Este protocolo descreve métodos que permitem aos investigadores expressar CDNAs ou SIRNAs no urotélio vesical nativo. As principais vantagens desta técnica são sua relativa simplicidade, a capacidade de expressar cDNAs, siRNAs no urotélio com alta eficiência, e dentro de um período relativamente curto de tempo. A parte mais difícil dessa técnica é o cateterismo.
No entanto, a técnica geral é relativamente fácil de dominar uma vez aprendida. Quem demonstrará o procedimento será Giovanni Ruiz, Especialista em Pesquisa IV em meu laboratório. Para começar, coloque o mouse anestesiado em uma almofada de aquecimento ao lado dos cones nasais.
Manter o animal sob anestesia durante todo o protocolo. Confirme se o rato está completamente anestesiado com uma pinça do dedo do pé. Para evitar a introdução de ar na bexiga, preencha a porção plástica do cateter de um cateter intravenoso e o cubo associado com PBS estéril usando uma pipeta ou seringa de transferência estéril.
Com o animal em decúbito dorsal swab do meato uretral externo com álcool a 70%. Em seguida, pegue suavemente o tecido que forma o meato uretral externo e estenda-o verticalmente para longe do animal usando pinças finas. Inserir o cateter estéril no meato externo.
Com a outra mão, insira cuidadosamente o cateter verticalmente cerca de três a quatro milímetros no meato uretral. Em seguida, abaixe o cateter inserido no meato externo em direção à cauda do animal, o que facilita sua entrada na porção da uretra que passa abaixo do osso púbico e, por fim, na bexiga. Deixe a urina na bexiga vazar.
Remova qualquer urina residual realizando a manobra de Crede massageando e pressionando suavemente a bexiga na área abdominal inferior. Para tornar o urotélio receptivo à transdução, lave a bexiga de camundongo ou rato anexando uma seringa estéril de um mililitro preenchida com PBS ao cubo do cateter. Injete 100 microlitros de PBS estéril na bexiga do rato.
Depois de retirar a seringa do encaixe do cateter, deixe o PBS drenar. Instilar 100 microlitros de N-dodecil-beta-D-maltosídeo 0,1% dissolvido em PBS e filtro de 0,2 micrômetro esterilizado na bexiga de camundongo usando uma seringa estéril de um mililitro. Retenha o N-dodecil-beta-D-maltosídeo na bexiga durante 10 minutos, deixando a seringa no lugar.
Retire o N-dodecil-beta-D-maltosídeo da bexiga desprendendo a seringa e deixando-a escorrer. Para introduzir o vírus na bexiga, conecte uma seringa estéril de um mililitro ao cubo do cateter e instile 5.000.000 a 100.000.000 IVP de adenovírus diluídos em 100 microlitros de PBS estéril para camundongos, ou 450 microlitros para ratos na bexiga. Após 30 minutos, retire a seringa e deixe a solução do vírus evacuar a bexiga para uma almofada descartável.
Limpe qualquer solução de vírus residual com um lenço absorvente enquanto descarta a almofada e limpe os resíduos bioperigosos. Para permitir que o animal se recupere, cesse o fluxo de isoflurano. Permita que o animal se recupere e fique totalmente móvel antes de devolvê-lo à sua gaiola, especialmente se os animais estiverem alojados em grupo.
Analisar os efeitos da expressão de transgenes 12 a 72 horas após o tratamento usando métodos como hibridização in situ de mRNA, Western blot ou imunofluorescência. A análise por Western blot de lisados uroteliais revelou expressão do hormônio do crescimento humano marcado com V5 no urotélio de bexigas transduzidas, mas não em bexigas não transduzidas. A expressão também foi confirmada por imunofluorescência usando anticorpos que reconheceram o hormônio do crescimento humano, ou a etiqueta do epítopo V5.
A análise de Western blot confirmou a expressão de Claudin-2 em ratos transduzidos com adenovírus, mas não naqueles transduzidos com um vírus codificador de GFP controlado. A análise de imunofluorescência confirmou ainda a expressão exógena de Claudin-2 em células uroteliais do guarda-chuva transduzidas com cDNA Claudin-2 codificador de vírus. A detecção de Claudin-2 exógeno na Tight Junction Protein 1 por imunofluorescência e microscopia confocal de urotélio montado ou seccionado transversalmente revelou a presença de Tight Junction e acúmulos intracelulares de Claudin-2 no citoplasma celular.
O campo da imagem mostra que a contagem do número de células transduzidas revela uma eficiência que se aproxima de 95% e em toda a parede da bexiga apenas o urotélio é transduzido, e nenhum outro tecido é alvo do adenovírus instilado. O cateterismo é fundamental para que o protocolo funcione como pretendido. Esta técnica permite aos investigadores estudar a biologia urotelial normal, bem como compreender as condições em que a superexpressão de proteínas, ou subexpressão, leva à doença.
