M.E.H. reconhece a Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG), projeto número 413985647, pelo apoio financeiro. Os autores agradecem ao Dr. Michael Kiebler, Ludwig-Maximilians University, Munique, por seu generoso e extenso apoio. Somos gratos a Walter Neupert por sua contribuição científica, discussões úteis e inspiração contínua. J.F. agradece à Graduate School Life Science Munich (LSM) pelo apoio.

1. Amortecedores e soluções de reserva
<ol><li>Fazer uma solução de ácido 3-morfolinopano-1-sulfónico (MOPS) 1 M em água deionizada, pH 7,4. Conservar a 4 °C.</li>
	<li>Preparar 500 mM de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) em água deionizada, pH 8,0. Conservar à temperatura ambiente.</li>
	<li>Preparar sorbitol 2,4 M em água deionizada. Armazenar à temperatura ambiente após autoclavagem.</li>
	<li>Preparar sacarose 2,5 M em água deionizada. Armazenar à temperatura ambiente após autoclavagem.</li>
	<li>Preparar fluoreto de fenilmetilsulfonila (PMSF) 200 mM em isopropanol. Conservar a -20 °C. CUIDADO: PMSF É TÓXICO se ingerido e causa queimaduras graves na pele e danos oculares. Não respire a poeira e use luvas e óculos de proteção.</li>
	<li>Preparar ácido tricloroacético (TCA) a 72% em água deionizada. Conservar a 4 °C. CUIDADO: O TCA pode causar irritação respiratória, queimaduras graves na pele e danos nos olhos. Não respire a poeira e use luvas e óculos de proteção.</li>
	<li>Prepare o tampão SM: MOPS 20 mM e sorbitol 0,6 M, pH 7,4.</li>
	<li>Prepare o tampão de intumescimento: MOPS 20 mM, EDTA 0,5 mM, PMSF 1 mM e coquetel inibidor de protease, pH 7,4.</li>
	<li>Preparar os tampões de gradiente de sacarose: 0,8 M, 0,96 M, 1,02 M, 1,13 M e 1,3 M em 20 mM MOPS, e 0,5 mM EDTA, pH 7,4. NOTA: Todos os buffers podem ser armazenados a 4 °C; no entanto, recomenda-se armazenar os tampões contendo sacarose a -20 °C para evitar o crescimento de fungos. Os inibidores de protease devem ser adicionados frescos antes da utilização.</li>
</ol>2. Geração de vesículas subsubcomdriais
<ol><li>Isole mitocôndrias de levedura bruta na hora de acordo com protocolos estabelecidos34,35. NOTA: Para este experimento, mitocôndrias foram isoladas de Saccharomyces cerevisiae. A geração de mitocôndrias puras em gradiente desprovidas de outras organelas não é necessária.</li>
	<li>Ressuspender 10 mg de mitocôndrias recém-isoladas em 1,6 mL de tampão SM (4 °C) por pipetagem (Figura 2, passo 1).</li>
	<li>Transferir a suspensão mitocondrial para um balão de Erlenmeyer pré-resfriado de 100 mL.</li>
	<li>Adicione lentamente 16 ml de tampão de inchamento utilizando uma pipeta de vidro de 20 ml. Aplique agitação suave constante sobre o gelo durante a adição. Este tratamento osmótico resulta na absorção de água para o espaço matricial. O inchaço da membrana interna mitocondrial irá romper a membrana externa. No entanto, ambas as membranas permanecerão em contato nos locais de contato9 (Figura 2, passo 2).</li>
	<li>Incubar as amostras sob agitação suave constante durante 30 min sobre gelo.</li>
	<li>Adicionar lentamente 5 mL de solução de sacarose 2,5 M usando uma pipeta de vidro de 5 mL para aumentar a concentração de sacarose nas amostras para aproximadamente 0,55 M. Esse tratamento osmótico resulta em um efluxo de água da matriz36. O encolhimento da membrana interna destina-se a maximizar sua distância aos fragmentos residuais da membrana externa. Isso diminui a probabilidade de gerar vesículas híbridas artificiais das membranas interna e externa através da sonicação (Figura 2, passo 3).</li>
	<li>Incubar as amostras sob agitação suave durante 15 minutos sobre gelo.</li>
	<li>Submeter as mitocôndrias à sonicação para gerar vesículas de membrana subocondrial (Figura 2, passo 4).<ol><li>Transfira a suspensão mitocondrial para uma célula de roseta pré-resfriada.</li>
		<li>Sonicar a suspensão mitocondrial a uma amplitude de 10% por 30 s enquanto resfria a célula de roseta em um banho de gelo.</li>
		<li>Descanse a suspensão por 30 s em um banho de gelo.</li>
		<li>Repita as etapas 2.8.2 e 2.8.3 mais três vezes. NOTA: As condições de sonicação variam de acordo com o sonicator usado. A otimização será necessária para máquinas individuais. A sonicação que é muito dura levará à formação artificial de vesículas consistindo de membranas internas e externas mitocondriais.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Separação das vesículas sub-ocondrais
<ol><li>Separe as vesículas geradas das mitocôndrias intactas remanescentes por centrifugação a 20.000 x g por 20 min a 4 °C. As mitocôndrias intactas serão peletizadas enquanto as vesículas permanecerão no sobrenadante.</li>
	<li>Concentrar a mistura de vesículas.<ol><li>Transfira o sobrenadante para tubos de ultracentrifugação frescos.</li>
		<li>Coloque uma almofada de 0,3 mL de solução de sacarose 2,5 M no fundo do tubo usando uma seringa de 1 mL equipada com uma cânula de 0,8 mm x 120 mm.</li>
