ويدعم هذا العمل في جزء من الأموال التي تقدمها جامعة نورث كارولينا في شارلوت، اتشوفيا الأساس صندوق للتميز أعضاء هيئة التدريس، ومنحة من NIGMS (R15GM101571).

1. LSE إعداد <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم حقن الضفادع الإناث (القيطم المورق) مرتين لجمع البيض. الحقنة الأولى (فتيلة) هو 100 U PMSG (مصل الفرس الحامل موجهة الغدد التناسلية) في الضفدع. يجب أن تستعد الضفادع على الأقل قبل يومين من البيض حمل مد ومعبي الضفادع صالحة للاستعمال لمدة تصل إلى أسبوعين. لرئيس الضفادع، وضخ PMSG تحت الجلد في الحويصلات الليمفاوية الظهرية باستخدام حقنة 3 مل و 27 إبرة G. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> للحث على وضع البيض، وضخ 500 U قوات حرس السواحل الهايتية (موجهة للغدد التناسلية المشيمية البشرية) في الضفدع تحت الجلد معبي في الحويصلات الليمفاوية باستخدام إبرة الظهرية G 27. احتضان الضفادع في حقن الدلاء منفصلة تحتوي على 2 لتر من محلول 1X مارك لتعديل رينغر (MMR). تسمح الضفادع 14-20 ساعة لوضع البيض قبل المجموعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الضفادع من الدلاء وتصب قبالة حل MMR حتى لا يتبقى حوالي 100 مل. الحصول على البيض من الدلاء عن طريق نقل البيض إلى كوب 250 مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> البيض Dejelly بإضافة 100 مل من 2٪ السيستين (ضبطالرقم الهيدروجيني إلى 7.8 مع KOH M 10). دوامة بلطف البيض مع الماصة باستور الزجاج المقلوب (0.7 سم في القطر) تقريبا كل ثانية 30. صب واستبدالها مع السيستين الطازجة مرتين خلال الحضانة. عملية dejellying اكتمال في حوالي 5-15 دقيقة عندما تشكل طبقة البيض أكثر مكثف في الجزء السفلي من الكأس. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجاهل حل السيستين ويغسل ثلاث مرات مع البيض MMR 0.25x. دوامة البيض في الحل من قبل الماصة الزجاج. ويتم تحديد &quot;سيئة&quot; البيض عن طريق التفتيش البصري هي بسيطة و&quot;منتفخ&quot; الأبيض في المظهر. فإن &quot;سيئة&quot; البيض تتراكم في مركز الدورق بعد دوامات. إزالة &quot;سيئة&quot; من قبل البيض الماصة باستور. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل البيض مع البيض يزيس العازلة (ELB) ثلاث مرات. إزالة أي &quot;سيئة&quot; من قبل البيض إضافية الماصة باستور. صب البيض في أنبوب فالكون 14 مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تدور في أنبوب فالكون لمدة 55 ثانية في 188 XG (1،100 دورة في الدقيقة) باستخدام IEC CL2 السريرية فوق المنضدة الطرد المركزي مع الدوار الدلو المتأرجح ضغط البيض. إزالة الزائدة من المخزن المؤقتأعلى طبقة البيض. إضافة 0.5 ميكرولتر من أبروتينين الأسهم Leupeptin / و 0.5 ميكرولتر من الأسهم في مثبط حركة الخلايا B مل من البيض المضغوط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي في 16500 XG البيض (10،000 دورة في الدقيقة) لمدة 15 دقيقة في 4 درجات مئوية باستخدام أجهزة الطرد المركزي بالإضافة إلى الكتب التي RC6 اسرع مع HB6 الدوار الدلو المتأرجح. بعد الطرد المركزي، والبيض هي مجزأة إلى ثلاث طبقات في الأنبوب: الدهون، واستخراج، وصفار / الصباغ من الأعلى إلى الأسفل، على التوالي. ثقب الجانب من الأنبوب الصقر في الجزء السفلي من طبقة استخراج الأوسط مع إبرة G 21. إزالة بعناية الإبرة التي قد عرقلت من إبرة ثقب من البلاستيك. اضافة الى وجود إبرة جديدة G 21 تعلق على حقنة 1 مل في موقع ثقب لجمع استخراج. نضح ببطء في استخراج حقنة لتجنب فقاعات الهواء والتلوث مع الدهون وصفار / الصباغ طبقات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع مقتطفات المبردة إلى 1.5 مل أنبوب microcentrifuge. لكل ملليلتر من استخراج البيض، إضافة الأسهم الكيميائية التالية في حلول للتركيز النهائي dicated (كما هو موضح بين قوسين): (1) 10 سيكلوهيكسيميد ميكرولتر (100 ميكروغرام / مل)؛ (2) 1 ميكرولتر أبروتينين / Leupeptin (10 ميكروغرام / مل لكل منهما)؛ (3) 1 ميكرولتر مثبط حركة الخلايا B (5 ميكروغرام / مل )؛ (4) 1 Dithiothreitol ميكرولتر (1 ملم)، و (5) 0.33 نوكودازول ميكرولتر (3 ميكروغرام / مل). عكس البيضة استخراج ما لا يقل عن 10 مرات بلطف. هذا هو LSE، الذي يجب أن يتم الطازجة واستخدامها في غضون 4 ساعة. للخطر نوعية LSE بعد 4 ساعات أو تجميد ذوبان الجليد. </li></ol> 2. علاج الحيوانات المنوية مع النهج الكروماتين DNA الضارة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد الحيوانات المنوية طبيعية لونين وفقا لطريقة الموصوفة سابقا 13. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد MMS المعالجة لونين الحيوانات المنوية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعادة تعليق العادية لونين الحيوانات المنوية في 0.5 مل العازلة X. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة ~ 5،5 ميكرولتر من MMS (9.1 M متوفرة للبيع) إلى 500 ميكرولتر معلق لونين إلى تركيز النهائي من 100 ملم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان لونين الحيوانات المنوية في أنبوب microcentrifuge في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة مع التناوب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تدور مأنبوب icrocentrifuge في حدود 686 XG (2،100 دورة في الدقيقة) لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة باستخدام أجهزة الطرد المركزي CL2 IEC السريرية مع الدوار الدلو المتأرجح ومحولات أنبوب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجاهل طاف بيليه و resuspend في 0.5 مل من الاحتياطي X زائد BSA (3٪)، DTT (0.1 مم) وأبروتينين / Leupeptin (10 ميكروغرام / مل لكل منهما). