M.E.H., 413985647 numaralı proje olan Deutsche Forschungsgemeinschaft'a (DFG) mali destek için teşekkür eder. Yazarlar, Münih Ludwig-Maximilians Üniversitesi'nden Dr. Michael Kiebler'e cömert ve kapsamlı desteği için teşekkür eder. Walter Neupert'e bilimsel katkıları, faydalı tartışmaları ve devam eden ilhamı için minnettarız. J.F., Münih Yaşam Bilimleri Enstitüsü'ne (LSM) desteği için teşekkür eder.

1. Tamponlar ve stok çözeltileri
<ol><li>Deiyonize suda 1 M 3-morfolinopropan-1-sülfonik asit (MOPS) çözeltisi yapın, pH 7.4. 4 °C'de saklayın.</li>
	<li>Deiyonize suda, pH 8.0 içinde 500 mM etilendiamintetraasetik asit (EDTA) hazırlayın. Oda sıcaklığında saklayın.</li>
	<li>Deiyonize suda 2.4 M sorbitol hazırlayın. Otoklavlamadan sonra oda sıcaklığında saklayın.</li>
	<li>Deiyonize suda 2,5 M sükroz hazırlayın. Otoklavlamadan sonra oda sıcaklığında saklayın.</li>
	<li>İzopropanol içinde 200 mM fenilmetilsülfonil florür (PMSF) hazırlayın. −20 °C'de saklayın. DİKKAT: PMSF yutulduğunda toksiktir ve ciddi cilt yanıklarına ve göz hasarına neden olur. Tozu solumayın ve koruyucu eldiven ve gözlük takın.</li>
	<li>Deiyonize suda %72 trikloroasetik asit (TCA) hazırlayın. 4 °C'de saklayın. DİKKAT: TCA solunum yolu tahrişine, ciddi cilt yanıklarına ve göz hasarına neden olabilir. Tozu solumayın ve koruyucu eldiven ve gözlük takın.</li>
	<li>SM tamponunu hazırlayın: 20 mM MOPS ve 0.6 M sorbitol, pH 7.4.</li>
	<li>Şişme tamponunu hazırlayın: 20 mM MOPS, 0.5 mM EDTA, 1 mM PMSF ve proteaz inhibitör kokteyli, pH 7.4.</li>
	<li>Sükroz gradyan tamponlarını hazırlayın: 20 mM MOPS'ta 0,8 M, 0,96 M, 1,02 M, 1,13 M ve 1,3 M sükroz ve 0,5 mM EDTA, pH 7,4. NOT: Tüm tamponlar 4 °C'de saklanabilir; bununla birlikte, mantar üremesini önlemek için sükroz içeren tamponların -20 °C'de saklanması önerilir. Proteaz inhibitörleri kullanımdan önce taze olarak eklenmelidir.</li>
</ol>2. Submitochondrial veziküllerin oluşumu
<ol><li>Ham maya mitokondrisini yerleşik protokollere göre taze olarak izole edin34,35. NOT: Bu deney için Saccharomyces cerevisiae'den mitokondri izole edilmiştir. Diğer organellerden yoksun gradyan saf mitokondri üretimi gerekli değildir.</li>
	<li>10 mg taze izole edilmiş mitokondriyi 1.6 mL SM tamponunda (4 °C) pipetleme ile yeniden süspanse edin (Şekil 2, adım 1).</li>
	<li>Mitokondriyal süspansiyonu önceden soğutulmuş 100 mL Erlenmeyer şişesine aktarın.</li>
	<li>20 mL'lik bir cam pipet kullanarak yavaşça 16 mL şişme tamponu ekleyin. Ekleme sırasında buz üzerinde sürekli hafif karıştırarak uygulayın. Bu ozmotik arıtma, matris boşluğuna su alımına neden olur. Mitokondriyal iç zarın şişmesi dış zarı bozacaktır. Bununla birlikte, her iki membran da temas bölgelerinde temas halinde kalacaktır9 (Şekil 2, adım 2).</li>
	<li>Numuneleri buz üzerinde 30 dakika boyunca sürekli hafif karıştırarak inkübe edin.</li>
	<li>Numunelerdeki sükroz konsantrasyonunu yaklaşık 0,55 M'ye çıkarmak için 5 mL'lik bir cam pipet kullanarak yavaşça 5 mL 2,5 M sükroz çözeltisi ekleyin. Bu ozmotik işlem, matris36'dan bir su akışı ile sonuçlanır. İç zarın büzülmesi, dış zarın artık parçalarına olan mesafesini en üst düzeye çıkarmak için tasarlanmıştır. Bu, sonikasyon yoluyla iç ve dış zarların yapay hibrit vezikülleri üretme olasılığını azaltır (Şekil 2, adım 3).</li>