		<li>Centrifugar a 118.000 x g por 100 min a 4 °C. OBS: Neste caso, foi utilizado rotor de caçamba oscilante com raio máximo de 153,1 mm. As condições de centrifugação dependem fortemente do rotor e terão que ser adaptadas quando outro rotor for usado.</li>
	</ol></li>
	<li>As vesículas aparecerão como um disco na parte superior da almofada de sacarose após a centrifugação. Descarte aproximadamente 90% do sobrenadante. Agora, colha as vesículas concentradas ressuspendendo-as no tampão restante, incluindo a sacarose de 2,5 M, pipetando para cima e para baixo. Transfira a suspensão para um homogeneizador Dounce gelado.</li>
	<li>Homogeneizar a suspensão com pelo menos 10 tempos utilizando um oleiro de politetrafluoretileno.</li>
	<li>Prepare o gradiente de sacarose.<ol><li>Para um gradiente de passo de 11 mL com cinco passos (1,3 M, 1,13 M, 1,02 M, 0,96 M e 0,8 M de sacarose em MOPS 20 mM e EDTA 0,5 mM, pH 7,4), cada camada possui 2,2 mL de solução de sacarose. NOTA: Um refratômetro é recomendado para medir e ajustar as concentrações de sacarose; no entanto, não é essencial. Aplicar 10 μL do tampão no refratômetro e detectar os respectivos índices de refração. O cálculo da concentração de sacarose é o seguinte: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/65444/65444eq01v2.jpg" style="margin: auto;"> 1,3333 representa o índice de refração da água. 0,048403 é um índice de conversão específico da sacarose obtido a partir da escalonamento linear da refratividade molar à concentração de sacarose em soluções aquosas 37.</li>
		<li>Adicione a maior concentração de sacarose ao tubo de centrifugação e coloque o tubo a -20 °C. Aguarde até que a camada esteja completamente congelada antes de aplicar a próxima. Prossiga em conformidade até que a última camada seja adicionada e armazene os gradientes a -20 °C. NOTA: Lembre-se de transferir os gradientes congelados para 4 °C ao iniciar o experimento para permitir que os gradientes descongelem. Isso levará aproximadamente 3 h. Para a centrifugação, utilizou-se um rotor basculante com capacidade de 13,2 mL. Quando um rotor diferente é usado, os volumes do passo de gradiente devem ser adaptados de acordo.</li>
	</ol></li>
	<li>Medir a concentração de sacarose das amostras utilizando um refratómetro. Se não houver acesso a um refratômetro, pode-se alternativamente supor que a concentração de sacarose é de 2 M. Essa suposta concentração de sacarose será então a base para o próximo passo.</li>
	<li>Ajustar a concentração de sacarose para 0,6 M pela adição de uma quantidade adequada de MOPS 20 mM, EDTA 0,5 mM, PMSF 1 mM e cocktail inibidor de protease, pH 7,4. Se a concentração de sacarose for estimada em 2 M em vez de ser medida, recomenda-se testar se a concentração é suficientemente baixa após o ajuste. Aplicar uma pequena alíquota da amostra (cerca de 50 μL) sobre 200 μL de sacarose 0,8 M num tubo de ensaio. A amostra deve ficar em cima da sacarose de 0,8 M.</li>
	<li>Carregar as amostras (aproximadamente 1 mL) sobre o gradiente de sacarose (manter 10% para referência posterior). A pipetagem cuidadosa é importante para evitar a perturbação do gradiente (Figura 2, passo 5).</li>
	<li>Separe as vesículas por centrifugação a 200.000 x g e 4 °C durante 12 horas. Se possível, ajuste a centrífuga para diminuir a aceleração e desaceleração para evitar a perturbação do gradiente (Figura 2, passo 6). OBS: Neste caso, foi utilizado rotor de caçamba oscilante com raio máximo de 153,1 mm. As condições de centrifugação dependem fortemente do rotor e terão que ser adaptadas quando outro rotor for usado.</li>
	<li>Colher o gradiente de cima para baixo em frações de 700 μL usando uma pipeta de 1 mL. Isso resultará em 17 frações, o que permite uma resolução suficiente.</li>
</ol>4. Análise das vesículas subocondriais
<ol><li>Concentrar as proteínas submetendo cada fração a duas precipitações de TCA realizadas sequencialmente38 para preparar as amostras de SDS-PAGE.<ol><li>Adicionar 200 μL de TCA a 72% às fracções individuais e misturar até que a solução fique homogénea. Incubar as frações por 30 min sobre gelo e pelar as proteínas precipitadas por centrifugação a 20.000 x g e 4 °C por 20 min. Eliminar o sobrenadante, adicionar 500 μL de solução de TCA a 28 %, misturar bem e repetir o passo de centrifugação.</li>
		<li>Lavar os pellets com 1 ml de acetona (-20°C) e centrifugar durante 10 minutos a 20.000 x g e 4 °C. Descarte o sobrenadante e deixe os pellets secarem ao ar. Ressuspender os pellets em 60 μL de tampão de amostra SDS e incubar as amostras por 5 min a 95 °C. NOTA: Uma grande quantidade de sacarose permanecerá, particularmente nas frações de alta densidade, após a primeira precipitação de TCA. Isso será removido através da precipitação adicional de TCA.</li>
	</ol></li>
	<li>Analisar 20 μL de cada fração por SDS-PAGE39 e immunoblotting40,41,42,43.</li>
</ol>

