Pocos métodos permiten evaluar rápidamente la funcionalidad de los progenitores hematopoyéticos. Este protocolo mide el impacto de las primeras divisiones celulares en el destino y el compromiso celular. Este protocolo permite medir simultáneamente la división y diferenciación a nivel de una sola célula y con un alto rendimiento sin requerir una manipulación compleja y extensa.
Este método es adecuado para cualquier población hematopoyética que pueda mantenerse en cultivo. Por lo tanto, se puede aplicar fácilmente a la biología del cáncer, la inmunología y la biología del desarrollo. Para empezar, alícuota 250 microlitros de la fracción CD34+ igualmente en cuatro tubos de polipropileno de 15 mililitros.
Etiquete los tubos como se describe en el texto manuscrito. Alícuota 250 microlitros de la fracción CD34 en otros cuatro tubos de polipropileno de 15 mililitros y etiquete los tubos. Prepare soluciones CFSE altas y CSFE bajas como se describe en el texto manuscrito.
Agregue 250 microlitros de la solución CFSE alta al tubo CF y CV, 250 microlitros de la solución baja CFSE al tubo VC y 250 microlitros del Medio Águila Modificada de Dulbecco, o DMEM, sin suero bovino fetal, o FBS, al tubo VI. Para garantizar una mezcla eficiente de suspensión celular en tinte celular, incline el tubo 90 grados y deposite las soluciones CFSE en la pared del tubo. Luego, sostenga el tubo verticalmente y mezcle tres o cuatro veces para garantizar una mezcla rápida de las soluciones CFSE con las celdas resuspendidas.
Incubar la suspensión a 37 grados centígrados durante ocho minutos. Después de la incubación, agregue cinco mililitros de DMEM que contengan 10% FBS y coloque los tubos a 37 grados centígrados durante cinco minutos. Gire los tubos a 300 G durante cinco minutos.
Retire el sobrenadante por aspiración sin alterar el pellet y lave el pellet con cinco mililitros de PBS, ETDA. Gire los tubos de nuevo y deseche el sobrenadante antes de volver a suspender el pellet en 40 microlitros de PBS, ETDA. Para teñir las células CD34+, prepare una mezcla maestra de anticuerpos en un solo tubo de 0,5 mililitros.
Agregue siete microlitros de la mezcla maestra de anticuerpos a cada una de las cuatro condiciones CD34 +. Resuspender las células en tampón de tinción utilizando aproximadamente 500 microlitros cada uno para las perlas en células CD34 + y un mililitro para los tubos CD34. Para la ordenación de celdas, establezca la estrategia de compuerta creando diagramas de puntos.
Primero, visualice las celdas en un diagrama de puntos FSCA versus SSCA y haga doble clic en la herramienta de activación de polígonos para seleccionar la población con dispersión lateral baja. Etiquete esta puerta recién creada como Celdas. En el siguiente diagrama de puntos, FSCA versus FSCH, haga clic derecho en el gráfico y seleccione las celdas de la puerta en el menú desplegable haciendo clic en él.
Utilice la misma herramienta de compuerta para seleccionar una población estrecha en la diagonal entre los dos ejes. Etiquete esta puerta como celdas individuales. En el tercer diagrama de puntos, APC versus FSH-H, muestra las células individuales de la población y las celdas son negativas para la expresión del linaje de APC.
Etiquete a esta población recién creada como linaje negativo. En la cuarta gráfica, CFSE versus CTV, muestra la población Linaje Negativo y crea cuatro puertas separadas, una para cada combinación de tinte. La puerta VI se muestra aquí como ejemplo.
Utilice la quinta y sexta gráficas para identificar los progenitores de interés. Generosamente la puerta CD34+CD38-población y CD34+CD38+en la quinta gráfica. Luego, seleccione la población CD34 + CD38 en la sexta gráfica y dibuje tres puertas para LMPP, HSC y MPP.
Ejecute las fracciones CD34+, registrando al menos 5.000 eventos en la puerta de celda única. Ajuste la puerta para cada combinación de tinte, estableciendo una puerta apretada para seleccionar una población homogénea. Prepare la plantilla de clasificación de placas mediante el diseño Ordenación experimental.
Los pozos llamados CD34- contienen 5, 000 a 10, 000 células clasificadas en la puerta CF, CV, VC, VI. Los pocillos a granel contienen 500 células clasificadas en la puerta CD34 + CD38: los pocillos de una sola célula contienen solo un evento por combinación de colorante de división celular por pozo, por lo que cuatro eventos por pozo en total. A continuación, comience clasificando el CD34-CF en modo de pureza de rendimiento.