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر الخطوات (4) و (5) مرتين لغسل الحيوانات المنوية لونين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد تركيز الحيوانات المنوية من لونين مع عدادة الكريات وتمييع الحيوانات المنوية إلى 100،000 / ميكروليتر. توفير 5 ميكرولتر مأخوذة في -80 ° C الفريزر لاستخدامها مرة أخرى. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد UV المعالجة لونين الحيوانات المنوية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة المبلغ المطلوب (على سبيل المثال 10 ميكرولتر) من لونين الحيوانات المنوية طبيعية على سطح قطعة من Parafilm. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع Parafilm إلى crosslinker UV. تعيين المعلمة المطلوب الطاقة، اعتمادا على تجربتك، والبدء في تلف الحيوانات المنوية لونين عن طريق ضوء الأشعة فوق البنفسجية. على سبيل المثال، فإنه يأخذ حوالي 21 ثانية للوصول إلى 1000 ج / م 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد UV irraوينبغي أن يضاف diation، لونين الحيوانات المنوية المعالجة UV لمقتطفات البيض على الفور. </li></ol></li></ol> 3. إعداد الهيكل الأضرار-DNA محاكاة (AT70) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 2 حل أليغنوكليوتيد] الاصطناعية بولي (DA) 70 (تسمى A70) وبولي-70 (DT) (تسمى T70) في الماء إلى تركيز من 2 ميكروغرام / ميكرولتر، على التوالي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 100 ميكرولتر من A70 و 100 ميكرولتر من T70 إلى واحد 1.5 مل أنبوب microcentrifuge. تغلي مختلطة حل الاصطناعية بنسبة ضئيلة لمدة 5 دقائق في 95 ° C في heatblock. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تأخذ حمام كتلة جافة من أصل (مع أنبوب يحتوي على خليط AT في ذلك)، والسماح لها يبرد إلى درجة حرارة الغرفة على مقعد المختبر. هذا التعديل درجة حرارة 45-60 يستغرق حوالي دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تبريد الخليط هو AT70 مع تركيز النهائي من 2 ميكروغرام / ميكرولتر. مخزن 10 ميكرولتر من AT70 مأخوذة في الفريزر -20 درجة مئوية لمدة استخدامها مرة أخرى. </li></ol> 4. التسبب في حاجز الحمض النووي من التلف في بورصة لندن مع الحيوانات المنوية التالفة الكروماتين أو الحمض النووي من التلفمحاكاة هيكل- <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حمل DNA حاجز الضرر في بورصة لندن مع لونين الحيوانات المنوية التالفة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 50 ميكرولتر من LSE لأنبوب مل ميكروسنتريفوج 1.5 و مكملا له مع 1 ميكرولتر من خليط الطاقة و 2 ميكرولتر من لونين الحيوانات المنوية التالفة (تركيز النهائي ~ 4000 الحيوانات المنوية / ميكرولتر رد فعل). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان الأنبوب رد فعل في درجة حرارة الغرفة لمدة 90 دقيقة ونفض الغبار الأنبوب كل 10 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الاستغناء 1 ميكرولتر من خليط التفاعل على شريحة المجهر تستكمل مع 1 ميكرولتر من محلول الصبغة النووية بعد 30 دقيقة الحضانة. وضع غطاء على زلة خليط التفاعل وتحقق من وجود تشكيل نواة عبر المجهر مضان. عادة، سوف تشكل نواة مستديرة بعد 30 دقيقة من الحضانة، مشيرا إلى تكرار الحمض النووي بدأت. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يستغرق 10 ميكرولتر من خليط التفاعل الى 90 ميكرولتر من العازلة العينة. ويتم تحليل العينات عن طريق استخدام الألغام المضادة للimmunoblotting P-S344 Chk1 أو الأجسام المضادة المقاومة للChk1. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حمل DNA حاجز الضرر في بورصة لندن معAT70 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 50 ميكرولتر من LSE لأنبوب مل 1.5 ميكروسنتريفوج تستكمل مع 1 ميكرولتر من خليط الطاقة و 1.6 ميكرولتر من الأسهم Tautomycin. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة ميكرولتر من 1،25 مسبقة الصنع AT70 (2 ميكروغرام / ميكرولتر) أو الماء (كما المراقبة السلبية) إلى كل رد فعل. احتضان ردود الفعل في درجة حرارة الغرفة لمدة 90 دقيقة. نفض الغبار الأنابيب رد فعل كل 10 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 10 ميكرولتر من خليط التفاعل الى 90 ميكرولتر من العازلة العينة. يتم فحص العينات عن طريق استخدام الألغام المضادة للimmunoblotting P-S344 Chk1 أو الأجسام المضادة المقاومة للChk1. </li></ol></li></ol> 5. ممثل النتائج يمكن للونين الحيوانات المنوية التالفة أو DNA بنية الأضرار محاكاة تحريك الحمض النووي من التلف ATR/Chk1-mediated تفتيش في استخراج القيطم نظام البيض. يبين الشكل 2A أن يدفع MMS Chk1 الفسفرة في Ser344 (P-S344 Chk1)، وهو مؤشر ATR تفعيل كيناز. 2B الرقم يدل على ان AT70، على DNA الأضرار محاكاة structure، يؤدي أيضا Chk1 الفسفرة. وتستخدم مجموع العينات Chk1 وتحميل عناصر التحكم في كل من الأمثلة. <img alt="الشكل 1" src="/files/ftp_upload/4449/4449fig1.jpg" /> الشكل 1. رسم تخطيطي للتفتيش إشارة DNA الضرر. <img alt="الشكل 2" src="/files/ftp_upload/4449/4449fig2.jpg" /> الشكل 2. هو فعل Chk1 الفسفرة من قبل أي من العلاجات MMS أو AT70 في مقتطفات البيض القيطم. (A) وحضنت MMS المتضررة لونين الحيوانات المنوية (MMS) أو العادي لونين الحيوانات المنوية (كون) في مقتطفات لمدة 90 دقيقة البيض. يتم فحص Chk1 الفسفرة في Ser344 (P-S344 Chk1) ومجموع Chk1 في مقتطفات البيض عبر immunoblotting. (B) AT70 أو الماء (CON) تضاف إلى مقتطفات البيض، على التوالي. ويتم تحليل العينات أيضا عبر immunoblotting كما في (A).