Isolamento de locais de contato mitocondrial

Os autores declaram não haver conflitos de interesse.

O subfracionamento mitocondrial é um experimento complicado com várias etapas altamente complexas. Assim, buscou-se aprimorar ainda mais e, até certo ponto, simplificar nosso método estabelecido32. Aqui, os desafios foram a exigência de equipamentos complicados e altamente especializados, que muitas vezes são construções individuais, e o enorme consumo de tempo e energia. Para tanto, procurou-se remover as bombas e construções individuais utilizadas para fundição e colheita do gradient...

As mitocôndrias desempenham uma variedade de funções diferentes em eucariotos, sendo a mais conhecida a produção de ATP através da fosforilação oxidativa. Outras funções incluem a produção de clusters ferro-enxofre, síntese lipídica e, em eucariotos superiores, sinalização de Ca2+ e indução de apoptose 1,2,3,4. Essas funções estão inseparavelmente ligadas à sua complexa ultraestrutura.
A ultraestrutura mitocondrial foi primeiramente descrita por microscopia eletrônica5. Foi demonstrado que as mitocôndrias são organelas bastante complexas que consistem em duas membranas: a membrana externa mitocondrial e a membrana interna mitocondrial. Assim, dois compartimentos aquosos são formados por essas membranas: o espaço intermembrana e a matriz. A membrana interna mitocondrial pode ser ainda mais dividida em diferentes seções. A membrana limite interna permanece próxima à membrana externa, e as cristas formam invaginações. As chamadas junções cristas conectam a membrana limite interna e as cristas (Figura 1). Além disso, micrografias eletrônicas de mitocôndrias osmoticamente encolhidas revelam que existem locais nos quais as membranas mitocondriais estão firmemente conectadas 6,7. Esses chamados sítios de contato são formados por complexos proteicos que abrangem as duas membranas (Figura 1). Acredita-se que esses sítios de interação sejam essenciais para a viabilidade celular devido à sua importância para a regulação da dinâmica e herança mitocondrial, bem como para a transferência de metabólitos e sinais entre o citosol e amatriz8.
O complexo MICOS na membrana interna mitocondrial é provavelmente o mais bem caracterizado e o mais versátil complexo formador de sítios de contato. O MICOS foi descrito em levedura em 2011 e consiste de seis subunidades 9,10,1 1: Mic60, Mic27, Mic26, Mic19, Mic12 e Mic10. Estes formam um complexo de aproximadamente 1,5 MDa que se localiza nas junções cristais 9,10,11. A deleção de qualquer uma das subunidades principais, Mic10 ou Mic60, leva à ausência desse complexo 9,11, o que significa que essas duas subunidades são essenciais para a estabilidade da MICOS. Curiosamente, o MICOS forma não apenas um, mas múltiplos sítios de contato com várias proteínas e complexos da membrana externa mitocondrial: o complexo TOM 11,12, o complexo TOB/SAM 9,12,13,14,15,16, o complexo Fzo1-Ugo19, Por1 10, OM45 10 e Miro 17. Isso indica fortemente que o complexo MICOS está envolvido em vários processos mitocondriais, como a importação de proteínas, o metabolismo de fosfolipídios e a geração da ultraestrutura mitocondrial18. Esta última função é provavelmente a principal função da MICOS, pois a ausência do complexo MICOS induzida pela deleção da CIM10 ou CIM60 leva a uma ultraestrutura mitocondrial anormal que praticamente carece completamente de cristas regulares. Em vez disso, as vesículas da membrana interna sem conexão com a membrana de contorno interno se acumulam19,20. É importante ressaltar que o MICOS é conservado em forma e função desde a levedura até o ser humano21. A associação de mutações nas subunidades do MICOS com doenças humanas graves também enfatiza sua importância para eucariotossuperiores22,23. Embora o MICOS seja altamente versátil, sites de contato adicionais devem existir (com base em nossas observações não publicadas). De fato, vários outros sítios de contato foram identificados, por exemplo, as máquinas de fusão mitocondrial Mgm1-Ugo1/Fzo124,25,26 ou Mdm31-Por1, que está envolvida na biossíntese da cardiolipina fosfolipídea mitocondrial específica27. Recentemente, aprimoramos o método que nos levou à identificação do MICOS para identificar Cqd1 como parte de um novo sítio de contato formado com o complexo de membrana externa Por1-Om1428. Curiosamente, esse sítio de contato também parece estar envolvido em múltiplos processos, como a homeostase da membrana mitocondrial, o metabolismo de fosfolipídios e a distribuição da coenzima Q28,29.
Aqui, utilizamos uma variação do fracionamento mitocondrial descrito anteriormente9,30,31,32,33. O tratamento osmótico das mitocôndrias leva à ruptura da membrana externa mitocondrial e a um encolhimento do espaço matricial, deixando as duas membranas apenas próximas nos locais de contato. Isso permite a geração de vesículas que consistem exclusivamente de membrana externa mitocondrial ou membrana interna mitocondrial ou em locais de contato de ambas as membranas através de sonicação leve. Devido à membrana interna mitocondrial possuir uma relação proteína-lipídio muito maior, as vesículas da membrana interna mitocondrial exibem uma densidade maior em comparação com as vesículas da membrana externa mitocondrial. A diferença de densidade pode ser usada para separar as vesículas da membrana através da centrifugação por gradiente de densidade flutuante de sacarose. Assim, as vesículas da membrana externa mitocondrial acumulam-se em baixas concentrações de sacarose, enquanto as vesículas da membrana interna mitocondrial são enriquecidas em altas concentrações de sacarose. As vesículas contendo sítios de contato concentram-se em concentrações intermediárias de sacarose (Figura 2). O protocolo a seguir descreve detalhadamente esse método aprimorado, que requer menos equipamentos, tempo e energia especializados em comparação com o nosso método previamente estabelecido32, e fornece uma ferramenta útil para a identificação de possíveis proteínas do sítio de contato.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>13.2 mL, Open-Top Thinwall Ultra-Clear Tube, 14 x 89mm</td>
