يتعرض الوريد الصافن فجأة لأمراض الشرايين بعد جراحة مجازة الشريان التاجي. قد يساعد فهم استجابة التكيف مع الإجهاد الميكانيكي في تصميم أدوات علاجية لمنع فشل ترقيع الوريد. بروتوكول عزل الخلايا البطانية هذا بسيط للغاية ولا يتطلب سوى الحضانة باستخدام كولاجيناز.
مع الحد الأدنى من التلاعب بالأوعية الدموية ، يؤدي ذلك إلى تقليل التلوث بخلايا العضلات الملساء والخلايا الليفية. يعد بروتوكول عزل SVECs البشرية واستزراعتها تحت إجهاد القص والتمدد الدوري ضروريا لفهم مساهمة القوى الميكانيكية في خلل الخلايا البطانية المرتبط بفشل ترقيع الوريد الصافن. إن زراعة الخلايا البطانية السابقة تتطلب الكثير من حيث مكملات وسائط الخلية.
من الضروري إضافة عوامل النمو لعزل الثقافة بنجاح ، SVECs البشرية. لعزل الخلايا البطانية للوريد الصافن البشري الأولي أو الخلايا الجذعية الصافنة البشرية ، اجمع ما لا يقل عن مقطع وريد صافن بطول 2 إلى 3 سنتيمترات. العمل تحت غطاء تدفق رقائقي معقم ، انقل جزء الوريد إلى طبق بتري مملوء ب PBS المسخن مسبقا.
لإزالة كل الدم من داخل التجويف ، أدخل طرف ماصة متصلا بماصة ومليئة ب PBS في أحد طرفي الوريد واغسله برفق. اغسله حتى يصبح تدفق الغسيل واضحا تماما. ثم أغلق أحد طرفي الوريد بخياطة قطنية معقمة.
املأ الوعاء بعناية بملليغرام واحد لكل محلول كولاجيناز من النوع 2 ملليلتر وأغلق الطرف الآخر من الوعاء بخياطة قطنية. احتضان الوعاء بمحلول كولاجيناز في جو مرطب من 5٪ ثاني أكسيد الكربون عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة. ثم اقطع أحد طرفي الوعاء فوق أنبوب سعة 15 ملليلتر لجمع محلول كولاجيناز قبل قطع الطرف الآخر.
اغسل السطح اللمعي بواحد إلى ملليلتر من PBS لجمع كل الخلايا البطانية المنفصلة داخل الأنبوب باستخدام كولاجيناز. جهاز طرد مركزي الأنبوب عند 400 جرام في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق. بعد إزالة المادة الطافية ، أعد تعليق حبيبات الخلية في ثلاثة إلى أربعة ملليلتر من وسط الخلية البطانية الكامل الذي يحتوي على محلول هيبارين إضافي.
طبق الخلايا في طبق زراعة الخلايا 60 ملم مغلفة مسبقا بوزن 3٪ لكل حجم جيلاتين. احتضان الخلايا في جو مرطب لمدة أربعة أيام دون تغيير الوسط. بعد ذلك ، قم بتغيير الوسط كل يوم دون إضافة مكملات الهيبارين.
افحص اللوحة تحت المجهر للتأكد من إزالة خلايا الدم الحمراء. بعد يوم إلى أربعة أيام بعد الاستخراج ، اعتمادا على حجم وقطر جزء الوريد ، تصور SVECs البشرية عن طريق الفحص المجهري لتباين الطور لتقييم درجة التقاء ومورفولوجيا الحصى. استمر في تغيير الوسائط كل يومين حتى تصل الخلايا إلى التقاء 70٪ إلى 80٪.
قم بتغطية شريحة غرفة التدفق بوزن 0.1٪ لكل حجم جيلاتين واحتضانها لمدة 30 دقيقة على الأقل عند 37 درجة مئوية. لتحقيق التوازن بين الوحدة السائلة ومجموعة التروية المعقمة التي تحتوي على خزانات 10 ملم ، احتضان تلك الخزانات طوال الليل في جو مرطب. بالنسبة لتجربة إجهاد القص ، تم تعليق 200،000 خلية بطانية في 100 ميكرولتر من وسط الاستزراع في شريحة غرفة التدفق المطلية بالجيلاتين.
لربط الخلايا بسطح الثقافة ، احتضان الخلايا لمدة أربع ساعات. ضع مجموعة التروية على الوحدة السائلة. املأ الخزانات ومجموعة التروية بحوالي 12 ملليلترا من وسط الخلية البطانية الكاملة التي تم تسخينها مسبقا.