<ol>
	<li>Lohka, M. J., Masui, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+in+vitro+of+sperm+pronuclei+and+mitotic+chromosomes+induced+by+amphibian+ooplasmic+components.">Formation in vitro of sperm pronuclei and mitotic chromosomes induced by amphibian ooplasmic components.</a> Science. 220 (4598), 719-721 (1983).</li><li>Cimprich, K. A., Cortez, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATR:+an+essential+regulator+of+genome+integrity.">ATR: an essential regulator of genome integrity.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 9 (8), 616-627 (2008).</li><li>Lupardus, P. J., Van, C., Cimprich, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analyzing+the+ATR-mediated+checkpoint+using+Xenopus+egg+extracts.">Analyzing the ATR-mediated checkpoint using Xenopus egg extracts.</a> Methods. 41 (2), 222-231 (2007).</li><li>Lupardus, P. J., Byun, T., Yee, M. C., Hekmat-Nejad, M., Cimprich, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+requirement+for+replication+in+activation+of+the+ATR-dependent+DNA+damage+checkpoint.">A requirement for replication in activation of the ATR-dependent DNA damage checkpoint.</a> Genes Dev. 16 (18), 2327-2332 (2002).</li><li>Stokes, M. P., Van Hatten, R., Lindsay, H. D., Michael, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+replication+is+required+for+the+checkpoint+response+to+damaged+DNA+in+Xenopus+egg+extracts.">DNA replication is required for the checkpoint response to damaged DNA in Xenopus egg extracts.</a> J. Cell Biol. 158 (5), 863-872 (2002).</li><li>Kato, K., Strauss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accumulation+of+an+intermediate+in+DNA+synthesis+by+HEp.2+cells+treated+with+methyl+methanesulfonate.">Accumulation of an intermediate in DNA synthesis by HEp.2 cells treated with methyl methanesulfonate.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 71 (5), 1969-1973 (1974).</li><li>Paulovich, A. G., Hartwell, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+checkpoint+regulates+the+rate+of+progression+through+S+phase+in+S.+cerevisiae+in+response+to+DNA+damage.">A checkpoint regulates the rate of progression through S phase in S. cerevisiae in response to DNA damage.</a> Cell. 82 (5), 841-847 (1995).</li><li>Guo, Z., Kumagai, A., Wang, S. X., Dunphy, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Requirement+for+Atr+in+phosphorylation+of+Chk1+and+cell+cycle+regulation+in+response+to+DNA+replication+blocks+and+UV-damaged+DNA+in+Xenopus+egg+extracts.">Requirement for Atr in phosphorylation of Chk1 and cell cycle regulation in response to DNA replication blocks and UV-damaged DNA in Xenopus egg extracts.</a> Genes Dev. 14 (21), 2745-2756 (2000).</li><li>Jazayeri, A., Balestrini, A., Garner, E., Haber, J. E., Costanzo, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mre11-Rad50-Nbs1-dependent+processing+of+DNA+breaks+generates+oligonucleotides+that+stimulate+ATM+activity.">Mre11-Rad50-Nbs1-dependent processing of DNA breaks generates oligonucleotides that stimulate ATM activity.</a> EMBO. J. 27 (14), 1953-1962 (2008).</li><li>Kumagai, A., Dunphy, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Claspin,+a+novel+protein+required+for+the+activation+of+Chk1+during+a+DNA+replication+checkpoint+response+in+Xenopus+egg+extracts.">Claspin, a novel protein required for the activation of Chk1 during a DNA replication checkpoint response in Xenopus egg extracts.</a> Mol. Cell. 6 (4), 839-849 (2000).</li><li>Yan, S., Lindsay, H. D., Michael, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+requirement+for+Xmus101+in+ATR-mediated+phosphorylation+of+Claspin+bound+Chk1+during+checkpoint+signaling.">Direct requirement for Xmus101 in ATR-mediated phosphorylation of Claspin bound Chk1 during checkpoint signaling.</a> J. Cell Biol. 173 (2), 181-186 (2006).</li><li>Shiotani, B., Zou, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-stranded+DNA+orchestrates+an+ATM-to-ATR+switch+at+DNA+breaks.">Single-stranded DNA orchestrates an ATM-to-ATR switch at DNA breaks.</a> Mol. Cell. 33 (5), 547-558 (2009).</li><li>Tutter, A. V., Walter, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosomal+DNA+replication+in+a+soluble+cell-free+system+derived+from+Xenopus+eggs.">Chromosomal DNA replication in a soluble cell-free system derived from Xenopus eggs.</a> Methods Mol. Biol. 322, 121-137 (2006).</li><li>Cross, M. K., Powers, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+Fractionation+of+Xenopus+laevis+Egg+Extracts.">Preparation and Fractionation of Xenopus laevis Egg Extracts.</a> J. Vis. Exp. (18), e891 (2008).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

