Pochi metodi consentono di valutare rapidamente la funzionalità dei progenitori ematopoietici. Questo protocollo misura l'impatto delle prime divisioni cellulari sul destino e sull'impegno cellulare. Questo protocollo consente di misurare simultaneamente la divisione e la differenziazione a livello di singola cella e con elevata produttività senza richiedere manipolazioni complesse ed estese.
Questo metodo è adatto a qualsiasi popolazione ematopoietica che può essere mantenuta in coltura. Quindi può essere facilmente applicato alla biologia del cancro, all'immunologia e alla biologia dello sviluppo. Per cominciare, aliquote 250 microlitri della frazione CD34+in quattro tubi di polipropilene da 15 millilitri.
Etichettare i tubi come descritto nel manoscritto testuale. Aliquot 250 microlitri della frazione CD34 in altri quattro tubi di polipropilene da 15 millilitri ed etichettare i tubi. Preparare soluzioni CFSE alte e CSFE basse come descritto nel manoscritto testuale.
Aggiungere 250 microlitri di soluzione CFSE alta al tubo CF e CV, 250 microlitri di soluzione CFSE bassa al tubo VC e 250 microlitri di Modified Eagle Medium di Dulbecco, o DMEM, senza siero fetale bovino, o FBS, al tubo VI. Per garantire una miscela efficiente di sospensione cellulare nel colorante cellulare, inclinare il tubo di 90 gradi e depositare le soluzioni CFSE sulla parete del tubo. Quindi, tenere il tubo verticalmente e mescolare tre o quattro volte per garantire una rapida miscelazione delle soluzioni CFSE con le celle risospese.
Incubare la sospensione a 37 gradi Celsius per otto minuti. Dopo l'incubazione, aggiungere cinque millilitri di DMEM contenente il 10% di FBS e posizionare i tubi a 37 gradi Celsius per cinque minuti. Girare i tubi a 300 G per cinque minuti.
Rimuovere il surnatante tramite aspirazione senza disturbare il pellet e lavare il pellet con cinque millilitri di PBS, ETDA. Girare nuovamente i tubi e scartare il surnatante prima di risospendere il pellet in 40 microlitri di PBS, ETDA. Per colorare le cellule CD34 +, preparare un mix principale di anticorpi in un singolo tubo da 0,5 millilitri.
Aggiungere sette microlitri dalla miscela principale di anticorpi a ciascuna delle quattro condizioni CD34 +. Risospendere le cellule nel tampone colorante utilizzando circa 500 microlitri ciascuna per le perle nelle celle CD34 + e un millilitro per i tubi CD34. Per l'ordinamento delle celle, impostare la strategia di gating creando diagrammi dot plot.
Innanzitutto, visualizza le celle su un dot plot FSCA rispetto a SSCA e fai doppio clic sullo strumento di gating poligonale per selezionare la popolazione con dispersione laterale bassa. Etichettare questo gate appena creato come Celle. Nel seguente dot plot, FSCA versus FSCH, fare clic con il pulsante destro del mouse sul grafico e selezionare le celle del gate dal menu a discesa facendo clic su di esso.
Utilizzare lo stesso strumento di apertura per selezionare una popolazione stretta sulla diagonale tra i due assi. Etichettare questo gate come celle singole. Nel terzo dot plot, APC versus FSH-H, mostrano le singole cellule della popolazione e controllano le cellule negative per l'espressione del lignaggio APC.
Etichetta questa popolazione appena creata come Lineage Negative. Nel quarto grafico, CFSE contro CTV, mostra la popolazione Lineage Negative e crea quattro porte separate, una per ogni combinazione di coloranti. Il Gate VI è mostrato qui come esempio.
Usa il quinto e il sesto grafico per identificare i progenitori di interesse. Eliminare generosamente la popolazione CD34 + CD38 e CD34 + CD38 + nel quinto appezzamento. Quindi, selezionare la popolazione CD34+CD38 nel sesto grafico e disegnare tre porte per LMPP, HSC e MPP.
Eseguire le frazioni CD34+, registrando almeno 5.000 eventi nella porta a cella singola. Regolare il cancello per ogni combinazione di coloranti, impostando un cancello stretto per selezionare una popolazione omogenea. Preparate il modello di ordinamento delle piastre utilizzando il layout Ordinamento esperimento.
I pozzetti denominati CD34 contengono da 5.000 a 10.000 cellule ordinate sul cancello CF, CV, VC, VI. I pozzetti di massa contengono 500 cellule ordinate sul gate CD34 + CD38-I pozzetti a cella singola contengono solo un evento per combinazione di coloranti di divisione cellulare per pozzetto, quindi quattro eventi per pozzetto in totale. Quindi, iniziare con l'ordinamento del CD34-CF in modalità Yield Purity.
