يلعب ميكروبيوم الأمعاء أدوارا مهمة في تشكيل فسيولوجيا المضيف. يسمح هذا البروتوكول ، على وجه الخصوص ، بتقييم الإنتاجية العالية لمستويات استعمار ميكروب الأمعاء الفلورية في الخلوية المفردة على نطاق واسع. تتمثل إحدى الفوائد الرئيسية لهذه الطريقة في القدرة على مراقبة ميكروبيوم الأمعاء للحيوانات الحية في الوقت الفعلي ، مما يسمح بتحديد وربط أي تغييرات مع فسيولوجيا المضيف.
ستوضح دانا بلاكبيرن ، وهي باحثة مشاركة من مختبري. ابدأ بغسل الديدان من العشب البكتيري بواحد إلى ملليلتر من M9-TX. نقل الديدان إلى لوحة معقمة 2 ملليلتر 96 بئر عميقة.
بيليه لهم في 300 غرام لمدة دقيقة واحدة وإزالة السائل باستخدام مشعب النضوء. باستخدام ماصة متعددة القنوات سعة 1.2 ملليلتر ، أضف 1.8 ملليلتر من M9-TX إلى كل بئر من صفيحة البئر العميقة الممزوجة بالسحب عدة مرات وأجهزة الطرد المركزي عند 300 جرام لمدة دقيقة واحدة. بعد الغسيل النهائي ، ارفع الحجم في كل بئر إلى 100 ميكرولتر ، باستخدام مشعب الاستنشاق.
أضف 100 ميكرولتر من 10 مليمول ليفاميزول و M9-T إلى كل بئر ، واترك الديدان تشل لمدة خمس دقائق. ثم أضف محلول التبييض بنسبة 4٪ إلى كل بئر لمدة دقيقتين لتقليل الكتل البكتيرية. بعد معالجة المبيض ، أضف M9-TX في كل بئر من اللوحة لغسل الديدان.
أجهزة الطرد المركزي لوحة ونضح إلى حجم نهائي من 100 ميكرولتر بعد الغسيل الثاني. نقل الديدان إلى لوحة بئر مسطحة القاع 96 ، تحتوي على 150 ميكرولتر من 10 مليمول من ليفاميزول و M9-TX. حافظ على كثافة الدودة عند 50 إلى 100 دودة لكل بئر وقسم الديدان إلى آبار متعددة إذا كان السكان مزدحمين للغاية.
قم بتشغيل ضاغط الهواء والكمبيوتر وأداة LPS. افحص وأفرغ خزان النفايات. افحص وأعد ملء الغلاف وخزانات المياه إذا كان الحجم منخفضا.
تأكد من أن مجموعة النواة السائلة والبصرية 250 ميكرومتر في مكانها. قم بتوصيل وتشغيل أخذ العينات التلقائي. افتح برنامج أداة أخذ العينات الأوتوماتيكية لفتح جهاز أخذ العينات التلقائي وبرنامج LPS.
في نافذة برنامج LPS ، انتقل إلى ملف وانقر فوق تجربة جديدة ، ثم حدد ملف مرة أخرى وانقر فوق فحص عينة جديدة. قم بتمكين الليزر من تشغيل ليزر 488 و 561 نانومتر إذا لم يتم ذلك بالفعل. الآن قم بإنشاء قوالب لمخططات نقاط الاستحواذ ، باستخدام وقت الرحلة والانقراض وقنوات الفلورسنت في نافذة برنامج LPS.
انقر بزر الماوس الأيمن داخل نص الرسم البياني لتعديل القياس. بعد ذلك ، قم بتحميل عينات التحكم. في نافذة أخذ العينات التلقائي، حدد prime، وانتقل إلى ملف، وانقر فوق فتح البرنامج النصي لتحديد البرنامج النصي المدمج الصحيح وانقر فوق موافق.
انتقل إلى قالب اللوحة في قائمة برنامج أخذ العينات لتحديد الآبار المطلوبة للتحليل. بعد تحميل اللوحة وتثبيتها في مرحلة أخذ العينات التلقائي، اضغط على لوحة التشغيل في نافذة أخذ العينات الأوتوماتيكية واحفظ الملف عندما يطلب منك ذلك، ثم انقر فوق زر تخزين البيانات الحالية في الشريط العلوي في نافذة برنامج LPS واحفظ البيانات مرة أخرى. افتح برنامج LPS.
انتقل إلى ملف وحدد تجربة جديدة، ثم ارجع إلى الملف وانقر على نموذج جديد. قم بإنشاء مخطط نقطي مع وقت الرحلة على المحور X والانقراض على المحور Y. قم بإنشاء مخطط نقطي آخر مع وقت الرحلة على المحور X والأحمر على المحور Y.
