في عام 1988 ، بدأ ريتشارد لينسكي تجربة التطور. ملأ 12 قارورة Erlenmeyer بوسط نمو محدد محدود الجلوكوز يعرف باسم DM25. قام بتلقيح ستة من هذه القوارير بسلالة E.coli المعروفة باسم REL606 والتي لا تستطيع استخدام أرابينوز السكر كمغذيات.
تم تعيين هؤلاء السكان من A-1 إلى A-6. قام بتلقيح الستة الآخرين بسلالة متطابقة تقريبا تعرف باسم REL607 وهي قادرة على استخدام أرابينوز. يمكن تمييز سلالات الأجداد هذه ، E.coli التي تطورت منها ، عند طلائها على التترازوليوم أو أجار أرابينوز.
تشكل سلالات آرا مستعمرات حمراء ، وتشكل سلالات آرا + مستعمرات بيضاء. وضع لينسكي هذه القوارير في حاضنة اهتزاز عند 37 درجة مئوية ، مما سمح لها بالنمو إلى التشبع واستنفاد الجلوكوز في الوسط. في هذه المرحلة ، نقل 1٪ من الثقافة من كل قارورة إلى مجموعة جديدة من 12 قارورة تحتوي على وسط جديد.
استمرت هذه الدورات اليومية من النقل وإعادة النمو لعقود ، مما خلق تاريخا طويلا من التطور يمكن دراسته من قبل الباحثين. في بروتوكولنا ، نصف كيف يتم نقل تجربة التطور طويلة الأجل ، أو LTEE ، السكان وثقافتهم كل يوم. ثم نصف كيف يتم فحص السكان بانتظام بحثا عن علامات التلوث المحتملة وأرشفتها لتوفير سجل مجمد دائم للدراسة اللاحقة.
غالبا ما نشير إلى هذا على أنه السجل الأحفوري ل LTEE. إحدى الطرق المهمة التي يتم بها مراقبة الإيقاع العام وطبيعة التغيرات التطورية في LTEE هي من خلال قياس اللياقة النسبية للسكان والسلالات من التجربة. نصف كيفية إجراء مقايسات مسابقة الثقافة المشتركة هذه وتحليل البيانات الناتجة لحساب قيم اللياقة النسبية .
سنعرض أول وآخر هذه الإجراءات في هذا الفيديو. أولا، سنعرض انتقالا يوميا لتجربة التطور طويلة المدى. قم بتطهير السطح الذي سيتم إجراء عمليات نقل LTEE عليه عن طريق مسحه إما ب 70٪ إيثانول أو محلول مبيض 10٪.
أشعل موقد بنسن لإنشاء تيار صاعد محلي وتمكين اشتعال الأواني الزجاجية. قم بإعداد 13 قارورة Pyrex Erlenmeyer سعة 50 ملليلتر مغطاة بكؤوس Pyrex أو البولي بروبلين سعة 20 ملليلتر تم غسلها وتعقيمها عن طريق التعقيم. افحص القوارير بحثا عن الحطام المرئي واستبدل أي قوارير غير نظيفة تماما.
قم بتسمية ست قوارير من A-1 إلى A-6 باستخدام علامة حمراء ، والقوارير الست الأخرى من A + 1 إلى A + 6 باستخدام علامة سوداء. قم بتسمية آخر دورق متبقي، والذي سيكون فارغا، مع التاريخ، بتنسيق الشهر-اليوم، ويوم الأسبوع. املأ كل قارورة من القارورة ال 13 ب 9.9 ملليلتر من وسط DM25 باستخدام ماصة مصلية معقمة سعة 10 ملليلتر.
أشعل فم كل دورق بعد إزالة الدورق الذي يعمل كغطاء، وقبل استبدال الدورق. لهب طرف الماصة بين ملء كل قارورة. قم بإزالة قوارير LTEE في اليوم السابق من حاضنة الاهتزاز.
افحص كل منها بدوره عن طريق رفعه إلى الضوء لتقييم تعكره ولونه . تحقق من سلامة القارورة وابحث عن وجود مادة غريبة. باستخدام أنبوب دقيق P200 مع طرف مرشح معقم ، انقل 100 ميكرولتر من الثقافة من كل قارورة LTEE إلى القارورة المقابلة التي تحتوي على DM25 طازج.
ابدأ ب A-1 ، ثم انقل A + 1. بعد ذلك ، استمر في التناوب بين السكان ناقص وزائد. لتتبع الثقافات التي تم نقلها ، قم بتحويل القوارير إلى اليسار كماصة منها أو إليها.
