برزت وبائيات المياه ومياه الصرف الصحي كطريقة بديلة لرصد مسار الفاشيات في المجتمعات والتنبؤ بها. تمثل طريقة تلبد الحليب منزوع الدسم طريقة بديلة لتركيز الميكروبات. تمثل طريقة تلبد الحليب منزوع الدسم طريقة متعددة الاستخدامات ورخيصة وسهلة لتركيز الكسور الميكروبية دون اختلافات كبيرة مقارنة بأساليب الترشيح الفائق أو ترشيح التدفق العرضي.
يستخدم هذا النهج في علم الميتاجينوميات أو دراسات تفاعل البوليميراز المتسلسل المستهدفة. بمجرد تركيز الكسور الميكروبية ، يمكن إجراء استخراج الحمض النووي باستخدام مجموعات الاستخراج التجارية أو البروتوكول الداخلي. طريقة تلبد الحليب منزوع الدسم أسهل نسبيا لكميات كبيرة أو صغيرة من عينات المياه أو مياه الصرف الصحي.
يجب تضمين عنصر تحكم في الخلفية باستخدام ماء Milli-Q كجزء من هذه الطريقة. سيوضح الإجراء قادر ياناك ، جانيل فرانسيس ، وجوسلين زامبرانو ألفارادو ، طلاب الدراسات العليا من مختبر ميغيل أوياغواري. للبدء ، اجمع لترين من عينات مياه الصرف الصحي الخام المركبة المتناسبة على مدار 24 ساعة.
نقل العينات إلى المختبر في زجاجات مقاومة للضوء في صندوق ثلج ومعالجتها في غضون 24 ساعة. احصل على بيانات خصائص مياه الصرف الصحي من الموظفين الفنيين لمحطة معالجة مياه الصرف الصحي. لكل طريقة ترشيح فائقة ، قم برفع خمس مرات 10 إلى النسخ الرابعة من الحمض النووي الريبي المدرع إلى 140 ملليلتر من كل عينة من عينات مياه الصرف الصحي العذبة الست التي تم جمعها في تاريخ واحد وست عينات من مياه الصرف الصحي العذبة في تاريخ آخر.
تجانس الحمض النووي الريبي المدرع في العينة عن طريق التقليب لمدة 30 دقيقة عند أربع درجات مئوية على تحريك مغناطيسي. لتلبد الحليب منزوع الدسم أو SMF ، قم بإعداد محلول حليب منزوع الدسم بنسبة 1٪ عن طريق إذابة 0.5 جرام من مسحوق الحليب منزوع الدسم في 50 مل من مياه البحر الاصطناعية. اضبط الرقم الهيدروجيني ل SMF على 3.5 باستخدام حمض الهيدروكلوريك العادي الواحد.
أضف خمسة ملليلتر من محلول الحليب منزوع الدسم إلى 500 ملليلتر من عينة مياه الصرف الخام. حرك العينة لمدة ثماني ساعات واترك القطعان المشكلة تستقر لمدة ثماني ساعات أخرى في درجة حرارة الغرفة. قم بإزالة المادة الطافية باستخدام ماصة مصلية دون إزعاج القطعان المستقرة.
نقل حجم نهائي من 50 ملليلتر يحتوي على القطعان إلى أنبوب الطرد المركزي وأجهزة الطرد المركزي في 8،000 G لمدة 30 دقيقة عند أربع درجات مئوية. قم بإزالة المادة الطافية وقم بإزالة الحبيبات بعناية باستخدام ملعقة معقمة. أعد تعليق الحبيبات المتبقية في 250 ميكرولتر من 0.2 مول فوسفات الصوديوم.
انقل الكريات المكشطة والمعاد تعليقها إلى نفس أنبوب الطرد المركزي الصغير سعة 1.5 ملليلتر. قم بإجراء استخراج الحمض النووي الريبي الفيروسي من المركزات الفيروسية لعينات مياه الصرف الصحي وفحوصات كفاءة الاسترداد باستخدام مجموعة استخراج الحمض النووي الريبي بنسبة 25: 24: 2: 1 من الفينول إلى الكلوروفورم إلى كحول الأيزو أميل وبيتا ميركابتوإيثانول وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. أخيرا ، قم بإزالة الحمض النووي الريبي في 50 ميكرولتر من المخزن المؤقت للشفط.
لتحليل RT-qPCR ، قم بقياس الحمض النووي الريبي المدرع باستخدام تخفيفات عشرة أضعاف لحمض نووي اصطناعي واحد تقطعت به السبل أو بنية gBlock. احصل على منحنيات المعايرة لكل تشغيل RT-qPCR. قم بتضمين عناصر تحكم سلبية وقم بتشغيل العينات في ثلاث نسخ.
