Poucos métodos permitem avaliar rapidamente a funcionalidade dos progenitores hematopoéticos. Este protocolo mede o impacto das primeiras divisões celulares no destino e comprometimento celular. Este protocolo permite medir simultaneamente a divisão e diferenciação em nível de célula única e com alto rendimento sem a necessidade de manipulação complexa e extensa.
Este método é adequado para qualquer população hematopoiética que possa ser mantida em cultura. Assim, pode ser facilmente aplicado à biologia do câncer, imunologia e biologia do desenvolvimento. Para começar, alíquota 250 microlitros da fração CD34+ igualmente em quatro tubos de polipropileno de 15 mililitros.
Rotule os tubos conforme descrito no manuscrito do texto. Aliquot 250 microlitros da fração CD34 em outros quatro tubos de polipropileno de 15 mililitros e rotular os tubos. Preparar soluções CFSE high e CSFE low conforme descrito no texto do manuscrito.
Adicione 250 microlitros da solução CFSE alta ao tubo CF e CV, 250 microlitros da solução baixa CFSE ao tubo VC e 250 microlitros do meio Dulbecco's Modified Eagle Medium, ou DMEM, sem soro fetal bovino, ou FBS, ao tubo VI. Para garantir uma mistura eficiente de suspensão celular em corante celular, incline o tubo em 90 graus e deposite as soluções CFSE na parede do tubo. Em seguida, segure o tubo verticalmente e misture três ou quatro vezes para garantir uma mistura rápida das soluções de CFSE com as células ressuspensas.
Incubar a suspensão a 37 graus Celsius durante oito minutos. Após a incubação, adicionar cinco mililitros de DMEM contendo 10% de FBS e colocar os tubos a 37 graus Celsius por cinco minutos. Gire os tubos a 300 G por cinco minutos.
Retire o sobrenadante por aspiração sem perturbar o pellet e lave o pellet com cinco mililitros de PBS, ETDA. Gire os tubos novamente e descarte o sobrenadante antes de ressuspender o pellet em 40 microlitros de PBS, ETDA. Para manchar as células CD34+, prepare uma mistura mestra de anticorpos em um único tubo de 0,5 mililitro.
Adicione sete microlitros da mistura mestre de anticorpos a cada uma das quatro condições CD34+. Ressuspender as células em tampão de coloração usando aproximadamente 500 microlitros cada para as esferas em células CD34+ e um mililitro para os tubos CD34. Para classificação de células, defina a estratégia de limitação criando diagramas de gráfico de pontos.
Primeiro, visualize as células em um gráfico de pontos FSCA versus SSCA e clique duas vezes na ferramenta Polygon gating para selecionar a população com baixa dispersão lateral. Rotule esse portão recém-criado como Células. No gráfico de pontos a seguir, FSCA versus FSCH, clique com o botão direito do mouse no gráfico e selecione as células do portão no menu suspenso clicando nele.
Use a mesma ferramenta de limitação para selecionar uma população apertada na diagonal entre os dois eixos. Rotule esse portão como Células Únicas. No terceiro gráfico de pontos, APC versus FSH-H, exibe a população Single Cells e gate as células negativas para a expressão da linhagem APC.
Rotule essa população recém-criada como Linhagem Negativa. No quarto gráfico, CFSE versus CTV, exibe a população Linhagem Negativa e cria quatro portas separadas, uma para cada combinação de corante. O portão VI é mostrado aqui como exemplo.
Use a quinta e sexta parcelas para identificar os progenitores de interesse. Generosamente porta CD34+CD38-população e o CD34+CD38+ na quinta parcela. Em seguida, selecione a população CD34+CD38 no sexto gráfico e desenhe três portas para LMPP, HSC e MPP.
Execute as frações CD34+, gravando pelo menos 5.000 eventos no portão de célula única. Ajuste o portão para cada combinação de corantes, definindo um portão apertado para selecionar uma população homogênea. Prepare o Modelo de Classificação de Chapas usando o layout Classificação de Experimentos.
Os poços denominados CD34-contêm 5.000 a 10.000 células classificadas na porta CF, CV, VC, VI. Os poços a granel contêm 500 células classificadas no portão CD34+CD38-Os poços de célula única contêm apenas um evento por combinação de corante de divisão celular por poço, portanto, quatro eventos por poço no total. Em seguida, comece classificando o CD34-CF no modo Pureza de rendimento.