Fare clic sul pulsante Acquisisci e quindi sul pulsante Ordina. Fai clic su Acquisisci, quindi sul pulsante Ordina, assicurandoti di aver spuntato 0160 come grado di purezza. Infine, ordina le celle di interesse, una cella per pozzetto, in purezza a cella singola, assicurandoti di aver spuntato l'opzione Index Sorting.
Centrifugare la piastra a 300 g per cinque minuti e rimuovere il surnatante capovolgendo rapidamente la piastra sotto il cappuccio su un tovagliolo di carta. Aggiungere otto microlitri di tampone permanente ai pozzetti da A1 ad A4, seguiti dall'aggiunta di otto microlitri della miscela agli altri pozzi. Lavare le celle aggiungendo 100 microlitri di tampone colorante per pozzetto utilizzando una pipetta multicanale.
Centrifugare e rimuovere il surnatante prima di risospendere le cellule in 85 microlitri di tampone colorante. Avviare l'analisi sul citometro a flusso in modalità Acquisizione utilizzando il template dedicato e cliccando su Personalizzato. Dopo aver selezionato i fluorofori di interesse dall'elenco, impostare l'impostazione della piastra seguendo il modello di piastra corretto per il numero di pozzetti contenenti almeno una cella.
Spuntare l'opzione Agitazione e selezionare 100 microlitri come limite del volume di acquisizione. Quindi, impostare la velocità di acquisizione non superiore a un microlitro al secondo, poiché una velocità inferiore migliora il volume totale analizzato per pozzetto. Per il gating rappresentativo, concatenare i diversi pozzi sfusi in un unico file.
Dopo aver cliccato sull'opzione Concatena popolazioni, selezionare Tutti i parametri non compensati dal menu Parametri, quindi fare clic su Concatena. Caricare il file concatenato nell'area di lavoro, quindi applicare la matrice di compensazione tramite trascinamento della selezione. Le etichette delle celle con CV e VC necessitano di un valore trasformato.
Fare clic su Strumenti e Deriva parametro per ottenere il valore trasformato. Incollare la formula indicata nella casella della formula. Applicare il gating a ciascun colore singolarmente come grafico di istogramma.
Per CF e VI, impostare CFSE-A e CTV-A rispettivamente sull'asse X. Per CV e VC, impostare il parametro appena derivato sull'asse X, quindi impostare le porte corrispondenti a ciascun picco. Applicare il gating a ogni singola cella bene.
Assicurati di aggiungere il parametro derivato a ogni pozzo analizzato. Verificate manualmente ogni porta colore per ogni pozzetto per rilevare gli eventi assegnati in modo errato a un determinato picco. L'analisi della citometria a flusso dopo coltura cellulare richiede un gating preciso per stabilire la parentela di ogni singola cellula insieme alla fenotipizzazione cellulare.
La definizione e l'assegnazione dei picchi sono aspetti cruciali dell'analisi della citometria a flusso. Gli istogrammi mostrano due esempi di famiglie distribuite su più picchi, uno dei due picchi di intensità simili e uno con due diversi picchi di intensità. Diversi tipi di rappresentazione dei dati e test statistici sono mostrati qui per due esperimenti separati eseguiti dopo 72 ore per HSC e MPP.
La mappa di calore per la differenziazione delle HSC rappresenta diverse famiglie cellulari, sia nel destino cellulare che nelle divisioni cellulari. L'istogramma che confronta le famiglie cellulari derivate da HSC e MPP del destino è mostrato qui. Per entrambi i tipi di cellule, il confronto tra la condizione GT e la differenziazione della condizione viene visualizzato insieme ai test statistici eseguiti per MPP.
Qui sono mostrati istogrammi che confrontano la percentuale di famiglie cellulari per generazione e il tipo di simmetria o asimmetria nel destino per la prima divisione. La distribuzione dei destini per generazione per i MPP e la differenziazione delle condizioni sono mostrati qui. Questa procedura richiede di isolare le celle in blocco per impostare la strategia di gating appropriata.
È quindi meglio iniziare la colorazione con almeno 10.000 cellule. La combinazione di questo metodo con la misurazione continua, come l'immaginazione delle cellule vive, può essere molto potente, poiché i due insieme possono fornire una descrizione dettagliata dei primi progenitori della dinamica cellulare. Questo approccio è stato sviluppato per la prima volta per la biologia delle cellule T dagli Hopkins Labs.
Questa versione, adattata per le cellule staminali del sangue, si sta ora espandendo al cancro e alla biologia delle cellule staminali.