جمع 10 لترات من عينة المياه السطحية البيئية. قم بتضمين 10 لترات من الماء منزوع الأيونات للتحكم في الخلفية. قم بإجراء ترشيح الكبسولة والفراغ باستخدام مرشحات قرص الغشاء بأحجام 0.45 و 0.2 و 0.1 ميكرون لتقليل الضوضاء أثناء تسلسل metagenomics.
بعد الترشيح ، اضبط الرقم الهيدروجيني لعينة الماء إلى 3.5 باستخدام حمض الهيدروكلوريك العادي الواحد. تحضير 1٪ محلول حليب منزوع الدسم قبل التلبد وضبط الرقم الهيدروجيني إلى 3.5. أضف 100 ملليلتر من محلول الحليب منزوع الدسم المحمض إلى 10 لترات من عينة المياه البيئية المحمضة.
حرك العينة لمدة ثماني ساعات في درجة حرارة الغرفة على شاكر مغناطيسي واترك القطعان تترسب عن طريق الجاذبية لمدة ثماني ساعات إضافية. بعد الاستقرار ، قم بإزالة المادة الطافية بعناية باستخدام مضخة تفريغ دون إزعاج القطعان. القسمة وتوازن القطعان المتبقية وفقا للوزن في أنبوب الطرد المركزي 50 ملليلتر وأجهزة الطرد المركزي.
قم بإزالة المادة الطافية وحل الحبيبات في 200 ميكرولتر من محلول فوسفات الصوديوم 0.2 مولار. عالج الكريات الذائبة باستخدام DNase I و RNase A باتباع تعليمات الشركة المصنعة للتخلص من الحمض النووي والحمض النووي الريبي الحر أثناء عملية الاستخراج. بعد الحضانة ، قم بتعطيل DNase I و RNase A.استخرج الأحماض النووية من الحبيبات الذائبة باستخدام مجموعة استخراج الحمض النووي أو الحمض النووي الريبي.
تحديد الكمية الإجمالية للحمض النووي أو الحمض النووي الريبي المستخرج من عينة المياه السطحية البيئية باستخدام مقياس الفلور. إجراء تحليل qPCR لاستهداف الفيروسات المعوية ذات الأهمية وتسلسل Illumina لتحديد بنية المجتمع الفيروسي. اجمع لترين من عينات المياه من المجاري المائية المحمية والمتأثرة.
إذا كانت العينة تحتوي على حطام كبير ، فاستخدم القماش القطني لإزالتها. أضف 20 ملليلترا من محلول الحليب منزوع الدسم بنسبة 1٪ إلى عينة المياه العذبة المعدلة مسبقا بسعة 2 لتر. حرك العينة لمدة ثماني ساعات في درجة حرارة الغرفة واترك القطعان تترسب عن طريق الجاذبية لمدة ثماني ساعات إضافية.
بعد الاستقرار ، قم بإزالة المادة الطافية بعناية باستخدام مضخة تمعجية. نقل القطعان المترسبة إلى أنبوب طرد مركزي سعة 50 ملليلتر وجهاز طرد مركزي عند 8،000 جم لمدة 30 دقيقة عند أربع درجات مئوية. تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق الكريات في 200 ميكرولتر من 0.2 مول فوسفات الصوديوم.
حدد حوالي 0.5 جرام من القطيع لاستخراج الحمض النووي باستخدام مجموعة عزل الحمض النووي التي تختارها باتباع تعليمات الشركة المصنعة. تحديد تركيز الحمض النووي ونقاوته باستخدام مقياس الفلورومتر. كانت جميع العينات الست التي تمت معالجتها باستخدام الترشيح الفائق عند 3،000 جم إيجابية.
في المقابل ، كانت عينة واحدة فقط إيجابية عندما تمت معالجة العينات بالترشيح الفائق عند 7،500 G.جميع العينات التي تمت معالجتها باستخدام SMF كانت إيجابية وأدت إلى استرداد أفضل. كان متوسط معدلات الاسترداد 3،000 G و SMF أعلى بشكل ملحوظ وثابت من الترشيح الفائق عند 7،500 G.تم تلخيص معلمات جودة المياه في العينات المتأثرة والأحماض النووية المستخرجة من عينات المياه البيئية التي تم جمعها داخل Winnipeg عبر ثلاثة مواسم هنا. أسفرت العينات التي تم جمعها من أبريل إلى أكتوبر 2022 من مياه نهر Assiniboine عن أعلى تركيز للحمض النووي من Forested 1 وتم استرداد أقل تركيز من الموقع الزراعي الثالث.
من المهم جدا استخدام التركيز الصحيح من الحليب منزوع الدسم وتحمض العينة قبل الاستخدام. يمكن أن توفر هذه التقنية فحصا سريعا لمسببات الأمراض الميكروبية المختلفة الموجودة في العينات البيئية مثل المياه ومياه الصرف الصحي. يمكن تنفيذ تعديلات إضافية باستخدام المصفوفات الصلبة مثل التربة أو الرواسب.
