このプロトコルは、研究者が天然の膀胱尿路上皮でCDNAまたはSIRNAを発現できるようにする方法について説明しています。この技術の主な利点は、その比較的単純さ、尿路上皮内のcDNA、siRNAを高効率で、そして比較的短期間で発現する能力である。この技術の最も難しい部分はカテーテル法です。
ただし、全体的なテクニックは、一度習得すると比較的簡単に習得できます。手順を実演するのは、私の研究室の研究スペシャリストIVであるジョバンニルイスです。まず、麻酔をかけたマウスをノーズコーンの隣の加熱パッドに置きます。
プロトコルの期間中、動物を麻酔下で維持します。つま先をつまんでマウスが完全に麻酔されていることを確認します。膀胱に空気が入らないようにするには、滅菌トランスファーピペットまたはシリンジを使用して、IVカテーテルのプラスチックカテーテル部分と関連するハブに滅菌PBSを充填します。
動物を仰臥位にして、外尿道口を70%アルコールで拭きます。次に、外尿道口を形成する組織をそっとつかみ、細かい鉗子を使用して動物から垂直に伸ばします。滅菌カテーテルを外道に挿入します。
もう一方の手を使用して、カテーテルを尿道口に約3〜4ミリメートル垂直に慎重に挿入します。次に、外口に挿入されたカテーテルを動物の尾に向かって下げ、恥骨の下を通り、最終的には膀胱に入る尿道の部分への侵入を容易にします。膀胱内の尿が漏れるのを待ちます。
下腹部の膀胱隆起をマッサージしてそっと押し下げることにより、クリードの操作を実行して、残りの尿を取り除きます。尿路上皮を形質導入を受け入れやすくするには、PBSで満たされた滅菌1ミリリットルのシリンジをカテーテルハブに取り付けて、マウスまたはラットの膀胱を洗浄します。100マイクロリットルの滅菌PBSをマウスの膀胱に注入します。
シリンジをカテーテルフィッティングから取り外した後、PBSを排出させます。滅菌した1ミリリットルのシリンジを使用して、PBSおよび滅菌した0.2マイクロメートルのフィルターに溶解した0.1%N-ドデシル-β-D-マルトシド100マイクロリットルをマウス膀胱に注入します。シリンジを所定の位置に残して、N-ドデシル-ベータ-D-マルトシドを膀胱内に10分間保持します。.
N-ドデシル-β-D-マルトシドを膀胱から取り外し、シリンジを取り外して排出させます。.ウイルスを膀胱に導入するには、滅菌1ミリリットルのシリンジをカテーテルハブに取り付け、マウスの場合は100マイクロリットルの滅菌PBS、ラットの場合は450マイクロリットルで希釈した5, 000, 000〜100, 000,000 IVPのアデノウイルスを膀胱に注入します。30分後、シリンジを取り外し、ウイルス溶液が膀胱を使い捨てパッドに排出できるようにします。
パッドを廃棄しながら、残留ウイルス溶液を吸収性ワイプで拭き取り、バイオハザード廃棄物で拭きます。動物が回復することを可能にするために、イソフルランの流れを止める。特に動物がグループハウスされている場合は、ケージに戻す前に、動物が回復し、完全に移動できるようにします。
mRNA in situハイブリダイゼーション、ウェスタンブロット、免疫蛍光などの方法を使用して、治療後12〜72時間の導入遺伝子発現の影響を分析します。尿路上皮ライセートのウェスタンブロット分析では、形質導入された膀胱の尿路上皮でV5タグ付きヒト成長ホルモンの発現が明らかになりましたが、形質導入されていない膀胱では発現しませんでした。発現は、ヒト成長ホルモン、またはV5エピトープタグを認識する抗体を用いた免疫蛍光法によっても確認された。
ウェスタンブロット分析では、アデノウイルスを形質導入したラットではクローディン-2の発現が確認されましたが、制御されたGFPコードウイルスを形質導入したラットでは確認されませんでした。免疫蛍光分析により、ウイルスをコードするクローディン-2 cDNAで形質導入された尿路上皮傘細胞における外因性クローディン-2発現がさらに確認されました。マウントまたは断面尿路上皮全体の免疫蛍光および共焦点顕微鏡によるタイトジャンクションタンパク質1中の外因性クローディン-2の検出により、細胞質におけるクローディン-2のタイトジャンクションおよび細胞内蓄積の存在が明らかになりました。
画像フィールドは、形質導入された傘細胞の数を数えると、95%に近づく効率が明らかになり、膀胱壁全体で尿路上皮のみが形質導入され、他の組織は注入されたアデノウイルスの標的にならないことを示しています。カテーテル法は、プロトコルが意図したとおりに機能するために重要です。この技術により、研究者は正常な尿路上皮生物学を研究し、タンパク質の過剰発現または発現不足が疾患につながる状態を理解することができます。