Haga clic en el botón Adquirir y luego en el botón Ordenar. Haga clic en Adquirir y, a continuación, en el botón Ordenar, asegurándose de haber marcado 0160 como grado de pureza. Finalmente, ordene las celdas de interés, una celda por pocillo, en pureza de celda única, asegurándose de haber marcado la opción Clasificación de índice.
Centrifugar la placa a 300 G durante cinco minutos y retirar el sobrenadante invirtiendo rápidamente la placa debajo de la capucha sobre una toalla de papel. Agregue ocho microlitros de tampón de pie a los pozos A1 a A4, seguido de agregar ocho microlitros de la mezcla a los otros pocillos. Lave las células agregando 100 microlitros de tampón de tinción por pocillo usando una pipeta multicanal.
Centrifugar y retirar el sobrenadante antes de resuspender las células en 85 microlitros de tampón de tinción. Inicie el análisis en el citómetro de flujo en modo de adquisición utilizando la plantilla dedicada y haciendo clic en Personalizado. Después de seleccionar los fluoróforos de interés de la lista, establezca la configuración de la placa siguiendo la plantilla de placa corregida para el número de pocillos que contienen al menos una celda.
Marque la opción Agitación y seleccione 100 microlitros como límite de volumen de adquisición. Luego, establezca la tasa de adquisición no superior a un microlitro por segundo, ya que una velocidad más baja mejora el volumen total analizado por pozo. Para un gating representativo, concatenar los diferentes pozos a granel en un solo archivo.
Después de hacer clic en la opción Concatenar poblaciones, seleccione Todos los parámetros no compensados en el menú Parámetros, luego haga clic en Concatenar. Cargue el archivo concatenado en el espacio de trabajo y, a continuación, aplique la matriz de compensación mediante arrastrar y soltar. Las etiquetas de celdas con CV y VC necesitan un valor transformado.
Haga clic en Herramientas y Derivar parámetro para obtener el valor transformado. Pegue la fórmula indicada en el cuadro de fórmula. Aplique el gating a cada color individualmente como un diagrama de histograma.
Para CF y VI, establezca CFSE-A y CTV-A en el eje X, respectivamente. Para CV y VC, establezca el parámetro recién derivado en el eje X y, a continuación, establezca las puertas correspondientes a cada pico. Aplique el gating a cada célula individual bien.
Asegúrese de agregar el parámetro derivado a cada pozo analizado. Verifique manualmente cada puerta de color para cada pocillo para detectar eventos que se asignan incorrectamente a un pico determinado. El análisis de citometría de flujo después del cultivo celular requiere una activación precisa para establecer el parentesco de cada célula individual junto con el fenotipado celular.
La definición y asignación de picos son aspectos cruciales del análisis de citometría de flujo. Los histogramas muestran dos ejemplos de familias distribuidas en múltiples picos, uno de dos picos de intensidad similares y otro con dos picos de intensidad diferentes. Aquí se muestran diferentes tipos de representación de datos y pruebas estadísticas para dos experimentos separados realizados después de 72 horas para HSC y MPP.
El mapa de calor para la condición de diferenciación HSC representa diferentes familias celulares, tanto en destinos celulares como en divisiones celulares. Aquí se muestra el histograma que compara las familias de células derivadas de HSC y MPP de destino. Para ambos tipos de células, la comparación entre la condición GT y la diferenciación de la condición se muestra junto con las pruebas estadísticas realizadas para los MPP.
Aquí se muestran histogramas que comparan el porcentaje de familias celulares por generación y el tipo de simetría o asimetría en el destino para la primera división. La distribución de destinos por generación para MPP y la diferenciación de condiciones se muestran aquí. Este procedimiento requiere aislar las células a granel para establecer la estrategia de acceso adecuada.
Por lo tanto, es mejor comenzar la tinción con al menos 10, 000 células. La combinación de este método con la medición continua, como la imaginación de células vivas, puede ser muy poderosa, ya que los dos juntos pueden proporcionar una descripción detallada de los primeros progenitores de la dinámica celular. Este enfoque fue desarrollado por primera vez para la biología de células T por los Laboratorios Hopkins.
Esta versión, adaptada para las células madre sanguíneas, ahora se está expandiendo al cáncer y la biología de las células madre.