هناك العديد من المزايا في دراسة الحمض النووي من التلف باستخدام حاجز القيطم مقتطفات البيض. استخدام مستخلصات البيض يوفر كمية كبيرة من خلايا خالية مقتطفات متزامنة في الطور البيني من دورة الخلية. ويمكن للمستخلصات البيض بسهولة وبتكلفة زهيدة بها. فمن السهل نسبيا على ...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td></td><td></td><td></td><td> الكواشف </td></tr><tr><td> مكافحة P-S344 Chk1 الأجسام المضادة </td><td> خلية اشارة </td><td> 2348L </td><td></td></tr><tr><td> الأجسام المضادة لمكافحة Chk1 </td><td> سانتا كروز </td><td> SC7898 </td><td></td></tr><tr><td> أبروتينين </td><td> النائب Biomedicals </td><td> 0219115880 </td><td></td></tr><tr><td> سيكلوهيكسيميد </td><td> سيجما </td><td> C7698-5G </td><td></td></tr><tr><td> مثبط حركة الخلايا B </td><td> EMD </td><td> 250233 </td><td></td></tr><tr><td> Dithiothreitol (DTT) </td><td> VWR </td><td> JTF780-2 </td><td></td></tr><tr><td> قوات حرس السواحل الهايتية </td><td> سيجما </td><td> CG10-10VL </td><td></td></tr><tr><td> L-سيستين </td><td> سيجما </td><td> C7352-1KG </td><td></td></tr><tr><td> Leupeptin </td><td> VWR </td><td>97063-922 </td><td></td></tr><tr><td> methanesulfonate الميثيل (MMS) </td><td> سيجما </td><td> 129925-5G </td><td></td></tr><tr><td> نوكودازول </td><td> سيجما </td><td> M1404-2MG </td><td></td></tr><tr><td> PMSG </td><td> Calbiochem </td><td> 367222 </td><td></td></tr><tr><td> عينة العازلة </td><td> سيجما </td><td> S3401 </td><td></td></tr><tr><td> Tautomycin </td><td> واكو كيماويات USA </td><td> 209-12041 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> معدات </td></tr><tr><td> دلو لوضع البيض </td><td> Rubbermaid المنتجات التجارية </td><td> 6308 </td><td></td></tr><tr><td> CL2 IEC الطرد المركزي مع الدوار الدلو المتأرجح </td><td> الحرارية العلمية </td><td> 004260F </td><td></td></tr><tr><td> HB6 الدوار الدلو المتأرجح </td><td> الحرارية العلمية </td><td> 11860 </td><td></td></tr><tr><td> بالإضافة إلى الكتب التي RC6 الطرد المركزي اسرع </td><td> الحرارية العلمية </td><td> 46910 </td><td></td></tr><tr><td> UV crosslinker </td><td> UVP </td><td> 95-0174-01 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> حلول </td></tr><tr><td> 1X MMR </td><td></td><td></td><td> 100 ملي مول كلوريد الصوديوم، بوكل 2 مم، 0.5 مم MgSO 4، 2.5 مم CaCl 2، 5 ملي HEPES، وضبط درجة الحموضة إلى 7.8 مع هيدروكسيد الصوديوم M 10 </td></tr><tr><td> أبروتينين / Leupeptin الأسهم </td><td></td><td></td><td> 10 ملغ / مل في كل من المياه. تخزين 20 ميكرولتر مأخوذة في C. ° -80 </td></tr><tr><td> العازلة X </td><td></td><td></td><td> السكروز 0.2 م، 80 مم بوكل، 15 مم كلوريد الصوديوم، 5 ملم MgCl 2، 1 ملم EDTA، HEPES 10 مم، ضبط الرقم الهيدروجيني إلى 7.5 بواسطة حمض الهيدروكلوريك </td></tr><tr><td> سيكلوهيكسيميد الأسهم </td><td></td><td></td><td> 10 ملغ / مل في الماء. تخزين 1 مليلتر مأخوذة في -20 ° C. </td></tr><tr><td> مثبط حركة الخلايا B الأسهم </td><td></td><td></td><td> 5 ملغ / مل في DMSO. تخزين 20 ميكرولتر مأخوذة في -20 ° C. </td></tr><tr><td> Dithiothreitol (DTT) سوق الأسهم </td><td></td><td></td><td> 1 M في الماء. تخزين 1 مليلتر مأخوذة في -20 ° C. </td></tr><tr><td> ELB </td><td></td><td></td><td> السكروز 0.25 م، 1 ملم DTT، 50 ميكروغرام / مل سيكلوهيكسيميد، 2.5 ملم MgCl 2 و 50 ملي بوكل، HEPES 10 مم، pH7.7 </td></tr><tr><td> نوكودازول الأسهم </td><td></td><td></td><td> 10 ملغ / مل في DMSO. تخزين 5 ميكرولتر مأخوذة في C. ° -80 </td></tr><tr><td> خليط الطاقة </td><td></td><td></td><td> 375 ملي فوسفات الكرياتين، 50 مم ATP، و 25 ملم MgCl 2. يتم حفظ مأخوذة في C. ° -80 </td></tr><tr><td> حل صبغة النووية </td><td></td><td></td><td> 0.4 ميكروغرام / مل هويشت 33258، الجلسرين 25٪(ت / ت)، في 1X PBS </td></tr><tr><td> Tautomycin الأسهم </td><td></td><td></td><td> 100 ميكرومتر في DMSO. تخزين 10 ميكرولتر مأخوذة في C. ° -80 </td></tr></tbody></table>

