El microbioma intestinal desempeña un papel importante en la configuración de la fisiología del huésped. Este protocolo, en particular, permite una evaluación de alto rendimiento de los niveles de colonización de microbios intestinales fluorescentes en animales celulares únicos a gran escala. Una de las principales ventajas de este método es la capacidad de monitorizar el microbioma intestinal de los animales vivos en tiempo real, lo que permite identificar y correlacionar cualquier cambio con la fisiología del huésped.
La demostración del procedimiento estará a cargo de Dana Blackburn, una investigadora asociada de mi laboratorio. Comience lavando los gusanos del césped bacteriano con uno o dos mililitros de M9-TX. Transfiera los gusanos a una placa esterilizada de dos mililitros de 96 pocillos de profundidad.
Granularlos a 300 G durante un minuto y eliminar el líquido con un colector de aspiración. Con una pipeta multicanal de 1,2 mililitros, añada 1,8 mililitros de M9-TX a cada pocillo de la placa de pocillos profundos mezclada pipeteando un par de veces y centrifugar a 300 G durante un minuto. Después del lavado final, lleve el volumen de cada pocillo a 100 microlitros, utilizando el colector de aspiración.
Agregue 100 microlitros de levamisol de 10 milimolares y M9-T a cada pocillo, y deje que las lombrices se paralicen durante cinco minutos. Luego agregue una solución de lejía al 4% a cada pocillo durante dos minutos para reducir los grumos bacterianos. Después del tratamiento con lejía, agregue M9-TX en cada pocillo del plato para lavar los gusanos.
Centrifugar la placa y aspirar hasta un volumen final de 100 microlitros después del segundo lavado. Transfiera los gusanos a una placa de fondo plano de 96 pocillos, que contenga 150 microlitros de 10 milimoles de levamisol y M9-TX. Mantenga la densidad de lombrices entre 50 y 100 lombrices por pocillo y divida las lombrices en varios pocillos si la población está demasiado abarrotada.
Encienda el compresor de aire, la computadora y el instrumento LPS. Revise y vacíe el depósito de residuos. Revise y rellene la funda y los tanques de agua si el volumen es bajo.
Asegúrese de que el conjunto de núcleo óptico y fluídico de 250 micrómetros esté en su lugar. Conecte y encienda el muestreador automático. Abra el software del instrumento del muestreador automático para abrir el muestreador automático y el software LPS.
En la ventana del software LPS, vaya a archivo y haga clic en nuevo experimento y, a continuación, seleccione archivo de nuevo y haga clic en nueva comprobación de muestra. Habilite los láseres para encender láseres de 488 y 561 nanómetros si aún no se ha hecho. Ahora cree plantillas para diagramas de puntos de adquisición, utilizando el tiempo de vuelo, la extinción y los canales fluorescentes en la ventana del software LPS.
Haga clic con el botón derecho en el cuerpo de un gráfico para modificar la escala. A continuación, cargue las muestras de control. En la ventana del muestreador automático, seleccione prime, vaya al archivo, haga clic en abrir script para seleccionar el script integrado correcto y haga clic en Aceptar.
Vaya a la plantilla de placa en el menú del software de muestreo para seleccionar los pocillos deseados para el análisis. Después de cargar y asegurar la placa en la platina del muestreador automático, presione ejecutar la placa en la ventana del muestreador automático y guarde el archivo cuando se le solicite, luego haga clic en el botón almacenar datos actuales en la cinta superior de la ventana del software LPS y guarde los datos nuevamente. Abra el software LPS.
Vaya al archivo y seleccione nuevo experimento y, a continuación, vuelva al archivo y haga clic en nuevo ejemplo. Crea un diagrama de puntos con el tiempo de vuelo en el eje X y la extinción en el eje Y. Crea otro diagrama de puntos con el tiempo de vuelo en el eje X y rojo en el eje Y.
Asegúrese de marcar la habilitación de láseres para activar los láseres de 488 y 561 nanómetros. Coloque el tubo de muestra de control en el puerto de muestra y, a continuación, haga clic en adquirir en el cuadro de diálogo de adquisición y dispensación. Cuando se le solicite, asegúrese de guardar el archivo.