	<li>Numuneleri buz üzerinde 15 dakika hafif karıştırarak inkübe edin.</li>
	<li>Submitochondrial membran vezikülleri oluşturmak için mitokondriyi sonikasyona tabi tutun (Şekil 2, adım 4).<ol><li>Mitokondriyal süspansiyonu önceden soğutulmuş bir rozet hücresine aktarın.</li>
		<li>Rozet hücresini bir buz banyosunda soğuturken mitokondriyal süspansiyonu 30 saniye boyunca% 10 genlikte sonikleştirin.</li>
		<li>Süspansiyonu bir buz banyosunda 30 saniye dinlendirin.</li>
		<li>Adım 2.8.2 ve adım 2.8.3'ü üç kez daha tekrarlayın. NOT: Sonikasyon koşulları, kullanılan sonikatöre göre değişecektir. Bireysel makineler için optimizasyon gerekli olacaktır. Çok sert olan sonikasyon, mitokondriyal iç ve dış zarlardan oluşan veziküllerin yapay oluşumuna yol açacaktır.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Submitokondriyal veziküllerin ayrılması
<ol><li>Üretilen vezikülleri, 4 ° C'de 20 dakika boyunca 20.000 x g'da santrifüjleme ile kalan bozulmamış mitokondriden ayırın. Sağlam mitokondri peletlenirken, veziküller süpernatantta kalacaktır.</li>
	<li>Vezikül karışımını konsantre edin.<ol><li>Süpernatanı taze ultrasantrifüj tüplerine aktarın.</li>
		<li>0,8 mm x 120 mm kanül ile donatılmış 1 mL'lik bir şırınga kullanarak tüpün dibine 0,3 mL 2,5 M sükroz çözeltisinden oluşan bir yastık yükleyin.</li>
		<li>4 °C'de 100 dakika boyunca 118.000 x g'da santrifüjleyin. NOT: Burada, maksimum yarıçapı 153,1 mm olan sallanan bir kova rotoru kullanılmıştır. Santrifüjleme koşulları büyük ölçüde rotora bağlıdır ve başka bir rotor kullanıldığında uyarlanması gerekecektir.</li>
	</ol></li>
	<li>Veziküller, santrifüjlemeden sonra sükroz yastığının üstünde bir disk olarak görünecektir. Süpernatantın yaklaşık% 90'ını atın. Şimdi, konsantre vezikülleri, yukarı ve aşağı pipetleyerek 2,5 M sükroz da dahil olmak üzere kalan tamponda yeniden süspanse ederek hasat edin. Süspansiyonu buz gibi bir Dounce homojenizatöre aktarın.</li>
	<li>Bir politetrafloroetilen çömlekçi kullanarak süspansiyonu en az 10 vuruşla homojenize edin.</li>
	<li>Sükroz gradyanını hazırlayın.<ol><li>Beş adımlı 11 mL'lik bir adım gradyanı için (20 mM MOPS ve 0.5 mM EDTA, pH 7.4'te 1.3 M, 1.13 M, 1.02 M, 0.96 M ve 0.8 M sükroz), her katmanda 2.2 mL sükroz çözeltisi bulunur. NOT: Sükroz konsantrasyonlarını ölçmek ve ayarlamak için bir refraktometre önerilir; Ancak, zorunlu değildir. Refraktometreye 10 μL tampon uygulayın ve ilgili kırılma indekslerini tespit edin. Sükroz konsantrasyonunun hesaplanması aşağıdaki gibidir: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/65444/65444eq01v2.jpg" style="margin: auto;"> 1.3333, suyun kırılma indisini temsil eder. 0.048403, sulu çözeltilerde molar kırılmanın sakaroz konsantrasyonuna doğrusal ölçeklenmesinden elde edilen sükroza özgü bir dönüşüm indeksidir 37.</li>
