冠状动脉搭桥手术后，隐静脉突然暴露于动脉疾病。了解其对机械应力的适应反应可能有助于设计治疗工具来预防静脉移植失败。这种内皮细胞分离方案非常简单，只需要与胶原酶一起孵育。
通过最少的血管操作，这可以减少平滑肌细胞和成纤维细胞的污染。分离人类SVEC并在剪切应力和循环拉伸下培养它们的方案对于了解机械力在与隐静脉移植失败相关的内皮细胞功能障碍中的贡献至关重要。先前的内皮细胞培养对细胞培养基补充剂的要求非常高。
必须添加生长因子才能成功分离出一种培养物，即人类SVEC。为了分离原代人隐静脉内皮细胞或人SVEC，收集至少两到三厘米长的隐静脉段。在无菌层流罩下工作，将静脉段转移到装有预热PBS的培养皿中。
要从管腔内去除所有血液，请将连接到移液器并充满PBS的移液器吸头插入静脉的一端并轻轻冲洗。冲洗直至洗涤流完全清澈。然后用无菌棉缝合线关闭静脉的一端。
小心地用每毫升1毫克的2型胶原酶溶液填充血管，并用棉缝线关闭容器的另一端。将带有胶原酶溶液的容器在5%二氧化碳的潮湿气氛中以37摄氏度孵育一小时。然后在15毫升管上切割血管的一端以收集胶原酶溶液，然后再切割另一端。
用一到两毫升PBS冲洗管腔表面，用胶原酶收集管内所有分离的内皮细胞。将试管在室温下以400G离心五分钟。除去上清液后，将细胞沉淀重新悬浮在含有额外肝素溶液的三至四毫升完整内皮细胞培养基中。
将细胞接种在预涂有每体积重量3%明胶的60毫米细胞培养皿中。在不更换培养基的情况下，在潮湿的气氛中孵育细胞四天。之后，每隔一天更换一次培养基，而不添加肝素补充剂。
在显微镜下检查平板以确保红细胞被去除。提取后一到四天后，根据静脉段的大小和直径，通过相差显微镜观察人类SVEC，以评估汇合程度及其鹅卵石形态。继续每两天更换一次培养基，直到细胞达到70%至80%汇合。
在流动室载玻片上涂上每体积重量为0.1%的明胶，并在37摄氏度下孵育至少30分钟。为了平衡流体单元和具有10毫米储液器的无菌灌注装置，请在潮湿的气氛中孵育过夜。对于剪切应力实验，将悬浮在100微升培养基中的200， 000个内皮细胞种子放入涂有明胶的流动室载玻片中。
为了将细胞附着到培养表面上，将细胞孵育四个小时。将灌注装置放在流体单元上。用约12毫升预热的完整内皮细胞培养基填充储液器和灌注装置。
从灌注装置中去除气泡，以平衡两个储液槽的液位为五毫升。将流体单元放在安装的灌注装置上，而无需培养箱中的腔室滑块，并将其电缆连接到计算机调节的泵。通过在泵控制软件中运行预定义的协议，去除储液罐和灌注装置中的所有气泡。
将装有灌注装置的流体单元连接到层流罩上，并连接具有汇合细胞单层的载玻片。将带有载玻片的整个装置放入培养箱后，将其电缆连接到泵。在泵控制软件中，通过选择滑块类型并设置介质粘度来调整流体单元设置。
在流动参数中，输入剪切应力值并设置循环持续时间和流动类型。然后点击播放按钮开始实验。请记住，使用用相同培养基处理的细胞来维护载玻片，不要像静电对照那样暴露于流动中。
将有机硅润滑剂涂在 25 毫米 6 孔等双轴加载站的顶部和侧面。将悬浮在3毫升中的400，000个细胞接种到涂有胶原蛋白的6孔柔性底培养板的每个孔中。在潮湿的空气中孵育细胞，直到它们达到100%汇合。
在开始拉伸方案之前，用预热的PBS洗涤细胞一次，每孔加入三毫升新鲜培养基。将所有润滑的加载站的底板插入培养箱中，并将管道与张力细胞拉伸生物反应器的控制器设备适当连接。将每个培养板连接到生物反应器系统提供的一个红色垫圈上。
然后将它们放入培养箱的底板中。将所有四个培养板放在底板中，以实现适当的真空和拉伸负荷。打开控制器设备和计算机系统。
打开 FlexCell 控制软件并配置所需的方案，包括伸长率百分比、波形形状、频率和时间。保存方案。打开真空系统，然后选择方案并单击计算机屏幕上的开始以运行拉伸。
检查硅胶膜是否在移动和拉伸细胞。在提取后4至10天可以观察到粘附的内皮细胞。它们最初形成细胞簇，显示出典型的鹅卵石形态。
他们表达EC标志物CD31和VE-钙粘蛋白。在剪切应力下培养的hSVEC沿流动方向排列。剪切应力为每平方厘米20达因，持续72 h诱导典型机械敏感基因KLF2、KLF4和NOS3的表达，表明剪切刺激的有效性。
周期性拉伸结果取决于应用于人类SVEC的强度。低拉伸下的细胞显示出类似于静态细胞的皮质F-肌动蛋白模式。在长达 72 小时内一氧化氮释放没有变化的情况下，我们的动脉拉伸水平在 24 小时后重塑了肌动蛋白细胞骨架，并在 72 小时后减少了 NO 释放。
除了机械应力研究外，研究人员还可以使用分离的细胞进行各种方法，以扩展对内皮细胞功能和功能障碍的了解。按照演示的方案，可以在剪切应力和拉伸下研究任何其他类型的内皮细胞。