تأكد من التحقق من تمكين الليزر لتنشيط ليزر 488 و 561 نانومتر. ضع أنبوب عينة التحكم على منفذ العينة، ثم انقر فوق اكتساب داخل مربع الحوار الحصول والاستغناء. عند المطالبة ، تأكد من حفظ الملف.
بمجرد قياس عدد كاف من الديدان للتمييز بين المجموعات ، حدد إجهاض في الرسم البياني النقطي الذي يوضح وقت الرحلة مقابل الانقراض. ارسم بوابة حول المنطقة التي تمثل السكان البالغين. ثم انتقل إلى العرض ، وانقر فوق التسلسل الهرمي للبوابات وتحقق من أن بوابات الفلورسنت مدرجة بشكل صحيح ضمن بوابة السكان البالغين.
في وقت الرحلة مقابل مخطط النقطة الحمراء ، قم بإنشاء بوابات حول مناطق القيمة الحمراء العالية والمنخفضة لتسليط الضوء على المناطق ذات الأهمية التي تظهر استعمار الميكروبيوم في الديدان البالغة. بمجرد تحسين الإعدادات ، انتقل إلى ملف وانقر فوق حفظ التجربة ، ثم انقر فوق ملف وحدد حفظ العينة. لتحميل جهاز التجميع ، حدد لوحة التحميل A للسماح لمرحلة التجميع بالانتقال إلى وضع مهيأ لتحميل إما أنبوب تجميع أو لوحة بئر 96.
للاستغناء عن لوحة بئر 96 ، انتقل إلى قسم الإعداد وحدد الألواح ، ثم انقر فوق الألواح المعايرة واختر 96 لوحة بئر. بعد ذلك ، حدد الآبار التي سيتم فرز الديدان إليها وأدخل عدد الكائنات المراد فرزها في كل بئر. تأكد من تحديد المناطق المسورة ذات الأهمية أيضا.
إذا كانت هناك مناطق متعددة مسورة يتم فرزها في نفس اللوحة ، فتأكد من تحديد المربع المحدد ببوابة كل بئر. انقر فوق موافق لحفظ التغييرات. بعد فرز الأرقام وتعيين المواقع ، قم بتحميل العينة على منفذ العينة وانقر على أزرار لوحة التعبئة من مربع حوار الاكتساب والتوزيع لبدء التوزيع في لوحة بئر 96.
لوحظت قيم امتداد ووقت طيران أعلى عند البالغين مقارنة باليرقات. سيطرت مراحل L1 و L2 على ذرية البالغين من عمر يومين ، بينما وصلت معظم النسل من البالغين بعمر ثلاثة أيام إلى مرحلتي L3 و L4. عندما نمت على الإشريكية القولونية ، زاد وقت الرحلة وقيم التمديد في اليوم الثالث مقارنة باليوم الثاني.
عندما نمت على ochrobactrum ، BH ثلاثة والثقافات المختلطة ، أظهرت ادعاءات cenor abdidas اختلافات في وقت الرحلة وقيم التمديد. لوحظت زيادة استعمار ochrobactrum BH3 في الحالة المختلطة مقارنة ب ochrobactrum BH3 وحده. في المقابل ، تشير القيم الفلورية الخضراء إلى انخفاض استعمار OP50 في الحالة المختلطة مقارنة ب OP50 وحده.
تميل الديدان بشدة نحو المحور Y ، مما يشير إلى أن استعمار OP50 منخفض في معظم الديدان ، في حين أن مستويات ochrobactrum ، استعمار BH3 موزعة بالتساوي في السكان. كما لوحظت العلاقة بين ochrobactrum ومستويات استعمار BH3 وتطور المضيف مثل كثافة الجسم والاختلافات في أنماط التكاثر. أظهر البالغون البالغون من العمر ثلاثة أيام الذين نمت على مزيج عضوين ، الميكروبيوم مجموعة واسعة من كثافة RFP ، مما يشير إلى اختلافات فردية في استعمار ochrobactrum داخل المجموعة.
يتم عرض صور RFP للآبار التي تحتوي على 15 دودة مصنفة وفردية من بوابات RFP العالية والمنخفضة. الشيء الأكثر أهمية هو تذكر استخدام عناصر التحكم المناسبة لجميع الخطوات للتأكد من أن البروتوكول والجهاز يعملان بشكل صحيح. في الوقت الفعلي ، يمكن استخدام ذات الميزات المحددة لعزل السلالات من برك الطفرة المضيفة أو الميكروبية لتحديد الجينات التي تنظم تفاعلات ما بعد الميكروب.
يمكن أيضا استخدام المعزولة لتحليل المفردة أو المجمعات الظاهرية المخصبة القائمة على المصب ، مثل RNA-seq أو ما شابه. حقا ، الفرص لا حصر لها حقا.
