A veia safena é subitamente exposta a condições arteriais após cirurgia de revascularização miocárdica. A compreensão de sua resposta adaptativa ao estresse mecânico pode auxiliar no desenho de ferramentas terapêuticas para prevenir a falência do enxerto venoso. Este protocolo de isolamento de células endoteliais é muito simples e requer apenas incubação com colagenase.
Com manipulação mínima do vaso, isso resulta em menor contaminação com células musculares lisas e fibroblastos. O protocolo para isolar as EVECs humanas e cultivá-las sob tensão de cisalhamento e estiramento cíclico é essencial para entender a contribuição das forças mecânicas na disfunção das células endoteliais associada à falência do enxerto de veia safena. A cultura prévia de células endoteliais é muito exigente em termos de suplementos de meios celulares.
É obrigatório adicionar fatores de crescimento para isolar com sucesso uma cultura, os SVECs humanos. Para isolar células endoteliais primárias da veia safena humana ou EVECs humanas, coletar pelo menos um segmento de veia safena parva de dois a três centímetros de comprimento. Trabalhando sob uma capela de fluxo laminar estéril, transfira o segmento da veia para uma placa de Petri preenchida com PBS pré-aquecido.
Para remover todo o sangue de dentro do lúmen, insira uma ponta de pipeta presa a uma pipeta e preenchida com PBS em uma extremidade da veia e lave-a suavemente. Lave-o até que o fluxo de lavagem fique completamente claro. Em seguida, feche uma extremidade da veia com uma sutura de algodão estéril.
Preencha cuidadosamente o vaso com um miligrama por mililitro de solução de colagenase tipo 2 e feche a outra extremidade do vaso com uma sutura de algodão. Incubar o vaso com solução de colagenase numa atmosfera humidificada de dióxido de carbono a 5% a 37 graus Celsius durante uma hora. Em seguida, corte uma extremidade do vaso sobre um tubo de 15 mililitros para coletar a solução de colagenase antes de cortar a outra extremidade.
Lavar a superfície luminal com um a dois mililitros de PBS para coletar todas as células endoteliais descoladas dentro do tubo com colagenase. Centrifugar o tubo a 400G em temperatura ambiente durante cinco minutos. Após a remoção do sobrenadante, ressuspenda o pellet de células em três a quatro mililitros de meio celular endotelial completo contendo uma solução adicional de heparina.
Plaquear as células em uma placa de cultura celular de 60 milímetros pré-revestida com gelatina a 3% em peso por volume. Incubar as células em atmosfera umidificada por quatro dias sem alterar o meio. Depois disso, troque o meio a cada dois dias sem adicionar a suplementação de heparina.
Examine a placa sob o microscópio para garantir que os glóbulos vermelhos foram removidos. Após um a quatro dias pós-extração, dependendo do tamanho e diâmetro do segmento venoso, visualizar as EVECs humanas por microscopia de contraste de fase para avaliar o grau de confluência e sua morfologia de paralelepípedos. Continue trocando a mídia a cada dois dias até que as células atinjam 70% a 80% de confluência.
Revestir a lâmina da câmara de fluxo com gelatina a 0,1% do peso por volume e incubar por pelo menos 30 minutos a 37 graus Celsius. Para equilibrar a unidade fluídica e o conjunto de perfusão estéril com reservatórios de 10 milímetros, incube-os durante a noite em uma atmosfera umedecida. Para o experimento de tensão de cisalhamento, semeou 200.000 células endoteliais suspensas em 100 microlitros de meio de cultura na lâmina da câmara de fluxo revestida com gelatina.
Para fixar as células à superfície de cultura, incube as células por quatro horas. Coloque o conjunto de perfusão sobre a unidade fluídica. Preencher os reservatórios e o conjunto de perfusão com cerca de 12 mililitros de meio celular endotelial completo pré-aquecido.
Remova as bolhas de ar do conjunto de perfusão para equilibrar o nível de ambos os reservatórios em cinco mililitros. Coloque a unidade fluídica no conjunto de perfusão montado sem a lâmina da câmara na incubadora e conecte seu cabo elétrico à bomba regulada por computador. Ao executar o protocolo pré-definido no software de controle da bomba, remova todas as bolhas de ar dos reservatórios e do conjunto de perfusão.
Pegue a unidade fluídica com a perfusão montada ajustada para a capela de fluxo laminar e prenda as lâminas com uma monocamada de célula de confluência. Depois de colocar toda a unidade com as corrediças na incubadora, conecte seu cabo elétrico à bomba. No software de controle da bomba, ajuste a configuração da unidade fluídica selecionando o tipo de lâmina e ajustando a viscosidade do meio.
Em parâmetros de fluxo, insira o valor da tensão de cisalhamento e defina a duração do ciclo e o tipo de fluxo. Em seguida, clique no botão de reprodução para iniciar o experimento. Lembre-se de manter a lâmina com células tratadas com o mesmo meio sem exposição ao fluxo como controles estáticos.
Aplique lubrificante à base de silicone nas partes superiores e laterais da estação de carregamento equibiaxial de 6 poços de 25 milímetros. Semear 400.000 células suspensas em três mililitros para cada poço das placas de cultura de fundo flexível de 6 poços revestidas com colágeno. Incubar as células em ar umidificado até atingirem 100% de confluência.
Antes de iniciar o protocolo de alongamento, lave as células uma vez com PBS pré-aquecido e adicione três mililitros de meio de cultura fresco por poço. Insira a placa de base com todas as estações de carregamento lubrificadas na incubadora e conecte adequadamente a tubulação com o equipamento controlador do sistema de biorreator de estiramento de células de tensão. Fixe cada placa de cultura a uma junta vermelha fornecida pelo sistema do biorreator.
Em seguida, coloque-os na placa de base na incubadora. Coloque todas as quatro placas de cultura na placa de base para obter vácuo e carga de alongamento adequados. Ligue o equipamento controlador e o sistema do computador.
Abra o software de controle FlexCell e configure o regime desejado, incluindo a porcentagem de alongamento, forma de onda, frequência e tempo. Salve o regime. Ligue o sistema de vácuo, selecione o regime e clique em iniciar na tela do computador para executar o alongamento.
Verifique se a membrana de silicone está se movendo e esticando as células. As células endoteliais aderidas puderam ser observadas 4 a 10 dias após a extração. Inicialmente, formam aglomerados celulares exibindo uma morfologia típica de paralelepípedos.
Expressaram os marcadores EC CD31 e VE-caderina. As hSVECs, quando cultivadas sob tensão de cisalhamento, alinharam-se na direção do fluxo. A tensão de cisalhamento de 20 dinas por centímetro quadrado durante 72 horas induz a expressão de genes mecanossensíveis típicos, KLF2, KLF4 e NOS3, indicando a eficácia do estímulo ao cisalhamento.
O resultado do estiramento cíclico dependeu da intensidade aplicada às EVECs humanas. Células sob baixo estiramento mostraram um padrão de F-actina cortical semelhante às células estáticas. Sem alteração na liberação de óxido nítrico por até 72 horas, nossos níveis arteriais de estiramento remodelaram o citoesqueleto da actina após 24 horas e diminuíram a liberação de NO após 72 horas.
Além dos estudos de estresse mecânico, os pesquisadores podem usar as células isoladas para realizar vários métodos para expandir o conhecimento da função e disfunção das células endoteliais. Seguindo o protocolo demonstrado, é possível estudar qualquer outro tipo de células endoteliais sob tensão de cisalhamento e estiramento.
