Dieses Protokoll beschreibt Methoden, die es den Forschern ermöglichen, CDNAs oder SIRNAs im nativen Blasenurothel zu exprimieren. Die Hauptvorteile dieser Technik sind ihre relative Einfachheit, die Fähigkeit, cDNAs, siRNAs im Urothel mit hoher Effizienz und innerhalb eines relativ kurzen Zeitraums zu exprimieren. Der schwierigste Teil dieser Technik ist die Katheterisierung.
Die gesamte Technik ist jedoch relativ einfach zu beherrschen, wenn sie einmal erlernt ist. Das Verfahren wird von Giovanni Ruiz, einem Forschungsspezialisten IV in meinem Labor, demonstriert. Legen Sie zunächst die betäubte Maus auf ein Heizkissen neben den Nasenkegeln.
Halten Sie das Tier für die Dauer des Protokolls unter Narkose. Vergewissern Sie sich, dass die Maus mit einer Zehenprise vollständig betäubt ist. Um zu verhindern, dass Luft in die Blase gelangt, füllen Sie den Kunststoffkatheterteil eines IV-Katheters und die zugehörige Nabe mit sterilem PBS mit einer sterilen Transferpipette oder Spritze.
Wenn sich das Tier in Rückenlage befindet, tupfen Sie den äußeren Harnröhrengang mit 70% Alkohol ab. Greifen Sie dann vorsichtig nach dem Gewebe, das den äußeren Harnröhrengang bildet, und strecken Sie es mit einer feinen Pinzette senkrecht vom Tier weg. Führen Sie den sterilen Katheter in den äußeren Meatus ein.
Führen Sie den Katheter mit der anderen Hand vorsichtig senkrecht etwa drei bis vier Millimeter in den Harnröhrengang ein. Senken Sie dann den Katheter, der in den äußeren Meatus eingeführt wird, in Richtung des Schwanzes des Tieres, was den Eintritt in den Teil der Harnröhre erleichtert, der unterhalb des Schambeins und schließlich in die Blase verläuft. Lassen Sie den Urin in der Blase austreten.
Entfernen Sie den Restharn, indem Sie das Crede-Manöver ausführen, indem Sie den Blasenbuckel im Unterbauchbereich massieren und sanft nach unten drücken. Um das Urothel für die Transduktion empfänglich zu machen, waschen Sie die Maus- oder Rattenblase, indem Sie eine sterile Ein-Milliliter-Spritze, die mit PBS gefüllt ist, an der Katheternabe anbringen. Injizieren Sie 100 Mikroliter steriles PBS in die Mausblase.
Nachdem Sie die Spritze von der Katheterverschraubung abgenommen haben, lassen Sie das PBS abtropfen. 100 Mikroliter 0,1%N-Dodecyl-beta-D-Maltosid, gelöst in PBS, und 0,2 Mikrometer Filter, sterilisiert in die Mausblase, werden mit einer sterilen Ein-Milliliter-Spritze sterilisiert. Halten Sie das N-Dodecyl-beta-D-Maltosid 10 Minuten lang in der Blase, indem Sie die Spritze an Ort und Stelle lassen.
Entfernen Sie das N-Dodecyl-beta-D-Maltosid aus der Blase, indem Sie die Spritze abnehmen und abtropfen lassen. Um das Virus in die Blase einzuführen, befestigen Sie eine sterile Ein-Milliliter-Spritze an der Katheternabe und träufeln Sie 5.000.000 bis 100.000.000 IVP Adenovirus, verdünnt in 100 Mikrolitern sterilem PBS für Mäuse oder 450 Mikroliter für Ratten, in die Blase ein. Nehmen Sie nach 30 Minuten die Spritze ab und lassen Sie die Viruslösung die Blase auf ein Einwegkissen evakuieren.
Tupfen Sie alle Restvirenlösung mit einem saugfähigen Tuch ab, während Sie das Pad entsorgen, und wischen Sie biologisch gefährliche Abfälle ab. Damit sich das Tier erholen kann, stoppen Sie den Fluss von Isofluran. Lassen Sie das Tier sich erholen und vollständig mobil sein, bevor Sie es in seinen Käfig zurückbringen, insbesondere wenn die Tiere in einer Gruppe untergebracht sind.
Analysieren Sie die Auswirkungen der Transgenexpression 12 bis 72 Stunden nach der Behandlung mit Methoden wie mRNA-in-situ-Hybridisierung, Western Blot oder Immunfluoreszenz. Die Western-Blot-Analyse von Urothellysaten ergab eine V5-markierte Expression des menschlichen Wachstumshormons im Urothel der transduzierten Blasen, nicht jedoch in den nicht transduzierten. Die Expression wurde auch durch Immunfluoreszenz unter Verwendung von Antikörpern bestätigt, die das menschliche Wachstumshormon oder das V5-Epitop-Tag erkannten.
Die Western-Blot-Analyse bestätigte die Expression von Claudin-2 bei Ratten, die mit Adenovirus transduziert wurden, jedoch nicht bei solchen, die mit einem kontrollierten GFP-kodierenden Virus transduziert wurden. Die Immunfluoreszenzanalyse bestätigte außerdem die exogene Claudin-2-Expression in Urothel-Umbrella-Zellen, die mit viruskodierender Claudin-2-cDNA transduziert wurden. Der Nachweis von exogenem Claudin-2 im Tight Junction Protein 1 durch Immunfluoreszenz und konfokale Mikroskopie des gesamten montierten oder im Querschnitt geschnittenen Urothels zeigte das Vorhandensein von Tight Junction und intrazellulären Akkumulationen von Claudin-2 im Zellzytoplasma.
Das Bildfeld zeigt, dass die Zählung der Anzahl der transduzierten Regenschirmzellen eine Effizienz von fast 95% zeigt, und in der gesamten Blasenwand wird nur das Urothel transduziert, und kein anderes Gewebe wird vom eingeträufelten Adenovirus angegriffen. Die Katheterisierung ist entscheidend, damit das Protokoll wie beabsichtigt funktioniert. Diese Technik ermöglicht es den Forschern, die normale Urothelbiologie zu untersuchen und Bedingungen zu verstehen, bei denen eine Über- oder Unterexpression von Proteinen zu Krankheiten führt.