قم بإزالة فقاعات الهواء من مجموعة التروية لموازنة مستوى كلا الخزانين عند خمسة ملليلتر. ضع الوحدة السائلة على مجموعة التروية المركبة بدون شريحة الغرفة في الحاضنة وقم بتوصيل الكابل الكهربائي بالمضخة التي ينظمها الكمبيوتر. من خلال تشغيل البروتوكول المحدد مسبقا في برنامج التحكم في المضخة ، قم بإزالة جميع فقاعات الهواء من الخزانات ومجموعة التروية.
خذ الوحدة السائلة مع ضبط التروية المركبة على غطاء التدفق الصفحي وأرفق الشرائح التي تحتوي على طبقة أحادية لخلية التقاء. بعد وضع الوحدة بأكملها مع الشرائح في الحاضنة ، قم بتوصيل الكابل الكهربائي بالمضخة. في برنامج التحكم في المضخة ، اضبط إعداد الوحدة السائلة عن طريق تحديد نوع الشريحة وضبط لزوجة الوسيط.
في معلمات التدفق، أدخل قيمة إجهاد القص واضبط مدة الدورة ونوع التدفق. ثم انقر فوق زر التشغيل لبدء التجربة. تذكر الحفاظ على الشريحة مع الخلايا المعالجة بنفس الوسائط دون التعرض للتدفق كعناصر تحكم ثابتة.
ضع مادة تشحيم قائمة على السيليكون على قمم وجوانب محطة التحميل المتوازنة المحورية 25 ملم 6 آبار. البذور 400،000 خلية معلقة في ثلاثة ملليلتر لكل بئر من ألواح الاستزراع ذات القاع المرن ذات 6 بئر المغلفة بالكولاجين. احتضان الخلايا في الهواء المرطب حتى تصل إلى التقاء 100٪.
قبل البدء في بروتوكول التمدد ، اغسل الخلايا مرة واحدة باستخدام برنامج تلفزيوني تم تسخينه مسبقا وأضف ثلاثة ملليلتر من وسط الثقافة الطازج لكل بئر. أدخل لوحة القاعدة مع جميع محطات التحميل المشحمة في الحاضنة وقم بتوصيل الأنبوب بشكل مناسب بمعدات التحكم في نظام المفاعل الحيوي لتمديد خلية التوتر. قم بتوصيل كل لوحة ثقافة بحشية حمراء واحدة يوفرها نظام المفاعل الحيوي.
ثم ضعها في لوحة القاعدة في الحاضنة. ضع جميع لوحات الاستزراع الأربعة في لوحة القاعدة لتحقيق الفراغ المناسب وحمل التمدد. قم بتشغيل معدات التحكم ونظام الكمبيوتر.
افتح برنامج التحكم FlexCell وقم بتكوين النظام المطلوب بما في ذلك النسبة المئوية للاستطالة وشكل الموجة والتردد والوقت. احفظ النظام. قم بتشغيل نظام الفراغ ، ثم حدد النظام وانقر فوق ابدأ على شاشة الكمبيوتر لتشغيل التمدد.
تأكد من أن غشاء السيليكون يتحرك ويمتد الخلايا. يمكن ملاحظة الخلايا البطانية الملتصقة بعد 4 إلى 10 أيام من الاستخراج. وهي تشكل في البداية مجموعات خلايا تعرض مورفولوجيا نموذجية مرصوفة بالحصى.
أعربوا عن علامات EC CD31 و VE-cadherin. يتم استزراع hSVECs عند استزراعها تحت ضغط القص في اتجاه التدفق. إن إجهاد القص البالغ 20 داين لكل سنتيمتر مربع لمدة 72 ساعة يحفز التعبير عن الجينات الميكانيكية النموذجية الحساسة ، KLF2 و KLF4 و NOS3 ، مما يشير إلى فعالية حافز القص.
تعتمد نتيجة التمدد الدوري على الشدة المطبقة على SVECs البشرية. أظهرت الخلايا تحت التمدد المنخفض نمط F-actin القشري مشابه للخلايا الثابتة. بدون تغيير في إطلاق أكسيد النيتريك لمدة تصل إلى 72 ساعة ، أعادت مستويات تمدد الشرايين لدينا تشكيل الهيكل الخلوي للأكتين بعد 24 ساعة وانخفضت عدم الإطلاق بعد 72 ساعة.
إلى جانب دراسات الإجهاد الميكانيكي ، يمكن للباحثين استخدام الخلايا المعزولة لأداء طرق مختلفة لتوسيع المعرفة بوظيفة الخلية البطانية والخلل الوظيفي. باتباع البروتوكول الموضح ، من الممكن دراسة أي نوع آخر من الخلايا البطانية تحت إجهاد القص والتمدد.