مراقبة تقنية التعقيم الصارمة أثناء عمليات النقل. استخدم طرف ماصة جديد لكل عملية نقل. قم بإشعال أفواه القوارير مباشرة بعد فك الغطاء وقبل إعادة التغليف ، وامسح البرميل وحاقن الماصة الدقيقة باستخدام Kimwipe المبلل بنسبة 70٪ من الإيثانول بين كل عملية نقل.
احتضان القوارير الملقحة حديثا عند 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة مع اهتزاز مداري 120 دورة في الدقيقة على قطر بوصة واحدة. قم بتخزين الثقافات من اليوم السابق عند أربع درجات مئوية. احتفظ بهذه الثقافات لمدة يومين.
تجاهل الثقافات القديمة التي تم حفظها عند أربع درجات مئوية قبل ثلاثة أيام في هذا الوقت. أدخل الوقت والتاريخ ورقم النقل واسمك أو الأحرف الأولى من اسمك ، سواء كانت الثقافات على ما يرام أم لا ، وأي معلومات أخرى ذات صلة في دفتر سجل النقل. مرت 6 2/3 أجيال أخرى في تاريخ تجربة التطور طويلة المدى مع الإشريكية القولونية.
إذا كانت هناك أي مشاكل أو حوادث أو شكوك حول التلوث بثقافات LTEE في اليوم السابق ، فلا تنقل منها. بدلا من ذلك ، قم بتخزين المجموعة الكاملة المكونة من 12 مزرعة عند أربع درجات مئوية لفحصها لاحقا وتوصيفها لاحقا. استرجع القوارير الاحتياطية التي تم نقلها من اليوم السابق وتخزينها عند أربع درجات مئوية.
ضعها على سطح الطاولة لتسخن إلى درجة حرارة الغرفة. قم بتدوير كل قارورة برفق لإعادة تعليق الخلايا. انقل من كل قارورة إلى وسط جديد في مجموعة جديدة من القوارير واستمر في التجربة بشكل طبيعي.
قم بتدوين ملاحظة في سجل النقل بأنك استخدمت ثقافات النسخ الاحتياطي وسجل نفس رقم التحويل كما في اليوم السابق. إذا لوحظ تلوث في القوارير الاحتياطية المخزنة عند أربع درجات مئوية ، فيجب إعادة تشغيل مجموعات LTEE المتأثرة من المخزونات المجمدة. بعد ذلك ، سنعرض مقايسة مسابقة الثقافة المشتركة التي يمكن استخدامها لقياس اللياقة النسبية لسلالتين أو مجموعات سكانية من تجربة التطور طويلة المدى.
سنعرض تجربة منافسة تطور كلا من أسلاف LTEE ، REL606 و 607 ، ومجموعتين متطورتين ، السكان A-5 في 20،000 جيل ، REL8597 ؛ والسكان A + 5 في 20،000 جيل ، REL8604. استخدمت هذه المقايسات النسخ المتماثل بستة أضعاف لكل زوج من منافسي Ara-و Ara +. حدد عدد سلالات LTEE المنافسة و / أو المجموعات السكانية التي ستستخدمها وعدد فحوصات المنافسة المكررة التي سيتم إجراؤها لكل زوج من المنافسين.
إعداد المستلزمات اللازمة على النحو التالي. بالنسبة ليوم الإحياء ، اليوم ناقص اثنين ، املأ دورق Erlenmeyer معقم سعة 50 ملليلتر مغطى بدورق سعة 20 ملليلتر مع 9.9 ملليلتر من DM1000 أو مرق الليزوجيني ، LB ، لكل سلالة أو مجموعة من E.coli التي سيتم استخدامها كمنافس. املأ دورقا آخر ب 9.9 ملليلتر من الوسط نفسه ليكون بمثابة فراغ غير ملقح.
بالنسبة ليوم التهيئة المسبقة ، اليوم ناقص واحد ، املأ أنبوب اختبار واحدا ب 9.9 ملليلتر من محلول ملحي معقم بنسبة 0.85٪ لكل حجم لكل منافس ، وقارورة بها 9.9 ملليلتر DM25 لكل مقايسة مكررة بين زوج من المنافسين ، وقارورة أخرى بها 9.9 ملليلتر من DM25 للفراغ. في اليوم الذي تبدأ فيه المسابقة ، اليوم صفر ، املأ قارورة واحدة ب 9.9 ملليلتر من DM25 ، املأ أنبوب اختبار واحدا ب 9.9 ملليلتر من المحلول الملحي المعقم ، وقم بإعداد رباعي زوليوم أو أرابينوز ، أو لوحة TA ، لكل تكرار لمقايسة المنافسة. املأ دورقا آخر ب 9.9 ملليلتر من DM25 لتكون فارغة.
