يسمح لنا تحليل ألياف الحمض النووي بفهم كيفية تأثير المواد النانوية على الحمض النووي على المستوى الجزيئي الواحد. وستمكن هذه المعلومات من تطوير استراتيجيات من شأنها تقليل السمية النانوية. تسمح لنا هذه التقنية بفهم ديناميكيات الحمض النووي وكيف تتأثر عندما تتعرض الخلايا أو الأنسجة لعوامل ضارة للحمض النووي ، سواء كانت خارجية أو داخلية ، ويمكننا النظر في تكرار الحمض النووي ، وإصلاح الحمض النووي ، وديناميكيات الكروماتين ستساعد دراسة ديناميكيات تكرار الحمض النووي وآلية الإصلاح في تطوير استراتيجيات من شأنها تحسين فعالية المواد العلاجية أو تقليل التأثير غير المستهدف للطب النانوي.
ما نريد حقا أن يعرفه الناس عن هذه التقنية هو الأشياء المختلفة التي يمكننا أو يمكن لشخص واحد القيام بها. الأول هو فهم كيف يمكن لعوامل العلاج الكيميائي الجديدة أن تؤثر على صحة الخلية ، لمعرفة ما إذا كان يمكنك قتلها بشكل أسرع أو أكثر كفاءة. الشيء التالي هو التفكير عندما تضيف وكيلا ، دعنا نقول أنه عامل علاجي أو صيدلاني جديد ، فأنت تريد أن تعرف ما إذا كان سيؤذي شخصا قبل أن تعطيه له.
لذلك ، يمكنك فقط إعطاء العامل للخلايا أو أنظمة النماذج ومعرفة ما إذا كان يؤذي الخلايا أو نظام النموذج ، وإذا كان الأمر كذلك ، فكم؟ الشيء التالي هو أن ننظر إلى نوع ما ، نحن نطور كل هذه الأدوية النانوية الجديدة ونريد التأكد من أن تلك الأدوية النانوية لا تؤذي الشخص أو المكان الذي نحقن فيه الطب النانوي. آخر شيء هو أنك تريد أحيانا معرفة كيفية تأثير البروتين على تضاعف الحمض النووي (DNA) أو إصلاح الحمض النووي أو ديناميكيات الكروماتين، ويمكننا استخدام هذه التقنية لنتمكن من القيام بذلك.
هذا هو شيرالي باتيل ، طالب ماجستير في أبحاث التكنولوجيا الحيوية الطبية في مختبري ، سيوضح الإجراء. ابدأ إعداد مقايسة الألياف عن طريق إزالة الوسط من 75٪ إلى 80٪ خلايا البلاعم RAW 264.5 المتقاربة وتقسيمها إلى نصفين. احتفظ بنصف نبض الكلورو يودودوكيوريدين أو احتياطي الكلورو يودودوكيوريدين وأضف خمسة ميكرولترات من يودودوكسي يوريدين إلى النصف الآخر ، مما يجعل 50 ميكرومول هو التركيز النهائي.
بعد الخلط ، أضف الوسط المحتوي على اليودودوكسييوريدين إلى الأطباق وضع الخلايا في الحاضنة لمدة 20 دقيقة. قم بتسخين وسط احتياطي الكلورو-يودودوكيوريدين مسبقا عند 37 درجة مئوية وأضف كلورو-يودوديوكيوريدين إلى هذا الوسط قبل نبض الكلورو-يودودوكيوريدين. بعد 20 دقيقة ، قم بنضح خليط اليودودوكيوريدين المتوسط من دورق خلية البلاعم RAW 264.5.
