Микробиом кишечника играет важную роль в формировании физиологии хозяина. Этот протокол, в частности, позволяет с высокой пропускной способностью оценивать уровни колонизации флуоресцентных кишечных микробов у одиночных клеточных животных в больших масштабах. Одним из основных преимуществ этого метода является возможность мониторинга микробиома кишечника живых животных в режиме реального времени, что позволяет идентифицировать и соотносить любые изменения с физиологией хозяина.
Процедуру будет демонстрировать Дана Блэкберн, научный сотрудник моей лаборатории. Начните с смывания червей с бактериального газона одним-двумя миллилитрами M9-TX. Переложите червей в стерилизованную двухмиллилитровую тарелку глубиной 96 лунок.
Гранулируйте их при 300 G в течение одной минуты и удалите жидкость с помощью аспирационного коллектора. Используя многоканальную пипетку объемом 1,2 миллилитра, добавьте 1,8 миллилитра M9-TX в каждую лунку глубокой лунки, перемешайте пипеткой пару раз и центрифугируйте при 300 G в течение одной минуты. После окончательной промывки доведите объем в каждой лунке до 100 микролитров, используя аспирационный коллектор.
Добавьте в каждую лунку по 100 микролитров 10 миллимолярного левамизола и М9-Т и дайте червям парализоваться в течение пяти минут. Затем добавьте 4%-ный раствор отбеливателя в каждую лунку на две минуты, чтобы уменьшить скопление бактерий. После обработки отбеливателем добавьте M9-TX в каждое углубление пластины, чтобы промыть червей.
Центрифугируйте пластину и аспирируйте до конечного объема 100 микролитров после второй промывки. Переложите червей на плоскодонную 96-луночную пластину, содержащую 150 микролитров 10 миллимоль левамизола и M9-TX. Поддерживайте плотность червей на уровне от 50 до 100 червей на лунку и разделяйте червей на несколько лунок, если популяция слишком скучена.
Включите воздушный компрессор, компьютер и прибор LPS. Проверьте и опорожните бак для отходов. Проверьте и заправьте чехол и резервуары для воды, если объем недостаточен.
Убедитесь, что 250-микрометровый жидкостный и оптический сердечник на месте. Подключите и включите автосамплер. Откройте программное обеспечение автосамплера, чтобы открыть автосамплер и программное обеспечение LPS.
В окне программного обеспечения LPS перейдите в файл и нажмите кнопку «Новый эксперимент», затем снова выберите файл и нажмите кнопку «Новая проверка образца». Включите лазеры с длиной волны 488 и 561 нм, если это еще не сделано. Теперь создайте шаблоны для точечных диаграмм захвата, используя каналы времени пролета, экстинкции и флуоресцентные каналы в окне программного обеспечения LPS.
Щелкните правой кнопкой мыши в теле диаграммы, чтобы изменить масштабирование. Далее загружают контрольные образцы. В окне автосамплера выбираем prime, переходим к файлу, нажимаем открыть скрипт, чтобы выбрать нужный встроенный скрипт и нажимаем ОК.
Перейдите к шаблону пластины в меню программного обеспечения пробоотборника, чтобы выбрать нужные лунки для анализа. После загрузки и закрепления пластины на столике автосамплера нажмите кнопку запуска пластины в окне автосамплера и сохраните файл при появлении запроса, затем нажмите кнопку сохранения текущих данных на верхней ленте в окне программного обеспечения LPS и снова сохраните данные. Откройте программное обеспечение LPS.
Перейдите к файлу и выберите новый эксперимент, затем вернитесь к файлу и нажмите кнопку Создать образец. Постройте точечную диаграмму со временем пролета по оси X и затуханием по оси Y. Создайте еще одну точечную диаграмму со временем полета на оси X и красным цветом на оси Y.
Обязательно установите флажок включения лазеров для активации лазеров 488 и 561 нм. Поместите пробирку с контрольным образцом на отверстие для отбора проб, затем нажмите кнопку «Получить» в диалоговом окне «Получение и дозирование». При появлении запроса обязательно сохраните файл.
После того, как будет измерено достаточное количество червей для дифференциации популяций, выберите abort на точечной диаграмме, показывающей время полета и вымирания. Нарисуйте ворота вокруг области, представляющей взрослое население. Затем перейдите к просмотру, щелкните иерархию стробирования и убедитесь, что флуоресцентные вентили правильно перечислены под гейтом взрослой популяции.
На графике «Время полета и красная точка» создайте ворота вокруг областей с высоким и низким значением красного цвета, чтобы выделить интересующие области, показывающие колонизацию микробиома у взрослых червей. После оптимизации настроек перейдите к файлу и нажмите кнопку Сохранить эксперимент, затем нажмите кнопку Файл и выберите Сохранить образец. Чтобы загрузить сборное устройство, выберите загрузочную пластину A, чтобы позволить ступени сбора переместиться в положение, подготовленное для загрузки либо сборной трубы, либо 96-луночной пластины.
Для дозирования на 96-луночный планшет перейдите в раздел настройки и выберите пластины, затем нажмите на калиброванные планшеты и выберите 96-луночный планшет. Далее выбираем лунки, в которые будут сортироваться черви, и вводим количество объектов, которые нужно отсортировать в каждую лунку. Не забудьте также указать интересующие вас закрытые регионы.
Если в одну и ту же пластину сортировано несколько закрытых областей, обязательно установите флажок с надписью «Затвор» в каждом колодце. Нажмите кнопку ОК, чтобы сохранить изменения. После сортировки номеров и назначения местоположений загрузите пробу в отверстие для отбора проб и нажмите кнопки заполнения пластины в диалоговом окне получения и дозирования, чтобы начать дозирование в планшет на 96 лунок.
Более высокие значения удлинения и времени лёта наблюдаются у взрослых особей по сравнению с личинками. У потомства от двухдневных взрослых особей преобладали стадии L1 и L2, в то время как большинство потомства от трехдневных взрослых достигли стадий L3 и L4. При выращивании на E.coli время полета и удлинение увеличивались на третий день по сравнению со вторым.
При выращивании на охробактруме, BH 3 и смешанных культурах cenor abdidas allegands показали различия во времени полета и значениях удлинения. Повышенная колонизация ochrobactrum BH3 наблюдалась в смешанном состоянии, чем при использовании только ochrobactrum BH3. Напротив, зеленые флуоресцентные значения указывали на более низкую колонизацию OP50 в смешанном состоянии, чем только в OP50.
Черви сильно перекошены к оси Y, что позволяет предположить, что колонизация OP50 у большинства червей низкая, в то время как уровни колонизации ochrobactrum, BH3 равномерно распределены в популяции. Также наблюдалась взаимосвязь между охробактрумом, уровнями колонизации BH3 и развитием хозяина, таким как плотность тела и различия в моделях размножения. У трехдневных взрослых особей, выращенных на смеси из двух членов, микробиом демонстрировал широкий диапазон интенсивности RFP, что указывает на индивидуальные различия в колонизации охробактрума в группе.
Показаны RFP-изображения скважин, содержащих 15 отсортированных и отдельных шнеков из верхних и низких затворов RFP. Самое главное — не забывать использовать соответствующие элементы управления для всех шагов, чтобы убедиться, что протокол и машина работают правильно. В режиме реального времени животные со специфическими особенностями могут быть использованы для выделения штаммов из пулов хозяев или микробных мутантов для выявления генов, которые регулируют постмикробные взаимодействия.
Изолированные животные также могут быть использованы для анализа одного животного или обогащенного фенотипического пула на основе последующих потоков, таких как РНК-секвенирование и т.. Действительно, возможности поистине безграничны.
