조혈 전구 세포의 기능을 신속하게 평가할 수있는 방법은 거의 없습니다. 이 프로토콜은 첫 번째 세포 분열이 세포의 운명과 헌신에 미치는 영향을 측정합니다. 이 프로토콜을 사용하면 복잡하고 광범위한 조작 없이 단일 세포 수준에서 높은 처리량으로 분열과 분화를 동시에 측정할 수 있습니다.
이 방법은 배양에서 유지 될 수있는 모든 조혈 집단에 적합합니다. 따라서 암 생물학, 면역학 및 발달 생물학에 쉽게 적용할 수 있습니다. 시작하려면 250 마이크로 리터의 CD34 + 분획을 4 개의 15 밀리리터 폴리 프로필렌 튜브에 균등하게 분배합니다.
텍스트 원고에 설명된 대로 튜브에 라벨을 붙입니다. CD34 분획 250마이크로리터를 다른 4개의 15밀리리터 폴리프로필렌 튜브에 분취하고 튜브에 라벨을 붙입니다. 텍스트 원고에 설명 된대로 CFSE high 및 CSFE low 솔루션을 준비하십시오.
CF 및 CV 튜브에 CFSE 고용액 250마이크로리터, VC 튜브에 CFSE 저용액 250마이크로리터, 소 태아 혈청(FBS)이 없는 Dulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM) 250마이크로리터를 VI 튜브에 추가합니다. 세포 염료에서 세포 현탁액의 효율적인 혼합을 보장하려면 튜브를 90도 기울이고 CFSE 용액을 튜브 벽에 증착합니다. 그런 다음 튜브를 수직으로 잡고 3-4회 혼합하여 CFSE 용액과 재현탁된 셀이 빠르게 혼합되도록 합니다.
현탁액을 섭씨 37도에서 8분 동안 배양합니다. 배양 후 10% FBS가 포함된 DMEM 5밀리리터를 추가하고 튜브를 섭씨 37도에서 5분 동안 놓습니다. 튜브를 300G에서 5분 동안 돌립니다.
펠릿을 방해하지 않고 흡인을 통해 상청액을 제거하고 5밀리리터의 PBS, ETDA로 펠릿을 세척합니다. 튜브를 다시 회전시키고 펠릿을 40 마이크로리터의 PBS, ETDA에 재현탁하기 전에 상청액을 버립니다. CD34+세포를 염색하기 위해 항체의 마스터 믹스를 단일 0.5밀리리터 튜브에 준비합니다.
항체 마스터 믹스의 7마이크로리터를 4개의 CD34+ 조건 각각에 추가합니다. CD34+ 세포의 비드에 대해 각각 약 500마이크로리터, CD34 튜브의 비드에 대해 각각 약 1밀리리터를 사용하여 염색 완충액에 세포를 재현탁합니다. 셀 정렬의 경우 도트 플롯 다이어그램을 만들어 게이팅 전략을 설정합니다.
먼저 FSCA와 SSCA 도트 플롯에서 셀을 시각화하고 폴리곤 게이팅 도구를 두 번 클릭하여 측면 산란이 낮은 모집단을 선택합니다. 새로 만든 이 게이트에 Cells라는 레이블을 지정합니다. 다음 도트 플롯 FSCA 대 FSCH에서 플롯을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 드롭다운 메뉴에서 게이트 셀을 클릭하여 선택합니다.
동일한 게이팅 도구를 사용하여 두 축 사이의 대각선에서 좁은 모집단을 선택합니다. 이 게이트에 단일 셀로 레이블을 지정합니다. 세 번째 점도표인 APC 대 FSH-H에서는 모집단 단일 세포를 표시하고 APC 계통의 발현에 대해 음성인 세포를 게이트합니다.
새로 생성된 이 모집단을 Lineage Negative로 레이블을 지정합니다. 네 번째 그림 CFSE 대 CTV에서는 모집단 Lineage Negative를 표시하고 각 염료 조합에 대해 하나씩 4개의 개별 게이트를 만듭니다. 게이트 VI는 여기에 예시로 나와 있습니다.
다섯 번째 및 여섯 번째 그림을 사용하여 관심 있는 선조를 식별합니다. 다섯 번째 플롯에서 CD34+CD38-모집단과 CD34+CD38+를 관대하게 게이트합니다. 그런 다음 여섯 번째 그림에서 CD34+CD38-모집단을 선택하고 LMPP, HSC 및 MPP에 대한 세 개의 게이트를 그립니다.
CD34+fractions를 실행하여 단일 세포 게이트에 최소 5, 000개의 이벤트를 기록합니다. 각 염료 조합에 대한 게이트를 조정하고 균질한 모집단을 선택하기 위해 단단한 게이트를 설정합니다. 실험 정렬 레이아웃을 사용하여 플레이트 정렬 템플릿을 준비합니다.
CD34로 명명된 웰은 CF, CV, VC, VI 게이트에 분류된 5, 000 내지 10, 000개의 세포를 함유한다. 벌크 웰은 게이트 CD34+CD38-단일 세포 웰 당 세포 분열 염료 조합 당 하나의 이벤트 만 포함하므로 웰 당 총 4 개의 이벤트를 포함합니다. 그런 다음 수율 순도 모드에서 CD34-CF를 분류하는 것부터 시작합니다.