study of the dna damage checkpoint using xenopus egg extracts

على أساس يومي، وتتعرض الخلايا لمجموعة متنوعة من الشتائم الذاتية والبيئية. لمكافحة هذه الإهانات، تطورت الخلايا DNA حاجز الضرر يشير كآلية مراقبة لاستشعار الحمض النووي من التلف والاستجابات الخلوية مباشرة إلى الحمض النووي من التلف. هناك عدة مجموعات من البروتينات التي تسمى أجهزة الاستشعار، ومحولات الطاقة والمستجيبات المشاركة في الحمض النووي من التلف مما يشير الى نقطة تفتيش (الشكل 1). في هذا المسار المعقد يشير، ATR (ATM وRad3 ذات الصلة) هي واحدة من كاينيسات الرئيسية التي يمكن أن تستجيب لالحمض النووي من التلف والإجهاد النسخ المتماثل. يمكن تنشيط ATR الفوسفات ركائز لها المصب مثل Chk1 (كيناز حاجز 1). وبناء على ذلك، فسفرته والمفعلين Chk1 يؤدي إلى آثار المصب كثيرة في نقطة تفتيش DNA الضرر بما في ذلك الاعتقال دورة الخلية، وتفعيل النسخ، إصلاح الحمض النووي الضرر، وموت الخلايا المبرمج أو الشيخوخة (الشكل 1). عند تلف الحمض النووي، وعدم تفعيل نتائج الحمض النووي حاجز الضرر في unrepبثت الضرر، وبالتالي، عدم الاستقرار الجيني. ودراسة الحمض النووي حاجز الضرر توضيح كيفية الحفاظ على سلامة الخلايا الجينية وتوفير فهم أفضل لكيفية الأمراض التي تصيب الإنسان مثل السرطان، وتطوير. القيطم المورق مقتطفات البيض والناشئة باعتبارها قوية خالية من الخلايا استخراج النظام النموذجي في الحمض النووي من التلف البحث الحاجز. وقد وصفت في البداية استخراج منخفضة السرعة (LSE) من قبل مجموعة Masui 1. إضافة لونين الحيوانات المنوية demembranated إلى نتائج LSE في تشكيل نواة حيث يتم نسخ DNA بطريقة محافظ جزئيا مرة واحدة في دورة الخلية. يتم تشغيل إشارات حاجز ATR/Chk1-mediated مسار من الحمض النووي من التلف أو الإجهاد تكرار 2. وتستخدم حاليا طريقتين للحث على نقطة التفتيش الحمض النووي من التلف: النهج DNA الحمض النووي الضارة والأضرار محاكاة هياكل 3. يمكن أن يتسبب الحمض النووي من التلف بواسطة أشعة (UV) فوق البنفسجية، أشعة γ-، الميثيل methanesulfonate (MMS)، ميتوميسين C (MMC)، 4-nitroquinoline-1-أكسيد (4-NQO)، أو aphidicolin 3 و 4. هو وكيل MMS مؤلكل الذي يمنع تكرار الحمض النووي وينشط الحمض النووي من التلف ATR/Chk1-mediated نقطة تفتيش 4-7. أشعة فوق البنفسجية يؤدي أيضا الحمض النووي من التلف ATR/Chk1-dependent 8 نقطة تفتيش. الحمض النووي الأضرار محاكاة هيكل AT70 هو مجمع صلب من اثنين أليغنوكليوتيد] بولي (DA) 70 وبولي-70 (DT). وقد تم تطوير النظام في مختبر بيل AT70 دانفي ويستخدم على نطاق واسع للحث على نقطة تفتيش تابعة للإشارات ATR/Chk1 9-12. هنا، نحن تصف بروتوكولات (1) لإعداد عصائر خالية من الخلايا البيض (LSE)، (2) لعلاج الحيوانات المنوية القيطم لونين مع اثنين من DNA مختلفة الإضرار النهج (MMS والأشعة فوق البنفسجية)، (3) لإعداد DNA الأضرار محاكاة هيكل AT70، و (4) لتحريك الحمض النووي من التلف ATR/Chk1-mediated تفتيش في بورصة لندن مع لونين الحيوانات المنوية التالفة أو DNA بنية الأضرار محاكاة.