		<li>Santrifüj tüpüne en yüksek sakaroz konsantrasyonunu ekleyin ve tüpü −20 °C'ye koyun. Bir sonrakini uygulamadan önce katmanın tamamen donmasını bekleyin. Son katman eklenene kadar buna göre devam edin ve gradyanları −20 °C'de saklayın. NOT: Gradyanların çözülmesine izin vermek için deneyi başlatırken donmuş gradyanları 4 °C'ye aktarmayı unutmayın. Bu yaklaşık 3 saat sürecektir. Buradaki santrifüjleme için 13.2 mL kapasiteli sallanan bir kova rotoru kullanıldı. Farklı bir rotor kullanıldığında, gradyan adım hacimleri buna göre uyarlanmalıdır.</li>
	</ol></li>
	<li>Bir refraktometre kullanarak numunelerin sakaroz konsantrasyonunu ölçün. Bir refraktometreye erişim yoksa, alternatif olarak sükroz konsantrasyonunun 2 M olduğu varsayılabilir. Bu sözde sükroz konsantrasyonu daha sonra bir sonraki adımın temeli olacaktır.</li>
	<li>Uygun miktarda 20 mM MOPS, 0,5 mM EDTA, 1 mM PMSF ve proteaz inhibitör kokteyli, pH 7,4 ekleyerek sükroz konsantrasyonunu 0,6 M'ye ayarlayın. Sükroz konsantrasyonu ölçülmek yerine 2 M olarak tahmin ediliyorsa, ayarlamadan sonra konsantrasyonun yeterince düşük olup olmadığının test edilmesi önerilir. Bir test tüpünde 200 μL 0.8 M sükrozun üzerine numunenin küçük bir alikotunu (yaklaşık 50 μL) uygulayın. Numune 0.8 M sükrozun üzerinde kalmalıdır.</li>
	<li>Numuneleri (yaklaşık 1 mL) sükroz gradyanının üzerine yükleyin (daha sonra başvurmak üzere %10'u saklayın). Gradyanın bozulmasını önlemek için dikkatli pipetleme önemlidir (Şekil 2, adım 5).</li>
	<li>Vezikülleri 200.000 x g ve 4 °C'de 12 saat santrifüjleyerek ayırın. Mümkünse, gradyanın bozulmasını önlemek için santrifüjü hızlanma ve yavaşlamayı yavaşlatacak şekilde ayarlayın (Şekil 2, adım 6). NOT: Burada, maksimum yarıçapı 153,1 mm olan sallanan bir kova rotoru kullanılmıştır. Santrifüjleme koşulları büyük ölçüde rotora bağlıdır ve başka bir rotor kullanıldığında uyarlanması gerekecektir.</li>
	<li>1 mL'lik bir pipet kullanarak gradyanı yukarıdan aşağıya 700 μL'lik fraksiyonlar halinde hasat edin. Bu, yeterli bir çözünürlüğe izin veren 17 kesirle sonuçlanacaktır.</li>
</ol>4. Submitochondrial veziküllerin analizi
<ol><li>SDS-PAGE numunelerini hazırlamak için her bir fraksiyonu ardışık olarak gerçekleştirilen iki TCA çökeltisine38 tabi tutarak proteinleri konsantre edin.<ol><li>Tek tek fraksiyonlara 200 μL% 72 TCA ekleyin ve çözelti homojen olana kadar karıştırın. Fraksiyonları buz üzerinde 30 dakika inkübe edin ve çökeltilmiş proteinleri 20.000 x g ve 4 ° C'de 20 dakika santrifüjleyerek peletleyin. Süpernatanı atın, 500 μL %28 TCA çözeltisi ekleyin, iyice karıştırın ve santrifüjleme adımını tekrarlayın.</li>
		<li>Peletleri 1 mL asetonla (-20°C) yıkayın ve 20.000 x g ve 4 °C'de 10 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı atın ve peletlerin kurumasını bekleyin. Peletleri 60 μL SDS numune tamponunda yeniden süspanse edin ve numuneleri 95 °C'de 5 dakika inkübe edin. NOT: İlk TCA çökelmesinden sonra, özellikle yüksek yoğunluklu fraksiyonlarda büyük miktarda sükroz kalacaktır. Bu, ek TCA yağışı yoluyla ortadan kaldırılacaktır.</li>
	</ol></li>
	<li>SDS-PAGE39 ve immünoblotlama 40,41,42,43 ile her fraksiyonun 20 μL'sini analiz edin.</li>
</ol>

Mitokondriyal Temas Bölgelerinin İzolasyonu

Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.