Clique no botão Adquirir e, em seguida, no botão Classificar. Clique em Adquirir e, em seguida, no botão Classificar, garantindo ter marcado 0160 como grau de pureza. Finalmente, classifique as células de interesse, uma célula por poço, em pureza de célula única, garantindo ter marcado a opção de classificação de índice.
Centrifugar a placa a 300 G por cinco minutos e remover o sobrenadante invertendo rapidamente a placa sob o capô sobre um papel toalha. Adicionar oito microlitros de tampão parado aos poços A1 a A4, seguido da adição de oito microlitros da mistura aos outros poços. Lave as células adicionando 100 microlitros de tampão de coloração por poço usando uma pipeta multicanal.
Centrifugar e remover o sobrenadante antes de ressuspender as células em 85 microlitros de tampão corante. Inicie a análise no citômetro de fluxo no modo de aquisição usando o modelo dedicado e clicando em Personalizado. Após selecionar os fluoróforos de interesse da lista, defina a configuração da placa seguindo o molde da placa corrigido para o número de poços contendo pelo menos uma célula.
Marque a opção Agitação e selecione 100 microlitros como limite de volume de aquisição. Em seguida, defina a taxa de aquisição não superior a um microlitro por segundo, pois menor velocidade melhora o volume total analisado por poço. Para o fechamento representativo, concatene os diferentes poços a granel em um único arquivo.
Depois de clicar na opção Concatenar populações, selecione Todos os parâmetros não compensados no menu Parâmetros e, em seguida, clique em Concatenar. Carregue o arquivo concatenado no espaço de trabalho e, em seguida, aplique a matriz de compensação por meio de arrastar e soltar. Rótulos de células com CV e VC precisam de um valor transformado.
Clique em Ferramentas e Derive Parameter para obter o valor transformado. Cole a fórmula indicada na caixa de fórmula. Aplique o limite a cada cor individualmente como um gráfico de histograma.
Para FC e VI, defina CFSE-A e CTV-A no eixo X, respectivamente. Para CV e VC, defina o parâmetro recém-derivado no eixo X e, em seguida, defina as portas correspondentes a cada pico. Aplique bem o gating em cada célula individual.
Certifique-se de adicionar o parâmetro derivado a cada poço analisado. Verifique manualmente cada porta de cor para cada poço para detectar eventos que estão atribuídos incorretamente a um determinado pico. A análise por citometria de fluxo após cultura celular requer gating preciso para estabelecer o parentesco de cada célula individual juntamente com a fenotipagem celular.
A definição e atribuição dos picos são aspectos cruciais da análise por citometria de fluxo. Os histogramas mostram dois exemplos de famílias distribuídas em múltiplos picos, um de dois picos de intensidade semelhantes e outro com dois picos de intensidade diferentes. Diferentes tipos de representação de dados e testes estatísticos são mostrados aqui para dois experimentos separados realizados após 72 horas para HSCs e MPPs.
O mapa de calor para a diferenciação da condição HSC representa diferentes famílias celulares, tanto no destino celular quanto nas divisões celulares. O histograma comparando as famílias celulares derivadas de HSCs e MPPs é mostrado aqui. Para ambos os tipos celulares, a comparação entre a condição GT e a diferenciação da condição é exibida juntamente com os testes estatísticos realizados para MPPs.
Histogramas comparando a porcentagem de famílias celulares por geração e o tipo de simetria ou assimetria no destino para a primeira divisão são mostrados aqui. A distribuição dos destinos por geração para MPPs e a diferenciação da condição são mostradas aqui. Este procedimento requer isolar células em massa para definir a estratégia de confinamento apropriada.
Portanto, é melhor iniciar a coloração com pelo menos 10.000 células. Combinar este método com a medição contínua, como as células vivas imaginando, pode ser muito poderoso, pois os dois juntos podem fornecer uma descrição detalhada dos primeiros progenitores da dinâmica celular. Esta abordagem foi desenvolvida pela primeira vez para a biologia de células T pelo Hopkins Labs.
Esta versão, adaptada para células estaminais do sangue, está agora a expandir-se para o cancro e a biologia das células estaminais.