Acquire 버튼을 클릭한 다음 Sort 버튼을 클릭합니다. Acquire(획득)를 클릭한 다음 Sort(정렬) 버튼을 클릭하여 순도 등급으로 0160을 선택했는지 확인합니다. 마지막으로, 관심 있는 셀을 웰당 하나의 셀로 단일 셀 순도로 정렬하여 Index Sorting 옵션을 선택했는지 확인합니다.
플레이트를 300G에서 5분 동안 원심분리하고 후드 아래의 플레이트를 종이 타월로 빠르게 뒤집어 상층액을 제거합니다. 8 마이크로리터의 스탠딩 버퍼를 웰 A1 내지 A4에 첨가하고, 이어서 8 마이크로리터의 혼합물을 다른 웰에 첨가한다. 다채널 피펫을 사용하여 웰 당 100 마이크로리터의 염색 완충액을 첨가하여 세포를 세척한다.
원심분리하여 상층액을 제거한 후 세포를 85 마이크로리터의 염색 완충액에 재현탁시켰다. 전용 템플릿을 사용하여 Acquisition 모드에서 유세포 분석기에 대한 분석을 시작하고 Custom(사용자 지정)을 클릭합니다. 목록에서 관심 있는 형광단을 선택한 후 하나 이상의 셀을 포함하는 웰 수에 대해 수정된 플레이트 템플릿에 따라 플레이트 설정을 설정합니다.
교반 옵션을 선택하고 획득 부피 제한으로 100마이크로리터를 선택합니다. 이어서, 획득 속도를 초당 1 마이크로리터로 우월하지 않게 설정하고, 속도가 낮을수록 웰 당 분석된 총 부피가 향상된다. 대표 게이팅의 경우, 서로 다른 벌크 웰을 단일 파일에 연결합니다.
Concatenate Populations 옵션을 클릭한 후 Parameters 메뉴에서 All uncompensated parameters를 선택한 다음 Concatenate를 클릭합니다. 연결된 파일을 작업 공간에 업로드한 다음 드래그 앤 드롭을 통해 보정 매트릭스를 적용합니다. CV 및 VC가 있는 셀 레이블에는 변환된 값이 필요합니다.
Tools and Derive Parameter(도구 및 매개변수 파생)를 클릭하여 변환된 값을 가져옵니다. 표시된 수식을 수식 상자에 붙여 넣습니다. 각 색상에 게이팅을 히스토그램 플롯으로 개별적으로 적용합니다.
CF 및 VI의 경우 각각 X축에 CFSE-A 및 CTV-A를 설정합니다. CV 및 VC의 경우 X축에 새로 파생된 매개변수를 설정한 다음 각 피크에 해당하는 게이트를 설정합니다. 각 개별 단일 셀 웰에 게이팅을 적용합니다.
파생된 파라미터를 분석된 모든 웰에 추가해야 합니다. 각 웰의 각 컬러 게이트를 수동으로 확인하여 지정된 피크에 잘못 할당된 이벤트를 감지합니다. 세포 배양 후 유세포 분석 분석에는 세포 표현형과 함께 각 개별 세포의 친족 관계를 확립하기 위해 정밀한 게이팅이 필요합니다.
피크 정의 및 할당은 유세포 분석의 중요한 측면입니다. 히스토그램은 여러 피크에 퍼져 있는 패밀리의 두 가지 예를 보여주는데, 하나는 두 개의 유사한 강도 피크 중 하나이고 다른 하나는 두 개의 다른 강도 피크를 가지고 있습니다. HSC 및 MPP에 대해 72시간 후에 수행된 두 개의 개별 실험에 대해 다양한 유형의 데이터 표현 및 통계 테스트가 여기에 표시됩니다.
조건 HSC 분화에 대한 히트 맵은 세포 운명과 세포 분열 모두에서 서로 다른 세포 패밀리를 나타냅니다. 운명 HSC와 MPP 유래 세포군을 비교하는 히스토그램이 여기에 나와 있습니다. 두 세포 유형 모두에 대해 조건 GT와 조건 분화 간의 비교가 MPP에 대해 수행된 통계적 테스트와 함께 표시됩니다.
세대당 세포군의 비율과 첫 번째 분할에 대한 운명의 대칭 또는 비대칭 유형을 비교하는 히스토그램이 여기에 나와 있습니다. MPP의 세대당 운명 분포와 조건 차별화가 여기에 표시됩니다. 이 절차에서는 적절한 게이팅 전략을 설정하기 위해 셀을 대량으로 분리해야 합니다.
따라서 적어도 10, 000 개의 세포로 염색을 시작하는 것이 좋습니다. 이 방법을 살아있는 세포가 상상하는 것과 같은 연속 측정과 결합하면 두 가지가 함께 세포 역학의 초기 전구체에 대한 자세한 설명을 제공할 수 있기 때문에 매우 강력할 수 있습니다. 이 접근법은 홉킨스 연구소 (Hopkins Labs)에 의해 T 세포 생물학을 위해 처음 개발되었습니다.
혈액 줄기 세포에 적응 된이 버전은 현재 암 및 줄기 세포 생물학으로 확장되고 있습니다.