Una vez que se hayan medido suficientes gusanos para diferenciar las poblaciones, seleccione abortar en el diagrama de puntos que muestra el tiempo de vuelo frente al de extinción. Dibuja una puerta alrededor del área que represente a la población adulta. A continuación, navegue hasta la vista, haga clic en jerarquía de compuertas y compruebe que las puertas fluorescentes se enumeran correctamente en la puerta de población adulta.
En el diagrama de tiempo de vuelo frente al gráfico de puntos rojos, cree puertas alrededor de las áreas de valores rojos altos y bajos para resaltar las regiones de interés que muestran la colonización del microbioma en gusanos adultos. Una vez optimizada la configuración, vaya al archivo y haga clic en guardar experimento, luego haga clic en archivo y seleccione guardar muestra. Para cargar el aparato de recolección, seleccione la placa de carga A para permitir que la etapa de recolección se mueva a una posición preparada para cargar un tubo de recolección o una placa de 96 pocillos.
Para dispensar a una placa de 96 pocillos, vaya a la sección de configuración y seleccione placas, luego haga clic en placas calibradas y elija placa de 96 pocillos. A continuación, seleccione los pozos en los que se ordenarán los gusanos e introduzca el número de objetos que se clasificarán en cada pozo. Asegúrese de especificar también las regiones cerradas de interés.
Si hay varias regiones cerradas que se clasifican en la misma placa, asegúrese de marcar la casilla marcada como puerta en cada pozo. Haga clic en Aceptar para guardar los cambios. Después de clasificar los números y asignar las ubicaciones, cargue la muestra en el puerto de muestra y haga clic en los botones de la placa de llenado del cuadro de diálogo de adquisición y dispensación para iniciar la dispensación en una placa de 96 pocillos.
Se observan valores más altos de extensión y tiempo de vuelo en adultos en comparación con las larvas. Las progenies de adultos de dos días de edad fueron dominadas por las etapas L1 y L2, mientras que la mayoría de la progenie de adultos de tres días de edad alcanzaron las etapas L3 y L4. Cuando se cultivó en E. coli, el tiempo de vuelo y los valores de extensión aumentaron en el tercer día en comparación con el segundo día.
Cuando se cultivaron en ochrobactrum, BH tres y cultivos mixtos, cenor abdidas allegands mostraron diferencias en los valores de tiempo de vuelo y extensión. Se observó un aumento de la colonización por ochrobactrum BH3 en la condición mixta que en el ochrobactrum BH3 solo. Por el contrario, los valores verdes y fluorescentes indicaron una menor colonización de OP50 en la condición mixta que en OP50 sola.
Los gusanos están fuertemente sesgados hacia el eje Y, lo que sugiere que la colonización por OP50 es baja en la mayoría de los gusanos, mientras que los niveles de colonización por ocropactus y BH3 se distribuyen uniformemente en la población. También se observó la relación entre el ocropacto, los niveles de colonización de BH3 y el desarrollo del hospedador, como la densidad corporal y las diferencias en los patrones de reproducción. Los adultos de tres días de edad cultivados en la mezcla de dos miembros, el microbioma exhibió un amplio rango de intensidad de RFP, lo que indica variaciones individuales en la colonización de ochrobactrum dentro del grupo.
Se muestran imágenes RFP de los pozos que contienen 15 gusanos clasificados e individuales de las puertas RFP altas y bajas. Lo más importante es recordar utilizar los controles adecuados para todos los pasos para garantizar que el protocolo y la máquina funcionen correctamente. En tiempo real, los animales con características específicas se pueden utilizar para aislar cepas de grupos de mutantes microbianos o huéspedes para identificar genes que regulan las interacciones posteriores a los microbios.
Los animales aislados también se pueden utilizar para análisis posteriores basados en grupos fenotípicos enriquecidos o de un solo animal, como RNA-seq o similares. Realmente, las oportunidades son realmente infinitas.