			<td>Beckman Instruments, Germany</td>
			<td>344059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL, Open-Top Thickwall Polycarbonate Open-Top Tube, 29 x 104mm</td>
			<td>Beckman Instruments, Germany</td>
			<td>363647</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A-25.50 Fixed-Angle Rotor- Aluminum, 8 x 50 mL, 25,000 rpm, 75,600 x g</td>
			<td>Beckman Instruments, Germany</td>
			<td>363055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Abbe refractometer</td>
			<td>Zeiss, Germany</td>
			<td></td>
			<td>discontinued, 
			any pipet controller will suffice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>accu-jet pro Pipet Controller</td>
			<td>Brandtech, USA</td>
			<td>BR26320</td>
			<td>discontinued, 
			any pipet controller will suffice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beaker 1000 mL</td>
			<td>DWK Life Science, Germany</td>
			<td>C118.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Branson&#160; Digital Sonifier W-250 D</td>
			<td>Branson Ultrasonics, USA</td>
			<td>FIS15-338-125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Branson Ultrasonic 3mm TAPERED MICROTIP</td>
			<td>Branson Ultrasonics, USA</td>
			<td>101-148-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Branson Ultrasonics 200- and 400-Watt Sonifiers: Rosette Cooling Cell</td>
			<td>Branson Ultrasonics, USA</td>
			<td>15-338-70</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Avanti JXN-26</td>
			<td>Beckman Instruments, Germany</td>
			<td>B37912</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Optima XPN-100 ultra</td>
			<td>Beckman Instruments, Germany</td>
			<td>8043-30-0031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cOmplete Proteaseinhibtor-Cocktail</td>
			<td>Roche, Switzerland</td>
			<td>11697498001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Sorbit</td>
			<td>Roth, Germany</td>
			<td>6213</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA (Ethylendiamin-tetraacetic acid disodium salt dihydrate)</td>
			<td>Roth, Germany</td>
			<td>8043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Erlenmeyer flask, 100 mL</td>
			<td>Roth, Germany</td>
			<td>X747.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>graduated pipette, Kl. B, 25:0, 0.1</td>
			<td>Hirschmann, Germany</td>
			<td>1180170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>graduated pipette, Kl. B, 5:0, 0.05</td>
			<td>Hirschmann, Germany</td>
			<td>1180153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ice bath</td>
			<td>neoLab, Germany</td>
			<td>&#160;S12651</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stirrer RCT basic</td>
			<td>IKA-Werke GmbH, Germany</td>
			<td>Z645060GB-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOPS (3-(N-Morpholino)propanesulphonic acid)</td>
			<td>Gerbu, Germany</td>
			<td>1081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MyPipetman Select P1000</td>
			<td>Gilson, USA</td>
			<td>FP10006S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MyPipetman Select P20</td>
			<td>Gilson, USA</td>
			<td>FP10003S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MyPipetman Select P200</td>
			<td>Gilson, USA</td>
			<td>FP10005S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Omnifix 1 mL</td>
			<td>Braun, Germany</td>
			<td>4022495251879</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)</td>
			<td>Serva, Germany</td>
			<td>32395.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>STERICAN cannula 21 Gx4 4/5 0.8x120 mm</td>
			<td>Braun, Germany</td>
			<td>4022495052414</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>stirring bar, 15 mm</td>
			<td>VWR, USA</td>
			<td>442-0366</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Merck, Germany</td>
			<td>S8501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SW 41 Ti Swinging-Bucket Rotor</td>
			<td>Beckman Instruments, Germany</td>
			<td>331362</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Test tubes</td>
			<td>Eppendorf, Germany</td>
			<td>3810X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue grinders, Potter-Elvehjem type, 2 mL glass vessel</td>
			<td>VWR, USA</td>
			<td>432-0200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue grinders, Potter-Elvehjem type, 2 mL plunger with serrated tip</td>
			<td>VWR, USA</td>
			<td>432-0212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trichloroacetic acid (TCA)</td>
			<td>Sigma Aldrich, Germany</td>
			<td>33731</td>
			<td>discontinued, 
			any TCA will suffice (CAS: 73-03-9)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIS</td>
			<td>Roth, Germany</td>
			<td>4855</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an improved method to isolate mitochondrial contact sites