إذا كنت تقوم بمسابقة لمدة ثلاثة أيام ، فاملأ مجموعتين إضافيتين من قوارير المنافسة. في اليوم الأخير من المسابقة ، املأ أنبوبي اختبار ب 9.9 ملليلتر من المحلول الملحي المعقم وقم بإعداد لوحة TA واحدة لكل تكرار للمسابقة. في اليوم ناقص اثنين من تجربة المنافسة ، يمكنك إحياء المنافسين بشكل منفصل عن مخزون المجمد.
خذ المبردات التي تحتوي على المخزونات المجمدة من سلالات المنافسين من الفريزر 80 درجة مئوية. احتفظ بالقوارير مبردة في دلو لطيف أثناء استخدامها. بعد ذوبان كل مخزون مجمد ، دوامة تماما لإعادة تعليق خلايا E.coli.
في حالة إحياء نسخة ، قم بتلقيح القارورة التي تحتوي على وسط طازج ب 12 ميكرولتر من المخزون المجمد. في حالة إحياء السكان ، قم بالتلقيح ب 120 ميكرولتر من المخزون المجمد. احتضان قوارير الإحياء في الفراغ عند 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها مع اهتزاز مدار 120 دورة في الدقيقة على قطر بوصة واحدة.
في اليوم ناقص واحد من تجربة المنافسة ، يمكنك تهيئة المنافسين مسبقا بشكل منفصل في DM25. أخرج القوارير التي تحتوي على ثقافات المنافسين الذين تم إحياؤهم من الحاضنة. انقل 100 ميكرولتر من كل قارورة إلى أنبوب اختبار المحلول الملحي لهذا المنافس.
دوامة كل أنبوب تخفيف جيدا قبل نقل 100 ميكرولتر من الثقافة المخففة إلى قارورة مع DM25 الطازجة. قم بتلقيح اثنين من قوارير التكييف المسبق هذه لكل مقايسة مكررة ، واحدة لكل من المنافسين. احتضان قوارير التكييف المسبق في الفراغ عند 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة.
في اليوم صفر من تجربة المنافسة ، تبدأ المنافسة عن طريق خلط المنافسين واللوحة للعد الأولي. أخرج قوارير التكييف المسبق من الحاضنة. انقل 50 ميكرولترا من منافس Ara-إلى أول قارورة منافسة مكررة مملوءة ب DM25 طازجة.
انقل على الفور 50 ميكرولترا من منافس Ara + إلى نفس قارورة المنافسة. امزج القارورة عن طريق الدوران برفق. كرر هذه الخطوات لدمج جميع النسخ المتماثلة لجميع أزواج المنافسين الذين كنت تختبرهم.
انقل 100 ميكرولتر من كل قارورة منافسة ملقحة حديثا إلى أنبوب اختبار المحلول الملحي المسمى لتكرار مقايسة المنافسة. ضع قوارير المنافسة الجديدة وفارغة في حاضنة الاهتزاز. وفي الوقت نفسه ، في نفس اليوم ، دوامة كل أنبوب اختبار تماما ولوحة 80 ميكرولتر من هذه التخفيفات 10،000 أضعاف على لوحات TA.
قم بتسمية جانب الجزء السفلي من كل لوحة بزوج السلالات التي تم خلطها ، والرقم المتماثل ، واليوم صفر للإشارة إلى أنه سيتم استخدامه لتحديد التمثيل الأولي لكل منافس. احتضان لوحات TA رأسا على عقب في حاضنة الحمل الحراري للجاذبية عند 37 درجة مئوية حتى تصبح مستعمرات كل من منافسي Ara-و Ara + مرئية ويمكن تمييزها. بشكل عام ، يحدث هذا في غضون 16 إلى 24 ساعة ، ولكن قد يستغرق وقتا أطول لبعض السلالات المتطورة.
احسب أعداد مستعمرات Ara-red و Ara + white على كل لوحة وسجل النتائج. إذا كنت تجري مسابقة لمدة ثلاثة أيام ، فقم بنقل 100 ميكرولتر من كل مسابقة إلى 9.9 ملليلتر من وسط DM25 الطازج في دورق جديد بعد النمو. احتضان هذه القوارير في اليوم الأول لمدة 24 ساعة.