Mitokondriyal alt fraksiyonlama, oldukça karmaşık birkaç adımdan oluşan karmaşık bir deneydir. Bu nedenle, yerleşik yöntemimizi daha da geliştirmeyi ve bir dereceye kadar basitleştirmeyi amaçladık32. Buradaki zorluklar, genellikle bireysel yapılar olan karmaşık ve son derece özel ekipman gereksinimi ve muazzam zaman ve enerji tüketimiydi. Bu amaçla, doğrusal gradyanı dökmek ve hasat etmek için kullanılan pompaları ve münferit yapıları kaldırmaya çalıştık ve kademe...

Mitokondri, ökaryotlarda çeşitli farklı işlevleri yerine getirir, en bilineni oksidatif fosforilasyon yoluyla ATP üretimidir. Diğer işlevler arasında demir-kükürt kümelerinin üretimi, lipid sentezi ve daha yüksek ökaryotlardaCa2+ sinyali ve apoptoz 1,2,3,4'ün indüksiyonu yer alır. Bu işlevler, karmaşık üst yapılarıyla ayrılmaz bir şekilde bağlantılıdır.
Mitokondriyal üst yapı ilk olarak elektron mikroskobu5 ile tanımlanmıştır. Mitokondrinin iki zardan oluşan oldukça karmaşık organeller olduğu gösterilmiştir: mitokondriyal dış zar ve mitokondriyal iç zar. Böylece, bu membranlar tarafından iki sulu bölme oluşturulur: zarlar arası boşluk ve matris. Mitokondriyal iç zar daha da farklı bölümlere ayrılabilir. İç sınır zarı, dış zara yakın durur ve cristae istilalar oluşturur. Crista bağlantıları, iç sınır zarını ve cristae'yi birbirine bağlar (Şekil 1). Ayrıca, ozmotik olarak küçülmüş mitokondrinin elektron mikrografları, mitokondriyal zarların sıkıca bağlandığı bölgelerin var olduğunu ortaya koymaktadır 6,7. Bu sözde temas bölgeleri, iki zarı kapsayan protein kompleksleri tarafından oluşturulur (Şekil 1). Bu etkileşim bölgelerinin, mitokondriyal dinamiklerin ve kalıtımın düzenlenmesinin yanı sıra sitozol ve matris8 arasındaki metabolitlerin ve sinyallerin transferi için önemleri nedeniyle hücre canlılığı için gerekli olduğu düşünülmektedir.