As mitocôndrias estão presentes em praticamente todas as células eucarióticas e desempenham funções essenciais que vão muito além da produção de energia, por exemplo, a síntese de clusters ferro-enxofre, lipídios ou proteínas, tamponamento de Ca2+ e a indução de apoptose. Da mesma forma, a disfunção mitocondrial resulta em doenças humanas graves, como câncer, diabetes e neurodegeneração. Para desempenhar essas funções, as mitocôndrias têm que se comunicar com o resto da célula através de seu envelope, que consiste em duas membranas. Portanto, essas duas membranas têm que interagir constantemente. Os sítios de contato proteico entre as membranas interna e externa mitocondrial são essenciais nesse sentido. Até o momento, vários locais de contato foram identificados. No método aqui descrito, mitocôndrias de Saccharomyces cerevisiae são usadas para isolar sítios de contato e, assim, identificar candidatos que se qualificam para proteínas de sítio de contato. Usamos este método para identificar o sítio de contato mitocondrial e o complexo do sistema organizador de cristas (MICOS), um dos principais complexos formadores de sítios de contato na membrana interna mitocondrial, que é conservado de leveduras para humanos. Recentemente, aprimoramos ainda mais este método para identificar um novo sítio de contato consistindo de Cqd1 e o complexo Por1-Om14.

