הווריד הספנוס נחשף לפתע לתנאי עורקים לאחר ניתוח מעקפים של העורקים הכליליים. הבנת תגובת ההסתגלות שלו ללחץ מכני עשויה לסייע בתכנון כלים טיפוליים למניעת כשל השתלת ורידים. פרוטוקול בידוד תאי אנדותל זה הוא פשוט מאוד ודורש רק דגירה עם collagenase.
עם מניפולציה מינימלית של כלי הדם, התוצאה היא זיהום מופחת עם תאי שריר חלקים ופיברובלסטים. הפרוטוקול לבידוד SVECs אנושיים ותרבית שלהם תחת לחץ גזירה ומתיחה מחזורית חיוני להבנת תרומתם של כוחות מכניים בתפקוד לקוי של תאי אנדותל הקשורים לכשל השתלת ורידים ספנוסיים. תרבית תאי אנדותל קודמת היא תובענית מאוד במונחים של תוספי מדיה תאית.
חובה להוסיף גורמי גדילה כדי לבודד בהצלחה תרבות, ה- SVEC האנושיים. לבידוד תאי אנדותל ראשוניים של ורידים ספניים אנושיים או SVEC אנושיים, יש לאסוף לפחות מקטע ורידים ספניים באורך שניים עד שלושה סנטימטרים. עובדים מתחת למכסה מנוע זרימה למינרי סטרילי, מעבירים את מקטע הוורידים לצלחת פטרי מלאה PBS שחומם מראש.
כדי להסיר את כל הדם מתוך לומן, הכנס קצה פיפטה מחובר פיפטה מלא PBS לתוך קצה אחד של הווריד בעדינות לשטוף אותו. שוטפים אותו עד שזרימת הכביסה הופכת ברורה לחלוטין. ואז לסגור קצה אחד של הווריד עם תפר כותנה סטרילי.
בזהירות למלא את הכלי עם מיליגרם אחד לכל מיליליטר collagenase סוג 2 פתרון ולסגור את הקצה השני של הכלי עם תפר כותנה. לדגור על הכלי עם תמיסת collagenase באטמוספירה לחה של 5% פחמן דו חמצני ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעה אחת. לאחר מכן חותכים קצה אחד של הכלי מעל צינור של 15 מיליליטר כדי לאסוף את תמיסת הקולגנאז לפני חיתוך הקצה השני.
שטפו את המשטח הלומינלי במיליליטר אחד או שניים של PBS כדי לאסוף את כל תאי האנדותל המנותקים בתוך הצינור עם קולגן. צנטריפוגג את הצינור ב 400G בטמפרטורת החדר במשך חמש דקות. לאחר הסרת הסופרנטנט, יש להשהות מחדש את גלולת התא בשלושה עד ארבעה מיליליטרים של תווך תאי אנדותל שלם המכיל תמיסת הפרין נוספת.
מקציפים את התאים בצלחת תרבית תאים בקוטר 60 מ"מ המצופה מראש בג'לטין במשקל 3% לכל נפח. לדגור על התאים באטמוספירה לחה במשך ארבעה ימים מבלי לשנות את התווך. לאחר מכן, לשנות את המדיום כל יומיים מבלי להוסיף את תוספת הפרין.
בדוק את הצלחת מתחת למיקרוסקופ כדי לוודא שתאי הדם האדומים הוסרו. לאחר יום עד ארבעה ימים לאחר החילוץ, בהתאם לגודל וקוטר של קטע הווריד, לדמיין את SVECs האנושי על ידי מיקרוסקופ ניגודיות פאזה כדי להעריך את מידת המפגש ואת המורפולוגיה מרוצפת שלהם. המשך לשנות את המדיה כל יומיים עד שהתאים מגיעים למפגש של 70% עד 80%.
מצפים את תא הזרימה בג'לטין במשקל 0.1% לכל נפח ודגרים במשך 30 דקות לפחות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. כדי לאזן את היחידה הפלואידית ואת מערכת הזילוח הסטרילית בעלת מאגרים של 10 מילימטר, דגרו עליהם למשך הלילה באטמוספירה לחה. עבור ניסוי עקת הגזירה, זרע 200, 000 תאי אנדותל מרחפים ב -100 מיקרוליטר של תווך תרבית לתוך תא זרימה מצופה ג'לטין.
לצורך הצמדת התאים למשטח התרבית, דוגרים על התאים במשך ארבע שעות. מניחים את ערכת הזילוח על היחידה הפלואידית. מלאו את המאגרים ואת ערכת הזילוח בכ-12 מיליליטר של תווך תאי אנדותל שלמים שחוממו מראש.