قم بإجراء عملية نقل أخرى بنفس الطريقة واحتضان قارورة اليوم الثاني لمدة 24 ساعة لإكمال ثلاث دورات نمو كاملة للثقافة المشتركة للمنافسين في ظل ظروف LTEE. في اليوم الأخير من المسابقة ، اليوم الأول أو اليوم الثالث ، اعتمادا على طول تجربتك ، ستحدد العد النهائي. خذ قوارير المنافسة من الحاضنة.
انقل 100 ميكرولتر من كل دورق منافسة إلى أنبوب الاختبار الأول من المحلول الملحي لهذا التكرار. دوامة كل أنبوب تخفيف 100 أضعاف لخلطه جيدا ونقل 100 ميكرولتر إلى الأنبوب الثاني من المحلول الملحي لهذا التكرار. تحتوي الأنابيب الناتجة على 10،000 ضعف من ثقافات DM25.
دوامة كل أنبوب اختبار يحتوي على تخفيف 10،000 أضعاف تماما ولوحة 80 ميكرولتر منه على لوحة TA. قم بتسمية جانب الجزء السفلي من كل لوحة بزوج السلالات التي تم خلطها ، والرقم المكرر ، واليوم الأول لمسابقة ليوم واحد أو اليوم الثالث لمسابقة مدتها ثلاثة أيام للإشارة إلى أنه سيتم استخدامه لتحديد التمثيل النهائي لكل منافس. احتضان لوحات TA عند 37 درجة مئوية وعد مستعمرات Ara-و Ara + بعد النمو.
استخدم جدول بيانات Excel المزود مع هذا البروتوكول ، أو حزمة Fitness RR ، لحساب اللياقة النسبية للسلالات في منافسيك ورسم النتائج. أثناء عمليات النقل اليومية لتجربة التطور طويلة الأجل ، تكون كثافة الثقافات بعد النمو منخفضة للغاية ويجب الحكم عليها في كثير من الأحيان من خلال الاحتفاظ بثقافة بجوار فراغ. الاستثناء هو السكان A-3 الذين تطوروا لاستخدام السيترات في الوسط كمصدر إضافي للمغذيات وينمو إلى حوالي عشرة أضعاف كثافة الخلايا في المجموعات السكانية الأخرى.
يمكن أيضا استخدام قياسات الكثافة الضوئية في مزارع LTEE لمراقبة النمو المتوقع. بالنسبة لمقايسات المنافسة على سبيل المثال ، نتوقع أن يزيد منافس أكثر ملاءمة من تمثيله بمرور الوقت ، مقارنة بمنافس أقل ملاءمة. يظهر فحص صفائح TA مع مستعمرات نمت من تخفيفات نسخة واحدة فقط من المنافسة بين سلالتين السلفيتين أن النسبة لا تزال ثابتة نسبيا على مدار تجربة منافسة استمرت ثلاثة أيام.
على النقيض من ذلك ، يتفوق السكان A + 5 بسرعة على سلف REL606. ويتفوق سكان A-5 بسرعة على سلف REL607. المجموعتان التطوريتان متطابقتان بالتساوي تقريبا.
تظل تمثيلات المستعمرات الحمراء والبيضاء كما هي تقريبا خلال الأيام الثلاثة للمسابقة. باستخدام تعداد المستعمرات بعد يوم واحد من الاستزراع المشترك ، نجد أن لياقة السكان المتطورين قد زادت بنسبة 60٪ خلال LTEE بالنسبة لسلالات الأسلاف من E.coli. من خلال الاستمرار في نقل المسابقات على مدار عدة أيام ، يمكننا تحسين دقة قياسات اللياقة النسبية للمنافسين المتطابقين بشكل وثيق.
ولكن عندما يكون لدى متنافسين لياقة مختلفة تماما ، لم يعد هناك تمثيل كاف لكلا المستعمرتين بعد منافسة متعددة الأيام لحساب اللياقة النسبية. تعتبر الأساليب التي نوضحها هنا ضرورية لدراسة السجل التاريخي الفريد ل LTEE ولمواصلة تجربة التطور المفتوحة هذه. يمكنهم أيضا توفير نقطة انطلاق للآخرين الذين يفكرون في تجارب تطور جديدة تتناول أسئلة جديدة ، وتستخدم بيئات جديدة ، وتدرس الكائنات الحية الدقيقة المختلفة.