اغسل الخلايا برفق باستخدام 500 ميكرولتر من PBS ، مع وجود 7.4 درجة حموضة ، وقم بتدوير اللوحة قبل التخلص من PBS. عالج الخلايا بتركيزات مختلفة من جزيئات أكسيد الجرافين النانوية في 500 ميكرولتر من الوسط واحتضانها لمدة 30 دقيقة. بعد الحضانة ، قم بنضح خليط العلاج المتوسط واغسل الخلايا برفق باستخدام 500 ميكرولتر من PBS عن طريق تدوير اللوحة برفق قبل التخلص من PBS.
بعد ذلك ، أضف خمسة ميكرولترات من كلورو يودودوكيوريدين إلى وسط احتياطي كلورو يودودوكيوريدين ، وقم بتغطية الخلايا بوسط احتياطي كلورو يودودوكسييوريدين. لنبض الكلورو يودودوكيوريدين ، ضع الخلايا في الحاضنة لمدة 20 دقيقة. بعد غسل برنامج تلفزيوني ، اكشط الخلايا لمدة ثلاث إلى أربع دقائق ، ثم أضف خمسة ملليلتر من الوسط إلى اللوحة واجمع الخلايا.
أجهزة الطرد المركزي الخلايا التي تم جمعها في 264G لمدة أربع دقائق. قم بإزالة المادة الطافية وإعادة تعليق الخلايا في ملليلتر واحد من برنامج تلفزيوني بارد. لتحضير ألياف الحمض النووي ، قم بتسمية الشرائح الزجاجية بالحالة التجريبية والتاريخ ، باستخدام قلم رصاص.
نضح ميكرولتر من الخلايا في ماصة وأمسك الماصة بزاوية 45 درجة تقريبا. ثم ضع الماصة حوالي سنتيمتر واحد أسفل ملصق الشريحة وحرك الماصة أفقيا نحو ملصق الشريحة مع إطلاق بطيء لمحلول الخلية. بمجرد أن يتبخر المحلول ويبدو لزجا ولزجا ، قم بتراكب كل سطر من الخلايا ب 15 ميكرولترا من محلول التحلل دون ترك طرف الماصة يلمس الشريحة.
ثم قم بإمالة الشريحة بزاوية 25 درجة واترك الحمض النووي ينتشر في الهواء يجف لمدة لا تقل عن أربع ساعات. في اليوم الأول ، قم بإصلاح ألياف الحمض النووي عن طريق غمر الشرائح في حمض الخليك الميثانول لمدة دقيقتين. في اليوم الثاني ، ضع الشرائح في حامل منزلق زجاجي واحتضنها عند 20 درجة مئوية لمدة لا تقل عن 24 ساعة.
لتشويه الحمض النووي ، قم بإعداد غرفة مرطبة ووضع الشرائح بعناية في جرة كوبلين تحتوي على ماء منزوع الأيونات أو DI ، مع التأكد من أن الأسطح المطلية لا تلمس جدران الجرة. بعد 20 ثانية من الحضانة ، اسكب الماء. أضف 2.5 حمض الهيدروكلوريك المولي إلى جرة كوبلين ، التي تغطي جميع الشرائح.
بعد 80 دقيقة من الحضانة ، اغسلي غسلة واحدة مع PBS بالإضافة إلى 0.1٪ Tween ، متبوعة بغسلتين مع PBS لمدة ثلاث دقائق لكل منهما في درجة حرارة الغرفة. للتلطيخ المناعي ، ضع الشرائح في الغرفة المرطبة وقم بحظرها باستخدام 5٪ من ألبومين مصل الأبقار ، أو BSA ، في برنامج تلفزيوني لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. ثم قم بتغطية الشرائح بورقة بلاستيكية شفافة.
بعد الحجب ، قم بإزالة زلة الغطاء وإضافة 100 ميكرولتر من محلول الأجسام المضادة الأساسي على طول الشريحة. أضف قسيمة غطاء بلاستيكي جديدة وانتظر لمدة ساعتين. بعد ساعتين ، قم بإزالة محلول الأجسام المضادة وشطف الشرائح في جرة كوبلين مملوءة ب PBS مرتين.