Watch this Scientific Journal Video about Study of the DNA Damage Checkpoint using Xenopus Egg Extracts at JoVE.com

Study of the DNA Damage Checkpoint using Xenopus Egg Extracts

القيطم البيض هو نظام استخراج نموذجا مفيدا للتحقيق في نقطة تفتيش الحمض النووي من التلف. هذا البروتوكول هو لإعداد مستخلصات البيض القيطم والكواشف DNA حمل الضرر الحاجز. هذه التقنيات قابلة للتكيف مع مجموعة متنوعة من النهج DNA الضارة في دراسة الحمض النووي مما يشير الى نقطة التفتيش الضرر.

دراسة الحمض النووي حاجز الضرر باستخدام<em&gt; القيطم</emمقتطفات البيض&gt;

On a daily basis, cells are subjected to a variety of endogenous and environmental insults. To combat these insults, cells have evolved DNA damage ...

study-of-the-dna-damage-checkpoint-using-xenopus-egg-extracts

Research

JoVE Journal

Biology

Study of the DNA Damage Checkpoint using Xenopus Egg Extracts

16.5K Views.  University of North Carolina at Charlotte. القيطم البيض هو نظام استخراج نموذجا مفيدا للتحقيق في نقطة تفتيش الحمض النووي من التلف. هذا البروتوكول هو لإعداد مستخلصات البيض القيطم والكواشف DNA حمل الضرر الحاجز. هذه التقنيات قابلة للتكيف مع مجموعة متنوعة من النهج DNA الضارة في دراسة الحمض النووي مما ?...

Video: Study of the DNA Damage Checkpoint using Xenopus Egg Extracts

Testing Visual Sensitivity to the Speed and Direction of Motion in Lizards

Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of the visual system provide more empirical evidence for functional applications. Investigation into the sensory system provides information about the sensory capacity, learning and memory ability, and establishes known baseline behaviour in which to gauge deviations (Burghardt, 1977). However, unlike mammalian or avian systems, testing for learning and memory in a reptile species is difficult. Furthermore, using an operant paradigm as a psychophysical measure of sensory ability is likewise as difficult. Historically, reptilian species have responded poorly to conditioning trials because of issues related to motivation, physiology, metabolism, and basic biological characteristics. Here, I demonstrate an operant paradigm used a novel model lizard species, the Jacky dragon (Amphibolurus muricatus) and describe how to test peripheral sensitivity to salient speed and motion characteristics. This method uses an innovative approach to assessing learning and sensory capacity in lizards. I employ the use of random-dot kinematograms (RDKs) to measure sensitivity to speed, and manipulate the level of signal strength by changing the proportion of dots moving in a coherent direction. RDKs do not represent a biologically meaningful stimulus, engages the visual system, and is a classic psychophysical tool used to measure sensitivity in humans and other animals. Here, RDKs are displayed to lizards using three video playback systems. Lizards are to select the direction (left or right) in which they perceive dots to be moving. Selection of the appropriate direction is reinforced by biologically important prey stimuli, simulated by computer-animated invertebrates.

Testing visual sensitivity in lizards using an operant conditioning paradigm that employs video playback of random-dot kinematograms and computer-generated invertebrates.

اختبار الحساسية البصرية للسرعة واتجاه الحركة في السحالي

Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of ...

Preparation and Fractionation of Xenopus laevis Egg Extracts

Crude and fractionated Xenopus egg extracts can be used to provide ingredients for reconstituting cellular processes for morphological and biochemical analysis. Egg lysis and differential centrifugation are used to prepare the crude extract which in turn in used to prepare fractionated extracts and light membrane preparations.

Crude and fractionated Xenopus egg extracts can be used to provide ingredients for reconstituting cellular processes for morphological and biochemical analysis. Egg lysis and differential centrifugation are used to prepare the crude extract which in turn in used to prepare fractionated extracts and light membrane preparations.

إعداد والتقطير من البيض مقتطفات القيطم المورق

Crude and fractionated Xenopus egg extracts can be used to provide ingredients for reconstituting cellular processes for morphological and biochemical ...

In Vitro Nuclear Assembly Using Fractionated Xenopus Egg Extracts

Nuclear membrane assembly is an essential step in the cell division cycle; this process can be replicated in the test tube by combining Xenopus sperm chromatin, cytosol, and light membrane fractions. Complete nuclei are formed, including nuclear membranes with pore complexes, and these reconstituted nuclei are capable of normal nuclear processes.

Nuclear membrane assembly is an essential step in the cell division cycle; this process can be replicated in the test tube by combining Xenopus sperm chromatin, cytosol, and light membrane fractions. Complete nuclei are formed, including nuclear membranes with pore complexes, and these reconstituted nuclei are capable of normal nuclear processes.

في المختبر عن طريق الجمعية النووية مجزأ مقتطفات البيض القيطم

Nuclear membrane assembly is an essential step in the cell division cycle; this process can be replicated in the test tube by combining Xenopus sperm ...

Fertilization of Xenopus oocytes using the Host Transfer Method

Studying the contribution of maternally inherited molecules to vertebrate early development is often hampered by the time and expense necessary to generate maternal-effect mutant animals. Additionally, many of the techniques to overexpress or inhibit gene function in organisms such as Xenopus and zebrafish fail to sufficiently target critical maternal signaling pathways, such as Wnt signaling. In Xenopus, manipulating gene function in cultured oocytes and subsequently fertilizing them can ameliorate these problems to some extent. Oocytes are manually defolliculated from donor ovary tissue, injected or treated in culture as desired, and then stimulated with progesterone to induce maturation. Next, the oocytes are introduced into the body cavity of an ovulating host female frog, whereupon they will be translocated through the host's oviduct and acquire modifications and jelly coats necessary for fertilization. The resulting embryos can then be raised to the desired stage and analyzed for the effects of any experimental perturbations. This host-transfer method has been highly effective in uncovering basic mechanisms of early development and allows a wide range of experimental possibilities not available in any other vertebrate model organism.

