قليل من الطرق تسمح بتقييم وظائف الأسلاف المكونة للدم بسرعة. يقيس هذا البروتوكول تأثير انقسامات الخلايا الأولى على مصير الخلية والتزامها. يسمح هذا البروتوكول بقياس الانقسام والتمايز في وقت واحد على مستوى خلية واحدة وبإنتاجية عالية دون الحاجة إلى معالجة معقدة وواسعة النطاق.
هذه الطريقة مناسبة لأي مجموعة مكونة للدم يمكن الحفاظ عليها في الثقافة. لذلك يمكن تطبيقه بسهولة على بيولوجيا السرطان وعلم المناعة وعلم الأحياء التنموي. للبدء ، قسمة 250 ميكرولتر من كسر CD34 + بالتساوي في أربعة أنابيب البولي بروبلين 15 ملليلتر.
قم بتسمية الأنابيب كما هو موضح في المخطوطة النصية. قسمة 250 ميكرولتر من جزء CD34 إلى أربعة أنابيب أخرى من مادة البولي بروبيلين سعة 15 ملليلتر وقم بتسمية الأنابيب. قم بإعداد حلول CFSE العالية و CSFE المنخفضة كما هو موضح في مخطوطة النص.
أضف 250 ميكرولترا من محلول CFSE العالي إلى أنبوب CF و CV ، و 250 ميكرولترا من محلول CFSE المنخفض إلى أنبوب VC ، و 250 ميكرولترا من وسط النسر المعدل من Dulbecco ، أو DMEM ، بدون مصل بقري جنيني ، أو FBS ، إلى الأنبوب السادس. لضمان مزيج فعال من تعليق الخلية في صبغة الخلية ، قم بإمالة الأنبوب بمقدار 90 درجة وقم بإيداع محاليل CFSE على جدار الأنبوب. بعد ذلك ، أمسك الأنبوب عموديا واخلطه ثلاث أو أربع مرات لضمان خلط سريع لمحاليل CFSE مع الخلايا المعاد تعليقها.
احتضان التعليق عند 37 درجة مئوية لمدة ثماني دقائق. بعد الحضانة ، أضف خمسة ملليلتر من DMEM تحتوي على 10٪ FBS وضع الأنابيب عند 37 درجة مئوية لمدة خمس دقائق. تدور الأنابيب في 300 غرام لمدة خمس دقائق.
قم بإزالة المادة الطافية عن طريق الشفط دون إزعاج الحبيبات واغسل الحبيبات بخمسة ملليلتر من PBS ، ETDA. أدر الأنابيب مرة أخرى وتخلص من المادة الطافية قبل تعليق الحبيبات في 40 ميكرولتر من PBS ، ETDA. لتلطيخ خلايا CD34 + ، قم بإعداد مزيج رئيسي من الأجسام المضادة في أنبوب واحد سعة 0.5 ملليلتر.
أضف سبعة ميكرولترات من المزيج الرئيسي للأجسام المضادة إلى كل شرط من شروط CD34 + الأربعة. أعد تعليق الخلايا في محلول تلطيخ باستخدام ما يقرب من 500 ميكرولتر لكل من الخرز في خلايا CD34 + وملليلتر واحد لأنابيب CD34. لفرز الخلايا ، قم بتعيين إستراتيجية البوابات عن طريق إنشاء مخططات رسم نقطي.
أولا ، تصور الخلايا على مخطط نقطة FSCA مقابل SSCA وانقر نقرا مزدوجا فوق أداة بوابة المضلع لتحديد السكان ذوي التشتت الجانبي المنخفض. قم بتسمية هذه البوابة التي تم إنشاؤها حديثا باسم الخلايا. في المخطط النقطي التالي ، FSCA مقابل FSH ، انقر بزر الماوس الأيمن على قطعة الأرض وحدد البوابة الخلايا من القائمة المنسدلة بالنقر فوقها.
استخدم نفس أداة البوابات لتحديد مجموعة سكانية ضيقة على القطر بين المحورين. قم بتسمية هذه البوابة كخلايا مفردة. في مخطط النقطة الثالثة ، APC مقابل FSH-H ، اعرض الخلايا المفردة للسكان وبوابة الخلايا السالبة للتعبير عن نسب APC.
قم بتسمية هذه المجموعة التي تم إنشاؤها حديثا على أنها نسب سلبية. في المخطط الرابع ، CFSE مقابل CTV ، اعرض السكان سلالة سلبية وأنشئ أربع بوابات منفصلة ، واحدة لكل مجموعة صبغة. تظهر البوابة السادسة هنا كمثال.
استخدم المؤامرات الخامسة والسادسة لتحديد الأسلاف موضع الاهتمام. بوابة بسخاء CD34 + CD38 السكان و CD34 + CD38 + في المؤامرة الخامسة. بعد ذلك ، حدد مجتمع CD34 + CD38 في المخطط السادس وارسم ثلاث بوابات ل LMPP و HSC و MPP.
قم بتشغيل كسور CD34 + ، وتسجيل ما لا يقل عن 5000 حدث في بوابة الخلية الواحدة. اضبط البوابة لكل مجموعة صبغ ، وقم بتعيين بوابة محكمة لتحديد مجموعة متجانسة. قم بإعداد قالب فرز اللوحة باستخدام تخطيط فرز التجربة.
تحتوي الآبار المسماة CD34 على 5،000 إلى 10،000 خلية مرتبة على بوابة CF و CV و VC و VI. تحتوي الآبار السائبة على 500 خلية مرتبة على البوابة CD34 + CD38 - تحتوي الآبار أحادية الخلية على حدث واحد فقط لكل تركيبة صبغة انقسام خلية لكل بئر ، لذلك أربعة أحداث لكل بئر في المجموع. بعد ذلك ، ابدأ بفرز CD34-CF في وضع نقاء العائد.