Mitochondria perform a variety of different functions in eukaryotes, with the most well-known being the production of ATP through oxidative phosphorylation. Other functions include the production of iron-sulfur clusters, lipid synthesis, and in higher eukaryotes, Ca2+ signaling, and the induction of apoptosis1,2,3,4. These functions are inseparably linked to their complex ultrastructure.
The mitochondrial ultrastructure was first described by electron microscopy5. It was shown that mitochondria are rather complex organelles consisting of two membranes: the mitochondrial outer membrane and the mitochondrial inner membrane. Thus, two aqueous compartments are formed by these membranes: the intermembrane space and the matrix. The mitochondrial inner membrane can be even further divided into different sections. The inner boundary membrane stays in close proximity to the outer membrane, and the cristae form invaginations. So-called crista junctions connect the inner boundary membrane and the cristae (Figure 1). Furthermore, electron micrographs of osmotically shrunken mitochondria reveal that sites exist at which the mitochondrial membranes are tightly connected6,7. These so-called contact sites are formed by protein complexes spanning the two membranes (Figure 1). It is thought that these interaction sites are essential for cell viability due to their importance for the regulation of mitochondrial dynamics and inheritance, as well as the transfer of metabolites and signals between the cytosol and the matrix8.
The MICOS complex in the mitochondrial inner membrane is probably the best characterized and the most versatile contact site-forming complex. MICOS was described in yeast in 2011, and it consists of six subunits9,10,11: Mic60, Mic27, Mic26, Mic19, Mic12, and Mic10. These form a complex of approximately 1.5 MDa that localizes to the crista junctions9,10,11. The deletion of either core subunit, Mic10 or Mic60, leads to the absence of this complex9,11, meaning these two subunits are essential for the stability of MICOS. Interestingly, MICOS forms not only one but multiple contact sites with various mitochondrial outer membrane proteins and complexes: the TOM complex11,12, the TOB/SAM complex9,12,13,14,15,16, the Fzo1-Ugo1 complex9, Por110, OM4510, and Miro17. This strongly indicates that the MICOS complex is involved in various mitochondrial processes, such as protein import, phospholipid metabolism, and the generation of the mitochondrial ultrastructure18. The latter function is probably the major function of&#160;MICOS, as the absence of the MICOS complex induced through the deletion of MIC10&#160;or MIC60&#160;leads to an abnormal mitochondrial ultrastructure that virtually completely lacks regular cristae. Instead, internal membrane vesicles without connection to the inner boundary membrane accumulate19, 20. Importantly, MICOS is conserved in form and function from yeast to&#160;human21. The association of mutations in MICOS subunits with severe human diseases also emphasizes its importance for higher eukaryotes22,23. Although MICOS is highly versatile, additional contact sites must exist (based on our unpublished observations). Indeed, several other contact sites have been identified, for instance, the mitochondrial fusion machineries Mgm1-Ugo1/Fzo124,25,26&#160;or Mdm31-Por1, which is involved in the biosynthesis of the mitochondrial-specific phospholipid cardiolipin27. Recently, we improved the method that led us to the identification of MICOS to identify Cqd1 as part of a novel contact site formed with the outer membrane complex Por1-Om1428. Interestingly, this contact site also seems to be involved in multiple processes such as mitochondrial membrane homeostasis, phospholipid metabolism, and the distribution of coenzyme Q28,29.
Here, we used a variation of the previously described fractionation of mitochondria9,30,31,32,33. Osmotic treatment of mitochondria leads to the disruption of the mitochondrial outer membrane and to a shrinkage of the matrix space, leaving the two membranes only in close proximity at contact sites. This allows for the generation of vesicles that consist exclusively of mitochondrial outer membrane or mitochondrial inner membrane or at contain contact sites of both membranes through mild sonication. Due to the mitochondrial inner membrane possessing a much higher protein-to-lipid ratio, mitochondrial inner membrane vesicles exhibit a higher density compared to mitochondrial outer membrane vesicles. The difference in density can be used to separate the membrane vesicles through sucrose buoyant density gradient centrifugation. Thus, the mitochondrial outer membrane vesicles accumulate at low sucrose concentrations, while the mitochondrial inner membrane vesicles are enriched at high sucrose concentrations. The vesicles containing contact sites concentrate at intermediate sucrose concentrations (Figure 2). The following protocol describes this improved method, which requires less specialized equipment, time, and energy compared to our previously established one32, in detail and provides a useful tool for the identification of possible contact site proteins.