Fertilization of Xenopus oocytes using the Host Transfer Method

Procedure for fertilizing Xenopus oocytes by the host transfer method.

تسميد البويضات القيطم باستخدام أسلوب نقل المضيف

Studying the contribution of maternally inherited molecules to vertebrate early development is often hampered by the time and expense necessary to ...

Production of Xenopus tropicalis Egg Extracts to Identify Microtubule-associated RNAs

Many organisms localize mRNAs to specific subcellular destinations to spatially and temporally control gene expression. Recent studies have demonstrated that the majority of the transcriptome is localized to a nonrandom position in cells and embryos. One approach to identify localized mRNAs is to biochemically purify a cellular structure of interest and to identify all associated transcripts. Using recently developed high-throughput sequencing technologies it is now straightforward to identify all RNAs associated with a subcellular structure. To facilitate transcript identification it is necessary to work with an organism with a fully sequenced genome. One attractive system for the biochemical purification of subcellular structures are egg extracts produced from the frog Xenopus laevis. However, X. laevis currently does not have a fully sequenced genome, which hampers transcript identification. In this article we describe a method to produce egg extracts from a related frog, X. tropicalis, that has a fully sequenced genome. We provide details for microtubule polymerization, purification and transcript isolation. While this article describes a specific method for identification of microtubule-associated transcripts, we believe that it will be easily applied to other subcellular structures and will provide a powerful method for identification of localized RNAs.

Production of Xenopus tropicalis Egg Extracts to Identify Microtubule-associated RNAs

We describe the collection of unfertilized Xenopus tropicalis eggs and production of a meiosis II-arrested egg extract. This egg extract can be used to purify microtubules and microtubule-associated RNAs.

إنتاج<em&gt; القيطم مداري</em&gt; البيض مقتطفات من التعرف على الرنا أنيبيب المرتبطة بها

Many  organisms localize mRNAs to specific subcellular destinations to spatially and  temporally control gene expression. Recent studies have demonstrated ...

Reconstitution Of &#946;-catenin Degradation In Xenopus Egg Extract

Xenopus laevis egg extract is a well-characterized, robust system for studying the biochemistry of diverse cellular processes. Xenopus egg extract has been used to study protein turnover in many cellular contexts, including the cell cycle and signal transduction pathways1-3. Herein, a method is described for isolating Xenopus egg extract that has been optimized to promote the degradation of the critical Wnt pathway component, &beta;-catenin. Two different methods are described to assess &beta;-catenin protein degradation in Xenopus egg extract. One method is visually informative ([35S]-radiolabeled proteins), while the other is more readily scaled for high-throughput assays (firefly luciferase-tagged fusion proteins). The techniques described can be used to, but are not limited to, assess &beta;-catenin protein turnover and identify molecular components contributing to its turnover. Additionally, the ability to purify large volumes of homogenous Xenopus egg extract combined with the quantitative and facile readout of luciferase-tagged proteins allows this system to be easily adapted for high-throughput screening for modulators of &beta;-catenin degradation.

Reconstitution Of &amp;#946;-catenin Degradation In Xenopus Egg Extract

A method is described for analyzing protein degradation using radiolabeled and luciferase-fusion proteins in Xenopus egg extract and its adaptation for high-throughput screening for small molecule modulators of protein degradation.

إعادة تشكيل β-catenin تدهور في<em&gt; القيطم</em&gt; مستخلصات البيض

Xenopus laevis egg extract is a well-characterized, robust system for studying the biochemistry of diverse cellular processes. Xenopus egg extract has ...

Detection and Analysis of DNA Damage in Mouse Skeletal Muscle In Situ Using the TUNEL Method

Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) deoxyuridine triphosphate (dUTP) nick end labeling (TUNEL) is the method of using the TdT enzyme to covalently attach a tagged form of dUTP to 3&#8217; ends of double- and single-stranded DNA breaks in cells. It is a reliable and useful method to detect DNA damage and cell death in situ. This video describes dissection, tissue processing, sectioning, and fluorescence-based TUNEL labeling of mouse skeletal muscle. It also describes a method of semi-automated TUNEL signal quantitation. Inherent normal tissue features and tissue processing conditions affect the ability of the TdT enzyme to efficiently label DNA. Tissue processing may also add undesirable autofluorescence that will interfere with TUNEL signal detection. Therefore, it is important to empirically determine tissue processing and TUNEL labeling methods that will yield the optimal signal-to-noise ratio for subsequent quantitation. The fluorescence-based assay described here provides a way to exclude autofluorescent signal by digital channel subtraction. The TUNEL assay, used with appropriate tissue processing techniques and controls, is a relatively fast, reproducible, quantitative method for detecting apoptosis in tissue. It can be used to confirm DNA damage and apoptosis as pathological mechanisms, to identify affected cell types, and to assess the efficacy of therapeutic treatments in vivo.

Detection and Analysis of DNA Damage in Mouse Skeletal Muscle In Situ Using the TUNEL Method

This video describes dissection, tissue processing, sectioning, and fluorescence-based TUNEL labeling of mouse skeletal muscle. It also describes a method for semi-automated analysis of TUNEL labeling.