قم بحظر الشرائح مرة أخرى بإضافة 200 ميكرولتر من 5٪ BSA على طول الشريحة. أضف زلة غطاء بلاستيكي واحتضانها لمدة 15 دقيقة. بعد خلع زلة الغطاء وإزالة BSA الزائدة باستخدام منشفة ورقية ، أضف 100 ميكرولتر من محلول الأجسام المضادة الثانوي على طول الشريحة وضع قسيمة غطاء بلاستيكي جديدة.
بعد ساعة واحدة ، قم بإزالة قسيمة الغطاء ، وقم بإزالة BSA الزائد على منشفة ورقية ، واغسل الشرائح مرتين في برنامج تلفزيوني. أضف 100 ميكرولتر من محلول الأجسام المضادة الثلاثية على طول الشريحة وضع قسيمة غطاء بلاستيكي جديدة. مرة أخرى ، أضف 200 ميكرولتر من 5٪ BSA على طول كل شريحة واحتضانها لمدة 15 دقيقة.
بعد ثلاث غسلات باستخدام برنامج تلفزيوني ، قم بإزالة PBS الزائد واتركه يجف تماما. بمجرد أن يجف ، أضف وسيط التثبيت على الشريحة وضع زلات الغطاء الزجاجي دون السماح بتكوين الفقاعة. تصور ألياف الحمض النووي المناعية باستخدام مجهر مناعي مزود بكاميرا وهدف 60x ومجموعات مرشحات مناسبة للكشف عن أصباغ Alexa Fluor 488 و 594.
تم تحديد التباين في أنماط النسخ المتماثل بعد التعرض طويل الأمد للمواد النانوية من خلال مقارنة أنماط النسخ المتماثل للخلايا قبل وبعد التعرض للجسيمات النانوية لليودوديوكسييوريدين والكلورو يودوكسييوريدين. كشفت صور تحليل وتفسير ألياف الحمض النووي عن نمط للتحكم في خلايا البلاعم والحمض النووي للبلاعم المعالج بأكسيد الجرافين والجسيمات النانوية. لوحظ الاختلاف في نمط وسيطة النسخ المتماثل ، مما يدل على زيادة في الأصول الجديدة في منطقة مختلفة من نفس الحالة.
تم الحصول على بيانات الألياف القاطعة عن طريق تقسيم المساحة الإجمالية للشريحة إلى خمس إلى ست مناطق والتقاط صور متعددة من كل منطقة. كان اختيار حوالي 500 وسيط من شرائح أو ظروف متعددة مثاليا للتحقيق في الاختلاف في ديناميكيات تكرار الحمض النووي. أشار التحليل أيضا إلى زيادة في المسارات الحمراء فقط ، مما يشير إلى التحديدات وانخفاض في الأصول التي تم إطلاقها حديثا في الخلايا المعالجة بأكسيد الجرافين مقارنة بالسيطرة.
تعتمد جودة انتشار ألياف الحمض النووي على مدى انتشار الألياف بعضها عن بعض وعدم تداخلها. بمجرد انتشار الألياف وتلطيخ IdU و CldU ، من المهم للغاية العثور على ألياف الحمض النووي. أحد الأشياء التي يمكنك القيام بها بعد تكوين ألياف الحمض النووي هو ، أولا ، يمكنك إلقاء نظرة على كيفية تأثر ديناميكيات التضاعف.
ثانيا، يمكنك النظر إلى مكان تلف الحمض النووي بالنسبة إلى مسارات تضاعف الحمض النووي. والشيء الأخير هو إذا كنت تستخدم مجسات FISH ، يمكنك في الواقع النظر إلى مناطق معينة وكيف تتأثر بتلف الحمض النووي. تمهد هذه التقنية الطريق لتطوير أدوية العلاج الكيميائي وتصميم الأدوية وفهم كيفية تأثر تكرار الحمض النووي بأنواع مختلفة من البروتينات.