הסר בועות אוויר מהזילוח שנקבע כדי לאזן את רמת שני המאגרים בחמישה מיליליטר. הניחו את יחידת הנוזל על מערכת הזילוח המותקנת ללא החלקת התא באינקובטור וחברו את כבל החשמל שלה למשאבה המווסתת על ידי מחשב. על ידי הפעלת הפרוטוקול שהוגדר מראש בתוכנת בקרת המשאבה, הסר את כל בועות האוויר מהמאגרים וממערך הזילוח.
קח את היחידה הנוזלית עם זילוח רכוב להגדיר מכסה המנוע זרימה למינרית ולחבר את שקופיות שיש monolayer תא מפגש. לאחר הנחת היחידה כולה עם המגלשות באינקובטור, חבר את כבל החשמל שלה למשאבה. בתוכנת בקרת המשאבה, התאם את הגדרת היחידה הפלוידית על ידי בחירת סוג השקופית והגדרת צמיגות המדיום.
בפרמטרים של זרימה, הזן את ערך מתח הגזירה והגדר את משך המחזור ואת סוג הזרימה. לאחר מכן לחץ על לחצן ההפעלה כדי להתחיל את הניסוי. זכור לתחזק את השקופית עם תאים המטופלים באותה מדיה ללא חשיפה לזרימה כפקדים סטטיים.
יש למרוח חומר סיכה על בסיס סיליקון על החלק העליון והדפנות של תחנת ההעמסה השווה בקוטר 25 מ"מ עם 6 בארות. זרע 400, 000 תאים מרחפים בשלושה מיליליטר לכל באר של 6 צלחות תרבית בעלות תחתית גמישה המצופה בקולגן אחד. דוגרים על התאים באוויר לח עד שהם מגיעים למפגש של 100%.
לפני תחילת פרוטוקול המתיחה, שטפו את התאים פעם אחת עם PBS שחומם מראש והוסיפו שלושה מיליליטר של מדיום תרבית טרי לכל באר. הכנס את צלחת הבסיס עם כל תחנות הטעינה המשומנות באינקובטור וחבר כראוי את הצינור עם ציוד הבקר של מערכת הביוריאקטור המתיחה של תא המתח. חברו כל צלחת תרבית לאטם אדום אחד המסופק על ידי מערכת הביוריאקטורים.
ואז לשים אותם לתוך צלחת הבסיס באינקובטור. הניחו את כל ארבע צלחות התרבית בצלחת הבסיס כדי להשיג ואקום ועומס מתיחה מתאימים. הפעל את ציוד הבקר ואת מערכת המחשב.
פתח את תוכנת הבקרה FlexCell והגדר את משטר האימונים הרצוי כולל אחוז ההתארכות, צורת הגל, התדר והזמן. שמור את המשטר. הפעל את מערכת הוואקום, ולאחר מכן בחר את משטר האחסון ולחץ על התחל במסך המחשב כדי להפעיל את המתיחה.
בדקו שקרום הסיליקון זז ומותח את התאים. ניתן היה לצפות בתאי האנדותל הדבוקים 4 עד 10 ימים לאחר החילוץ. בתחילה הם יוצרים צבירי תאים המציגים מורפולוגיה טיפוסית של אבני ריצוף.
הם ביטאו את סמני EC CD31 ו- VE-cadherin. hSVECs כאשר תרבית תחת לחץ גזירה מיושרים בכיוון הזרימה. לחץ הגזירה של 20 דינים לסמ"ר במשך 72 שעות גורם לביטוי של גנים אופייניים למכנורגישים, KLF2, KLF4 ו-NOS3, מה שמצביע על יעילות גירוי הגזירה.
תוצאת המתיחה המחזורית הייתה תלויה בעוצמה שהוחלה על SVEC האנושיים. תאים מתחת למתיחה נמוכה הראו דפוס F-actin קליפת המוח דומה לתאים סטטיים. ללא שינוי בשחרור תחמוצת החנקן למשך עד 72 שעות, רמות המתיחה העורקיות שלנו שיפצו את שלד האקטין לאחר 24 שעות והפחיתו את שחרור NO לאחר 72 שעות.
מלבד מחקרי לחץ מכניים, חוקרים יכולים להשתמש בתאים המבודדים כדי לבצע שיטות שונות להרחבת הידע על תפקוד תאי אנדותל ותפקוד לקוי. בעקבות הפרוטוקול שהודגם, ניתן לחקור כל סוג אחר של תאי אנדותל תחת לחץ גזירה ומתיחה.