كشف وتحليل الحمض النووي من التلف في العضلات الهيكلية ماوس<em&gt; في الموقع</em&gt; استخدام أسلوب TUNEL

Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) deoxyuridine triphosphate (dUTP) nick end labeling (TUNEL) is the method of using the TdT enzyme to covalently ...

A Cell-Free Assay Using Xenopus laevis Embryo Extracts to Study Mechanisms of Nuclear Size Regulation

A fundamental question in cell biology is how cell and organelle sizes are regulated. It has long been recognized that the size of the nucleus generally scales with the size of the cell, notably during embryogenesis when dramatic reductions in both cell and nuclear sizes occur. Mechanisms of nuclear size regulation are largely unknown and may be relevant to cancer where altered nuclear size is a key diagnostic and prognostic parameter. In vivo approaches to identifying nuclear size regulators are complicated by the essential and complex nature of nuclear function. The in vitro approach described here to study nuclear size control takes advantage of the normal reductions in nuclear size that occur during Xenopus laevis development. First, nuclei are assembled in X. laevis egg extract. Then, these nuclei are isolated and resuspended in cytoplasm from late stage embryos. After a 30 - 90 min incubation period, nuclear surface area decreases by 20 - 60%, providing a useful assay to identify cytoplasmic components present in late stage embryos that contribute to developmental nuclear size scaling. A major advantage of this approach is the relative facility with which the egg and embryo extracts can be biochemically manipulated, allowing for the identification of novel proteins and activities that regulate nuclear size. As with any in vitro approach, validation of results in an in vivo system is important, and microinjection of X. laevis embryos is particularly appropriate for these studies.

A Cell-Free Assay Using Xenopus laevis Embryo Extracts to Study Mechanisms of Nuclear Size Regulation

Mechanisms of cellular and intra-cellular scaling remain elusive. The use of Xenopus embryo extracts has become increasingly common to elucidate mechanisms of organelle size regulation. This method describes embryo extract preparation and a novel nuclear scaling assay through which mechanisms of nuclear size regulation can be identified.

فحص خلية مجاني عن طريق<em&gt; القيطم المورق</em&gt; الأجنة مقتطفات لدراسة آليات الحجم رقابة النووية

A fundamental question in cell biology is how cell and organelle sizes are regulated. It has long been recognized that the size of the nucleus generally ...

Xenopus laevis Egg Extract Preparation and Live Imaging Methods for Visualizing Dynamic Cytoplasmic Organization

Traditionally used for bulk biochemical assays, Xenopus laevis egg extracts have emerged as a powerful imaging-based tool for studying cytoplasmic phenomena, such as cytokinesis, mitotic spindle formation and assembly of the nucleus. Building upon early methods that imaged fixed extracts sampled at sparse time points, recent approaches image live extracts using time-lapse microscopy, revealing more dynamical features with enhanced temporal resolution. These methods usually require sophisticated surface treatments of the imaging vessel. Here we introduce an alternative method for live imaging of egg extracts that require no chemical surface treatment. It is simple to implement and utilizes mass-produced laboratory consumables for imaging. We describe a system that can be used for both wide-field and confocal microscopy. It is designed for imaging extracts in a 2-dimensional (2D) field, but can be easily extended to imaging in 3D. It is well-suited for studying spatial pattern formation within the cytoplasm. With representative data, we demonstrate the typical dynamic organization of microtubules, nuclei and mitochondria in interphase extracts prepared using this method. These image data can provide quantitative information on cytoplasmic dynamics and spatial organization.

Xenopus laevis Egg Extract Preparation and Live Imaging Methods for Visualizing Dynamic Cytoplasmic Organization

We describe a method for the preparation and live imaging of undiluted cytoplasmic extracts from Xenopus laevis eggs.

زينوبوس لايفيس تحضير مستخلص البيض وطرق التصوير الحية لتصور التنظيم السيتوبلازمي الديناميكي

Traditionally used for bulk biochemical assays, Xenopus laevis egg extracts have emerged as a powerful imaging-based tool for studying cytoplasmic ...

Demonstration of the DNA Fiber Assay for Investigating DNA Damage and Repair Dynamics Induced by Nanoparticles

Nanomaterial exposure can cause replication stress and genomic instability in cells. The degree of instability depends on the chemistry, size, and concentration of the nanomaterials, the time of exposure, and the exposed cell type. Several established methods have been used to elucidate how endogenous/exogenous agents impact global replication. However, replicon-level assays, such as the DNA fiber assay, are imperative to understand how these agents influence replication initiation, terminations, and replication fork progression. Knowing this allows one to understand better how nanomaterials increase the chances of mutation fixation and genomic instability. We used RAW 264.7 macrophages as model cells to study the replication dynamics under graphene oxide nanoparticle exposure. Here, we demonstrate the basic protocol for the DNA fiber assay, which includes pulse labeling with nucleotide analogs, cell lysis, spreading the pulse-labeled DNA fibers onto slides, fluorescent immunostaining of the nucleotide analogs within the DNA fibers, imaging of the replication intermediates within the DNA fibers using confocal microscopy, and replication intermediate analysis utilizing a computer-assisted scoring and analysis (CASA) software.

The methodology assists in the analysis of variation in DNA replication dynamics in the presence of nanoparticles. Different methodologies can be adopted based on the cytotoxicity level of the material of interest. In addition, a description of the image analysis is provided to help in DNA fiber analysis.