انقر فوق الزر "اكتساب" ثم الزر "فرز". انقر فوق اكتساب، ثم على فرز زر ، تأكد من تحديد 0160 كدرجة نقاء. أخيرا ، قم بفرز الخلايا ذات الأهمية ، خلية واحدة لكل بئر ، في نقاء خلية واحدة ، مع التأكد من تحديد خيار فرز الفهرس.
أجهزة الطرد المركزي لوحة في 300 G لمدة خمس دقائق وإزالة طاف عن طريق قلب لوحة بسرعة تحت غطاء محرك السيارة على منشفة ورقية. أضف ثمانية ميكرولترات من المخزن المؤقت الدائم إلى الآبار A1 إلى A4 ، متبوعا بإضافة ثمانية ميكرولترات من المزيج إلى الآبار الأخرى. اغسل الخلايا بإضافة 100 ميكرولتر من محلول التلوين لكل بئر باستخدام ماصة متعددة القنوات.
أجهزة الطرد المركزي وإزالة المادة الطافية قبل تعليق الخلايا في 85 ميكرولتر من المخزن المؤقت تلطيخ. ابدأ التحليل على مقياس التدفق الخلوي في وضع الاستحواذ باستخدام القالب المخصص والنقر فوق مخصص. بعد اختيار الفلوروفورات ذات الأهمية من القائمة ، اضبط إعداد اللوحة باتباع قالب اللوحة المصحح لعدد الآبار التي تحتوي على خلية واحدة على الأقل.
ضع علامة في خيار التحريض وحدد 100 ميكرولتر كحد لحجم الاستحواذ. بعد ذلك ، اضبط معدل الاستحواذ على عدم تجاوز ميكرولتر واحد في الثانية ، حيث تعمل السرعة المنخفضة على تحسين الحجم الإجمالي الذي تم تحليله لكل بئر. بالنسبة للبوابات التمثيلية ، قم بتسلسل الآبار السائبة المختلفة في ملف واحد.
بعد النقر فوق خيار السكان المتسلسلين ، حدد جميع المعلمات غير المعوضة من قائمة المعلمات ، ثم انقر فوق Concatenate. قم بتحميل الملف المتسلسل إلى مساحة العمل ، ثم قم بتطبيق مصفوفة التعويض عبر السحب والإفلات. تحتاج تسميات الخلايا ذات CV وVC إلى قيمة محولة.
انقر فوق الأدوات واشتقاق المعلمة للحصول على القيمة المحولة. الصق الصيغة المشار إليها في مربع الصيغة. قم بتطبيق البوابة على كل لون على حدة كمخطط مدرج تكراري.
بالنسبة إلى CF و VI ، اضبط CFSE-A و CTV-A على المحور X ، على التوالي. بالنسبة إلى CV و VC ، قم بتعيين المعلمة المشتقة حديثا على المحور X ، ثم قم بتعيين البوابات المقابلة لكل ذروة. ضع البوابة على كل خلية فردية جيدا.
تأكد من إضافة المعلمة المشتقة إلى كل بئر تم تحليله. تحقق يدويا من كل بوابة لون لكل بئر لاكتشاف الأحداث التي تم تعيينها بشكل غير صحيح إلى قمة معينة. يتطلب تحليل قياس التدفق الخلوي بعد زراعة الخلايا بوابات دقيقة لإثبات قرابة كل خلية فردية جنبا إلى جنب مع النمط الظاهري الخلوي.
يعد تعريف الذروة والتخصيص من الجوانب الحاسمة لتحليل قياس التدفق الخلوي. تعرض الرسوم البيانية مثالين لعائلات منتشرة على قمم متعددة ، واحدة من قمتين متشابهتين في الشدة والأخرى ذات قمتين مختلفتين من الشدة. يتم عرض أنواع مختلفة من تمثيل البيانات والاختبار الإحصائي هنا لتجربتين منفصلتين تم إجراؤهما بعد 72 ساعة ل HSCs و MPPs.
تمثل الخريطة الحرارية لتمايز HSC للحالة عائلات خلايا مختلفة ، سواء في مصائر الخلايا أو انقسامات الخلايا. يظهر هنا الرسم البياني الذي يقارن مصير عائلات الخلايا المشتقة من HSCs و MPPs. بالنسبة لكلا النوعين من الخلايا ، يتم عرض المقارنة بين الحالة GT وتمايز الحالة مع الاختبارات الإحصائية التي تم إجراؤها ل MPPs.
يوضح هنا الرسوم البيانية التي تقارن النسبة المئوية لعائلات الخلايا لكل جيل ونوع التماثل أو عدم التماثل في مصير القسم الأول. يتم عرض توزيع المصائر لكل جيل ل MPPs وتمايز الحالة هنا. يتطلب هذا الإجراء عزل الخلايا بكميات كبيرة لتعيين استراتيجية البوابة المناسبة.
لذلك من الأفضل أن تبدأ التلوين بما لا يقل عن 10،000 خلية. يمكن أن يكون الجمع بين هذه الطريقة والقياس المستمر ، مثل تخيل الخلايا الحية ، قويا للغاية ، حيث يمكن أن يوفر الاثنان معا وصفا تفصيليا للأسلاف المبكرة لديناميكيات الخلية. تم تطوير هذا النهج لأول مرة لبيولوجيا الخلايا التائية من قبل مختبرات هوبكنز.
هذا الإصدار ، الذي تم تكييفه للخلايا الجذعية في الدم ، يتوسع الآن ليشمل السرطان وبيولوجيا الخلايا الجذعية.
