فيروس الهربس البسيط Oncolytic هو شكل ناشئ من العلاج المناعي للسرطان. إن وجود نظام فعال لنشر الفيروس وتنقية وتحديده بالتأليه أمر بالغ الأهمية للاستخدام في الدراسات التجريبية. هذه الطريقة بسيطة جدا ويمكن اعتمادها بسهولة في أي مستوى السلامة البيولوجية اثنين من إعداد المختبر لتلقي مخزون الفيروسية عالية الجودة للدراسات ما قبل السريرية.
إنتاج عالية الجودة، والمخزون الفيروسي النقي أمر بالغ الأهمية لأنه يستخدم لدراسة الاستجابة المناعية المضادة للسرطان وتطوير شكل جديد من العلاج المناعي السرطان القائم على الفيروس. يمكن استخدام هذا البروتوكول لتنقية أي نوع البرية أو فيروس الهربس البسيط المعدلة وراثيا. يجب أن يكون هذا البروتوكول سهلة القراءة وسهلة المتابعة للفرد الذي لم يسبق له تنفيذ هذه التقنية من قبل.
يجب أن تكون المواد والكواشف المذكورة في مكانها قبل تجربة هذه التقنية لأول مرة. ابدأ بغسل قوارير T-150 سم مربع مع جلوكوز DPBS مرتفع مرتين مع تكملة 1٪ IFCS. أسبيرات DPBS وإضافة سبعة ملليلتر من الفيروس inoculum لكل قارورة.
يهز بلطف قوارير لمدة خمس دقائق واحتضان في 37 درجة مئوية لمدة 1.5 إلى 2 ساعة. ثم قم بإزالة inoculum وإضافة 25 ملليلتر من DMEM تكملها مع 1٪ IFCS إلى كل قارورة. بعد الحضانة عند 37 درجة مئوية و 5٪ من ثاني أكسيد الكربون لمدة يومين إلى أربعة أيام، اجمع 20 ملليلتر من الناطقة الثقافية من كل قارورة إلى 50 أنبوب طرد مركزي ملليلتر.
باستخدام مكشطة الخلية، كشط الخلايا من أسفل القوارير. إضافة ما يقرب من 15 ملليلتر من الثقافة التي تم جمعها سابقا supernatant إلى كل قارورة لجعل حجم يصل إلى 20 ملليلتر، ثم استخدام ماصة المصلية العقيمة 10 ملليلتر لغسل بلطف الجزء السفلي من القوارير عدة مرات. جمع الخلايا مع المتوسطة في 50 ملليلتر أنابيب الطرد المركزي المخروطية وضعت على الجليد.
طرد الأنابيب في 300 مرة G لمدة 10 دقائق في أربع درجات مئوية. Resuspend كل بيليه تماما في 1.25 ملليلتر من الفيروس العازلة، أو VB، و 1.25 ملليلتر من الثقافة التي تم جمعها سابقا supernatant. اخلط جميع الكريات التي أعيد إنفاقها في أنبوب طرد مركزي مخروطي واحد 50 ملليلتر.
المفاجئة تجميد الخلايا التي أعيد إنفاقها باستخدام الجليد الجاف والإيثانول 100٪ وتخزينها في ناقص 80 درجة مئوية. إذابة الخلايا المجمدة قطعت سابقا في حمام مائي دافئ في 37 درجة مئوية و sonicate لمدة دقيقة واحدة لمدة ثلاث دورات في حمام مائي. إضافة 175 وحدة من نواة البنزوناسي واثنين من ميكرولتر من اثنين من كلوريد المغنيسيوم ملليمولار لكل ملليلتر من ليسات الخلية ودوامة.
بعد حضانة لمدة 30 دقيقة وحمام مائي دافئ عند 37 درجة مئوية ، ضع الأنبوب على الجليد. تدور الخلية lysate في 300 مرة G لمدة 10 دقائق. جمع supernatant في أنبوب طرد مركزي مخروطي 50 ملليلتر جديدة وإعادة إنفاق بيليه الخلية في 500 ميكرولتر من VB. تعيينها على أنها بيليه واحد.
تدور supernatant التي تم جمعها مرة أخرى في 500 مرة G لمدة 10 دقائق وتخزين supernatant بشكل منفصل في أنبوب طرد مركزي مخروطي الطازجة 50 ملليلتر لاستخدامها في وقت لاحق. Resuspend بيليه الخلية في 500 ميكرولتر من VB، وتعيينه على أنه بيليه اثنين. الجمع بين بيليه resuspended واحد و بيليه اثنين في أنبوب الطرد المركزي 1.75 ملليلتر جديدة ودوامة و sonicate مرتين في حمام مائي قبل الغزل الأنابيب في 400 مرة G لمدة 10 دقائق.
جمع supernatant من أنبوب الطرد المركزي 1.7 ملليلتر والجمع بين ذلك مع supernatant جمعت سابقا 50 ملليلتر أنبوب الطرد المركزي المخروطي. تصفية supernatant من خلال مرشح غشاء PVDF خمسة ميكرومتر معقمة في أنبوب طرد مركزي جديد 50 ملليلتر يسمى أنبوب واحد. أضف ملليلتر واحد من VB إلى أنبوب الطرد المركزي 50 ملليلتر ، أفرغ بعد تصفية الفائق من الخطوة السابقة ، دوامة ، وتمريره من خلال نفس مرشح غشاء PVDF الموضوع على الأنبوب الأول.
تمرير filtrate من أنبوب واحد من خلال عقيمة 0.8 ميكرومتر MCE مرشح الغشاء وضعت على أنبوب طرد مركزي 50 ملليلتر جديدة تسمى أنبوب اثنين. إضافة ملليلتر واحد من VB إلى أنبوب واحد إفراغ، دوامة، وتمريره من خلال مرشح MCE نفسه وضعت على أنبوب اثنين. تمرير filtrate من أنبوب اثنين من خلال معقمة 0.45 ميكرومتر PVDF مرشح وضعت على أنبوب طرد مركزي 50 ملليلتر جديدة وصفت أنبوب ثلاثة.
كما هو موضح من قبل، كرر غسل أنبوب اثنين مع ملليلتر واحد من VB لإضافة filtrate إلى أنبوب ثلاثة. في هذا التحليل التمثيلي ، يمكن ملاحظة التأثير الباثوتي في خلايا Vero في 36 و 48 و 72 ساعة بعد عدوى oHSV مع تقريب الخلايا المصابة. مستوى متزايد من CPE مع مرور الوقت واضح كما تصور من قبل التعبير mCherry.
في 72 ساعة بعد العدوى ، كانت ملطخة لويحات الفيروسية مع X - غال لتصور oHSVs مع التعبير lacZ. تنقية بلطف قبالة الخلايا المصابة بالفيروس وغسل بلطف الجزء السفلي على القارورة أمر بالغ الأهمية للحفاظ على جميع الخلايا المصابة HSV سليمة بحيث يمكن الحصول على مخزون الفيروسية التيتر عالية.