Autor em destaque: Revelando locais de contato mitocondrial e insights arquitetônicos 

Um método aprimorado para isolar locais de contato mitocondrial

We aim to understand the molecular function of mitochondrial contact sites, allowing the communication between the two mitochondrial membranes. This actually is a prerequisite to grasp the function for mitochondrial biogenesis and thus, cell viability. We discovered a new contact site between the mitochondrial inner and outer membrane created by Cqd1 and Om14-Por1.Our data suggests that this site might assist in lipid import like phosphatidic acid. Based on the identification of the MICOS complex, we contributed to get a deeper understanding of how mitochondrial membrane architecture is generated. This allowed us to develop a working model that explains how the two forms of mitochondrial cristae, lamellar and tubular cristae are formed.Our research was done in yeast in the past. However, we are convinced that the formation of correct mitochondrial architecture is important for higher eukaryotes too. So the next step in our research is analyzing the role of mitochondrial architecture elements in more complex models such as primary neurons.

É relativamente fácil separar as membranas internas e externas mitocondriais. No entanto, a geração e separação de vesículas contendo o local de contato são muito mais difíceis. Em nossa opinião, duas etapas são críticas e essenciais: as condições de sonicação e o gradiente utilizado.
Normalmente, acredita-se que os gradientes lineares tenham uma resolução melhor em comparação com os gradientes de passos. No entanto, sua produção reprodutível é tediosa e requer equipame...

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Os sítios de contato mitocondrial são complexos proteicos que interagem com proteínas da membrana interna e externa mitocondriais. Esses sítios são essenciais para a comunicação entre as membranas mitocondriais e, portanto, entre o citosol e a matriz mitocondrial. Aqui, descrevemos um método para identificar candidatos que se qualificam para esta classe específica de proteínas.

Mitochondria are present in virtually all eukaryotic cells and perform essential functions that go far beyond energy production, for instance, the ...

Nosso objetivo é entender a função molecular dos sítios de contato mitocondriais, permitindo a comunicação entre as duas membranas mitocondriais. Isso realmente é um pré-requisito para compreender a função para a biogênese mitocondrial e, portanto, a viabilidade celular. Descobrimos um novo sítio de contato entre a membrana interna e externa mitocondrial criado por Cqd1 e Om14-Por1.Nossos dados sugerem que este local pode auxiliar na importação de lipídios como o ácido fosfatídico. Com base na identificação do complexo MICOS, contribuímos para uma compreensão mais profunda de como a arquitetura da membrana mitocondrial é gerada. Isso nos permitiu desenvolver um modelo de trabalho que explica como as duas formas de cristas mitocondriais, cristas lamelares e tubulares são formadas.Nossa pesquisa foi feita em levedura no passado. No entanto, estamos convencidos de que a formação da arquitetura mitocondrial correta é importante também para eucariotos superiores. Portanto, o próximo passo em nossa pesquisa é analisar o papel dos elementos da arquitetura mitocondrial em modelos mais complexos, como os neurônios primários.

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

An Improved Method to Isolate Mitochondrial Contact Sites

1.0K visualizações.  Ludwig-Maximilians University Munich. Nosso objetivo é entender a função molecular dos sítios de contato mitocondriais, permitindo a comunicação entre as duas membranas mitocondriais. Isso realmente é um pré-requisito para compreender a função para a biogênese mitocondrial e, portanto, a viabilidade celular. Descobrimos um novo sítio de contato entre a membrana interna e externa mitocondrial criado por Cqd1 e Om14-Por1.Nossos dados sugerem que este local pode auxiliar na importação de lipídios como o ácido ...

Vídeo: Autor em destaque: Revelando locais de contato mitocondrial e insights arquitetônicos 

Mitochondria are present in virtually all eukaryotic cells and perform essential functions that go far beyond energy production, for instance, the synthesis of iron-sulfur clusters, lipids, or proteins, Ca2+ buffering, and the induction of apoptosis. Likewise, mitochondrial dysfunction results in severe human diseases such as cancer, diabetes, and neurodegeneration. In order to perform these functions, mitochondria have to communicate with the rest of the cell across their envelope, which consists of two membranes. Therefore, these two membranes have to interact constantly. Proteinaceous contact sites between the mitochondrial inner and outer membranes are essential in this respect. So far, several contact sites have been identified. In the method described here, Saccharomyces cerevisiae mitochondria are used to isolate contact sites and, thus, identify candidates that qualify for contact site proteins. We used this method to identify the mitochondrial contact site and cristae organizing system (MICOS) complex, one of the major contact site-forming complexes in the mitochondrial inner membrane, which is conserved from yeast to humans. Recently, we further improved this method to identify a novel contact site consisting of Cqd1 and the Por1-Om14 complex.

Mitochondrial contact sites are protein complexes that interact with mitochondrial inner and outer membrane proteins. These sites are essential for the communication between the mitochondrial membranes and, thus, between the cytosol and the mitochondrial matrix. Here, we describe a method to identify candidates qualifying for this specific class of proteins.

