает, что подсчет количества трансдуцированных зонтичных клеток показывает эффективность, которая приближается к 95%, и во всей стенке мочевого пузыря трансдуцируется только уротелий, и никакая другая ткань не нацелена на инстилированный аденовирус. Катетеризация имеет решающее значение для того, чтобы протокол работал должным образом. Этот метод позволяет исследователям изучать нормальную уротелиальную биологию, а также понимать условия, при которых чрезмерная экспрессия или недостаточная экспрессия белка приводит к заболеванию.
