伏在静脈は、冠状動脈バイパス手術後に突然動脈状態にさらされます。機械的ストレスに対するその適応応答を理解することは、静脈移植不全を予防するための治療ツールの設計に役立つ可能性があります。この内皮細胞単離プロトコルは非常にシンプルで、コラゲナーゼとのインキュベーションのみが必要です。
最小限の血管操作で、平滑筋細胞や線維芽細胞による汚染が減少します。ヒトSVECを単離し、せん断応力および周期的伸展下で培養するためのプロトコルは、伏在静脈移植不全に関連する内皮細胞機能障害における機械力の寄与を理解するために不可欠です。以前の内皮細胞培養は、細胞培地の補充に関して非常に要求が厳しい。
培養物であるヒトSVECをうまく分離するには、成長因子を追加することが必須です。初代ヒト伏在静脈内皮細胞またはヒトSVECを単離するために、少なくとも2〜3センチメートルの長さの伏在静脈セグメントを収集します。滅菌層流フードの下で作業し、静脈セグメントを予熱したPBSで満たされたペトリ皿に移します。
内腔の内側からすべての血液を取り除くには、ピペットに取り付けられ、PBSで満たされたピペットチップを静脈の一端に挿入し、静かに洗い流します。洗浄の流れが完全に透明になるまで洗い流します。次に、滅菌綿縫合糸で静脈の一端を閉じます。
容器に1ミリリットルあたり1ミリグラムのコラゲナーゼ2型溶液を慎重に満たし、容器のもう一方の端を綿縫合糸で閉じます。容器をコラゲナーゼ溶液とともに、5%二酸化炭素、摂氏37度の加湿雰囲気中で1時間インキュベートします。次に、15ミリリットルのチューブで容器の一方の端を切断し、もう一方の端を切断する前にコラゲナーゼ溶液を収集します。
管腔表面を1〜2ミリリットルのPBSで洗い流し、チューブ内の剥離した内皮細胞をすべてコラゲナーゼで収集します。チューブを室温で400Gで5分間遠心分離します。上清を除去した後、追加のヘパリン溶液を含む3〜4ミリリットルの完全内皮細胞培地に細胞ペレットを再懸濁する。
体積あたり3%重量ゼラチンでプレコートされた60mmの細胞培養皿に細胞をプレートします。培地を変更せずに加湿雰囲気中で4日間細胞をインキュベートします。その後、ヘパリンの補給を加えずに一日おきに培地を交換してください。
顕微鏡でプレートを調べて、赤血球が除去されたことを確認します。抽出後1〜4日後、静脈セグメントのサイズと直径に応じて、位相差顕微鏡でヒトSVECを視覚化し、合流の程度とその玉石の形態を評価します。細胞が70%から80%のコンフルエントに達するまで、2日ごとに培地を交換し続けます。
フローチャンバースライドを体積あたり0.1%重量ゼラチンでコーティングし、摂氏37度で少なくとも30分間インキュベートします。10ミリメートルリザーバを有する流体ユニットと滅菌灌流セットとを平衡化するために、それらを加湿雰囲気中で一晩インキュベートする。せん断応力実験のために、100マイクロリットルの培養液に懸濁した200, 000個の内皮細胞をゼラチンコートフローチャンバースライドに播種した。
細胞を培養表面に付着させるには、細胞を4時間インキュベートします。灌流セットを流体ユニットに配置します。リザーバーおよび灌流セットに、約12ミリリットルの予め温めた完全内皮細胞培地を充填する。
灌流セットから気泡を取り除き、両方のリザーバーのレベルを5ミリリットルで平衡化します。インキュベーター内のチャンバースライドなしで、取り付けられた灌流セットに流体ユニットを置き、その電気ケーブルをコンピューター制御ポンプに接続します。ポンプ制御ソフトウェアで事前定義されたプロトコルを実行して、リザーバーと灌流セットからすべての気泡を取り除きます。
灌流を層流フードにセットした流体ユニットを取り、コンフルエンスセル単層を有するスライドを取り付けます。スライド付きのユニット全体をインキュベーターに入れた後、その電気ケーブルをポンプに接続します。ポンプ制御ソフトウェアで、スライドの種類を選択し、媒体の粘度を設定して、流体ユニットのセットアップを調整します。
[流れパラメータ]で、せん断応力値を入力し、サイクル期間と流れタイプを設定します。次に、再生ボタンをクリックして実験を開始します。静的コントロールとして流れにさらされることなく、同じ培地で処理された細胞でスライドを維持することを忘れないでください。
シリコーンベースの潤滑剤を25ミリメートルの6ウェル等二軸ローディングステーションの上部と側面に塗布します。種子400, 000細胞をコラーゲン1でコーティングした6ウェルフレキシブルボトム培養プレートの各ウェルに3ミリリットルで懸濁した。細胞が100%コンフルエントに達するまで加湿空気中でインキュベートします。
ストレッチプロトコルを開始する前に、予め温めたPBSで細胞を1回洗浄し、ウェルあたり3ミリリットルの新鮮な培地を加えます。すべての潤滑ローディングステーションを備えたベースプレートをインキュベーターに挿入し、チューブをテンションセルストレッチバイオリアクターシステムのコントローラー機器に適切に接続します。各培養プレートをバイオリアクターシステムが提供する1つの赤いガスケットに取り付けます。
それからそれらをインキュベーターのベースプレートに入れます。4つの培養プレートすべてをベースプレートに配置して、適切な真空と伸張荷重を実現します。コントローラ機器とコンピュータシステムの電源を入れます。
FlexCell制御ソフトウェアを開き、伸び率、波形形状、周波数、時間など、目的のレジメンを設定します。レジメンを保存します。真空システムの電源を入れ、レジメンを選択し、コンピューター画面で[開始]をクリックしてストレッチを実行します。
シリコーン膜が細胞を動かして伸ばしていることを確認します。接着した内皮細胞は抽出後4〜10日目に観察できた。それらは最初に典型的な石畳の形態を示す細胞クラスターを形成します。
ECマーカーCD31およびVEカドヘリンを発現させた。剪断応力下で培養した場合のhSVECsは流れの方向に整列した。20ダイン/平方センチメートルのせん断応力を72時間行うことで、代表的な機械感受性遺伝子であるKLF2、KLF4、NOS3の発現が誘導され、せん断刺激の有効性が示唆された。
周期的伸展の結果は、ヒトSVECに加えられた強度に依存した。低伸長下の細胞は、静的細胞と同様の皮質F-アクチンパターンを示した。最大72時間一酸化窒素放出の変化なしに、私たちの動脈レベルのストレッチは24時間後にアクチン細胞骨格を再構築し、72時間後にNO放出を減少させました。
機械的ストレスの研究に加えて、研究者は単離された細胞を使用して、内皮細胞の機能と機能障害に関する知識を拡大するためのさまざまな方法を実行できます。実証されたプロトコルに従って、せん断応力および伸張下で他のタイプの内皮細胞を研究することが可能です。