Bioquímica

Generating Submitochondrial Vesicles from Saccharomyces cerevisiae Mitochondria to Isolate Mitochondrial Contact Sites

Generating Submitochondrial Vesicles from  Saccharomyces cerevisiae Mitochondria to Isolate Mitochondrial Contact Sites  

To begin, take 10 milligrams of freshly-isolated crude yeast mitochondria and re-suspend them in 1.6 milliliters of SM buffer at four degrees celsius by pipetting. Then, transfer the mitochondrial suspension to a pre-cooled 100-milliliter Erlenmeyer flask. Slowly, add 16 milliliters of the swelling buffer, using a 20-milliliter glass pipette while applying constant mild stirring on ice.Incubate the samples under constant mild stirring for 30 minutes on ice. Then, slowly add five milliliters of 2.5-molar sucrose solution using a five-milliliter glass pipette, allowing the inner membrane to shrink. Incubate the samples under mild stirring for 15 minutes on ice.To generate sub-mitochondrial membrane vesicles, transfer the mitochondrial suspension to a pre-cool rosette cell, and sonicate the suspension at 10%amplitude for 30 seconds while cooling the rosette cell in an ice bath. Rest the suspension for 30 seconds in an ice bath.

Gerando Vesículas Submecrimentais de Mitocôndrias de Saccharomyces cerevisiae para Isolar Sítios de Contato Mitocondrial

Separation and Analysis of Submitochondrial Vesicles to Identify Mitochondrial Contact Site Proteins

To begin, take the prepared yeast sub-mitochondrial vesicles and centrifuge the generated vesicles and remaining intact mitochondria at 20, 000 G for 20 minutes at four degrees Celsius. The intact mitochondria formed the pellet while the vesicles stay in the supernatant. Next, transfer the supernatant to fresh ultra centrifugation tubes.Load a cushion of 0.3 milliliters of 2.5 molar sucrose solution at the bottom of the tube using a one milliliter syringe equipped with a cannula, and centrifuge at 118, 000 G for 100 minutes at four degrees Celsius. After centrifugation, the vesicles will appear as a disc on the top of the sucrose cushion. Discard approximately 90%of the supernatant.To harvest the concentrated vesicles, resuspend them in the remaining buffer, including the 2.5 molar sucrose by pipetting. Transfer the suspension to an ice cold Dounce homogenizer and homogenize the suspension using a polytetrafluoroethylene potter with at least 10 strokes. Next, prepare an 11 milliliter step gradient with each layer containing 2.2 milliliters of sucrose solution.Calculate the sucrose concentration using this formula. Add the highest sucrose concentration to the centrifugation tube and place it at minus 20 degrees Celsius until the layer is completely frozen. Measure the sucrose concentration of the samples using a refractometer.If a refractometer is unavailable, assume the sucrose concentration is 2 molar. To adjust the sucrose concentration to 0.6 molars, add the appropriate MOPS, E-D-T-A, P-M-S-F, and protease inhibitor cocktail at pH 7.4. Carefully load the samples on the sucrose gradient to avoid the disturbance of the gradient.Centrifuge the vesicles at 200, 000 G and four degree Celsius for 12 hours. If possible, set slow acceleration and deceleration to avoid disruption of the gradient. Then harvest the gradient from top to bottom in 700 microliters fractions, using a one milliliter pipette.Resulting in 17 fractions, which provides a sufficient resolution. Next, perform two sequentially executed trichloroacetic acid precipitations by adding 200 microliters of 72%trichloroacetic acid to the individual fractions and mixing until the solution is homogeneous. Incubate the fractions for 30 minutes on ice and pellet the precipitated proteins by centrifuging at 20, 000 G and four degrees Celsius for 20 minutes.Discard the supernatant. Add 500 microliters of 28%trichloroacetic acid solution. Mix well and repeat the centrifugation step.Finally, analyze the fractions by SDS-PAGE and immunoblotting. The importance of mild sonication is presented here. The mitochondrial outer membrane marker Tom40 was enriched in the early low density fractions and was virtually absent in the later ones.The mitochondrial inner membrane marker Tim17 was concentrated in high density fractions. In contrast, the contact site protein Mic60 accumulated infractions of intermediate sucrose concentration, indicating the successful generation and subsequent separation of the various membrane vesicles. In contrast, with harsher sonication conditions, the mitochondrial outer membrane marker Tom40 could be detected in lower fractions of the gradient.Additionally, there was a significant amount of Tim17 infractions of intermediate density.