Questo protocollo descrive i metodi che consentono ai ricercatori di esprimere CDNA o SIRNA nell'urotelio vescicale nativo. I principali vantaggi di questa tecnica sono la sua relativa semplicità, la capacità di esprimere cDNA, siRNA nell'urotelio con alta efficienza e in un periodo di tempo relativamente breve. La parte più difficile di questa tecnica è il cateterismo.
Tuttavia, la tecnica complessiva è relativamente facile da padroneggiare una volta appresa. A dimostrare la procedura sarà Giovanni Ruiz, Research Specialist IV nel mio laboratorio. Per iniziare posizionare il topo anestetizzato su una piastra riscaldante vicino ai coni del naso.
Mantenere l'animale sotto anestesia per tutta la durata del protocollo. Confermare che il mouse è completamente anestetizzato con un pizzico di punta. Per evitare l'introduzione di aria nella vescica, riempire la porzione di catetere di plastica di un catetere IV e dell'hub associato con PBS sterile utilizzando una pipetta di trasferimento sterile o una siringa.
Con l'animale in posizione supina tamponare il meato uretrale esterno con alcol al 70%. Quindi afferrare delicatamente il tessuto che forma il meato uretrale esterno ed estenderlo verticalmente lontano dall'animale usando una pinza fine. Inserire il catetere sterile nel meato esterno.
Usando l'altra mano inserire con attenzione il catetere verticalmente di circa tre o quattro millimetri nel meato uretrale. Quindi abbassare il catetere inserito nel meato esterno verso la coda dell'animale, che facilita il suo ingresso nella porzione dell'uretra che passa sotto l'osso pubico e infine nella vescica. Lasciare che l'urina nella vescica fuoriesca.
Rimuovere l'urina residua eseguendo la manovra di Creda massaggiando e premendo delicatamente verso il basso sulla protuberanza della vescica nella zona addominale inferiore. Per rendere l'urotelio ricettivo alla trasduzione, lavare la vescica del topo o del ratto attaccando una siringa sterile da un millilitro piena di PBS all'hub del catetere. Iniettare 100 microlitri di PBS sterile nella vescica del topo.
Dopo aver staccato la siringa dal catetere, lasciare drenare il PBS. Instillare 100 microlitri di 0,1% N-dodecil-beta-D-maltoside sciolto in PBS e filtro da 0,2 micrometri sterilizzato nella vescica del topo utilizzando una siringa sterile da un millilitro. Mantenere la N-dodecil-beta-D-maltoside nella vescica per 10 minuti lasciando la siringa in posizione.
Rimuovere l'N-dodecil-beta-D-maltoside dalla vescica staccando la siringa e lasciandola defluire. Per introdurre il virus nella vescica attaccare una siringa sterile da un millilitro all'hub del catetere e instillare 5.000.000 a 100.000.000 IVP di adenovirus diluito in 100 microlitri di PBS sterile per i topi o 450 microlitri per i ratti nella vescica. Dopo 30 minuti, staccare la siringa e lasciare che la soluzione virale evacui la vescica su un tampone monouso.
Tamponare qualsiasi soluzione di virus residuo con una salvietta assorbente mentre si elimina il tampone e pulire i rifiuti biopericolosi. Per consentire all'animale di riprendersi, cessare il flusso di isoflurano. Consentire all'animale di riprendersi ed essere completamente mobile prima di riportarlo nella sua gabbia, in particolare se gli animali sono alloggiati in gruppo.
Analizzare gli effetti dell'espressione transgenica da 12 a 72 ore dopo il trattamento utilizzando metodi come l'ibridazione mRNA in situ, Western blot o immunofluorescenza. L'analisi Western blot dei lisati uroteliali ha rivelato l'espressione dell'ormone della crescita umano marcato V5 nell'urotelio delle vesciche trasdotte, ma non in quelle non trasdotte. L'espressione è stata confermata anche dall'immunofluorescenza utilizzando anticorpi che hanno riconosciuto l'ormone della crescita umano, o il tag dell'epitopo V5.
L'analisi Western blot ha confermato l'espressione di Claudin-2 nei ratti trasdotti con adenovirus, ma non in quelli trasdotti con un virus codificante GFP controllato. L'analisi di immunofluorescenza ha ulteriormente confermato l'espressione esogena di Claudin-2 in cellule ombrello uroteliali trasdotte con il cDNA di Claudin-2 codificante il virus. Il rilevamento di Claudin-2 esogeno nella Tight Junction Protein 1 mediante immunofluorescenza e microscopia confocale dell'intero urotelio montato o in sezione trasversale ha rivelato la presenza di Tight Junction e accumuli intracellulari di Claudin-2 nel citoplasma cellulare.
Il campo dell'immagine mostra che il conteggio del numero di cellule ombrello trasdotte rivela un'efficienza che si avvicina al 95% e nella totalità della parete della vescica viene trasdotto solo l'urotelio e nessun altro tessuto è preso di mira dall'adenovirus instillato. Il cateterismo è fondamentale affinché il protocollo funzioni come previsto. Questa tecnica consente ai ricercatori di studiare la normale biologia uroteliale, nonché di comprendere le condizioni in cui la sovraespressione proteica, o sottoespressione, porta alla malattia.