Mitokondriyal iç zardaki MICOS kompleksi, muhtemelen en iyi karakterize edilen ve en çok yönlü temas bölgesi oluşturan komplekstir. MICOS 2011 yılında mayada tanımlanmıştır ve altı alt birimdenoluşur 9,10,1 1: Mic60, Mic27, Mic26, Mic19, Mic12 ve Mic10. Bunlar, 9,10,11 crista kavşaklarına lokalize olan yaklaşık 1.5 MDa'lık bir kompleks oluşturur. Çekirdek alt birimin, Mic10 veya Mic60'ın silinmesi, bu karmaşık 9,11'in yokluğuna yol açar, yani bu iki alt birim MICOS'un kararlılığı için gereklidir. İlginç bir şekilde, MICOS çeşitli mitokondriyal dış zar proteinleri ve kompleksleri ile sadece bir değil, birden fazla temas bölgesi oluşturur: TOM kompleksi 11,12, TOB / SAM kompleksi 9,12,13,14,15,16, Fzo1-Ugo1 kompleksi9, Por1 10, OM45 10 ve Miro 17. Bu, MICOS kompleksinin protein ithalatı, fosfolipid metabolizması ve mitokondriyal ultrayapının18 oluşumu gibi çeşitli mitokondriyal süreçlerde yer aldığını güçlü bir şekilde gösterir. MIC10 veya MIC60'ın silinmesiyle indüklenen MICOS kompleksinin yokluğu, neredeyse tamamen düzenli kristadan yoksun anormal bir mitokondriyal üst yapıya yol açtığından, ikinci işlev muhtemelen MICOS'un ana işlevidir. Bunun yerine, iç sınır zarına bağlantısı olmayan iç zar vezikülleri19, 20 biriktirir. Daha da önemlisi, MICOS mayadan insana kadar form ve işlev bakımından korunur21. MICOS alt birimlerindeki mutasyonların ciddi insan hastalıkları ile ilişkisi, daha yüksek ökaryotlar için önemini de vurgulamaktadır22,23. MICOS çok yönlü olmasına rağmen, ek temas siteleri mevcut olmalıdır (yayınlanmamış gözlemlerimize dayanarak). Gerçekten de, mitokondriyal spesifik fosfolipid kardiyolipin27'nin biyosentezinde yer alan mitokondriyal füzyon makineleri Mgm1-Ugo1 / Fzo124,25,26 veya Mdm31-Por1 gibi birkaç başka temas bölgesi tanımlanmıştır. Son zamanlarda, dış membran kompleksi Por1-Om1428 ile oluşturulan yeni bir temas bölgesinin parçası olarak Cqd1'i tanımlamak için bizi MICOS'un tanımlanmasına götüren yöntemi geliştirdik. İlginç bir şekilde, bu temas bölgesi aynı zamanda mitokondriyal membran homeostazı, fosfolipid metabolizması ve koenzim Q28,29'un dağılımı gibi çoklu süreçlerde yer alıyor gibi görünmektedir.
Burada, daha önce tarif edilen mitokondrifraksiyonunun bir varyasyonunu kullandık 9,30,31,32,33. Mitokondrinin ozmotik tedavisi, mitokondriyal dış zarın bozulmasına ve matris boşluğunun büzülmesine yol açar ve iki zarı sadece temas bölgelerinde yakın mesafede bırakır. Bu, yalnızca mitokondriyal dış zardan veya mitokondriyal iç zardan oluşan veziküllerin üretilmesine veya hafif sonikasyon yoluyla her iki zarın temas bölgelerini içermesine izin verir. Mitokondriyal iç zarın çok daha yüksek protein-lipit oranına sahip olması nedeniyle, mitokondriyal iç zar vezikülleri, mitokondriyal dış zar veziküllerine kıyasla daha yüksek bir yoğunluk sergiler. Yoğunluk farkı, sükroz yüzdürme yoğunluğu gradyan santrifüjlemesi yoluyla membran veziküllerini ayırmak için kullanılabilir. Böylece, mitokondriyal dış zar vezikülleri düşük sükroz konsantrasyonlarında birikirken, mitokondriyal iç zar vezikülleri yüksek sükroz konsantrasyonlarında zenginleşir. Temas bölgelerini içeren veziküller, ara sükroz konsantrasyonlarında yoğunlaşır (Şekil 2). Aşağıdaki protokol, daha önce kurduğumuz32 yönteme kıyasla daha az özel ekipman, zaman ve enerji gerektiren bu geliştirilmiş yöntemi ayrıntılı olarak açıklamakta ve olası temas bölgesi proteinlerinin tanımlanması için yararlı bir araç sağlamaktadır.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>13.2 mL, Open-Top Thinwall Ultra-Clear Tube, 14 x 89mm</td>
			<td>Beckman Instruments, Germany</td>
			<td>344059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL, Open-Top Thickwall Polycarbonate Open-Top Tube, 29 x 104mm</td>
			<td>Beckman Instruments, Germany</td>
			<td>363647</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A-25.50 Fixed-Angle Rotor- Aluminum, 8 x 50 mL, 25,000 rpm, 75,600 x g</td>
			<td>Beckman Instruments, Germany</td>
			<td>363055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Abbe refractometer</td>
			<td>Zeiss, Germany</td>
			<td></td>
			<td>discontinued, 
			any pipet controller will suffice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>accu-jet pro Pipet Controller</td>
			<td>Brandtech, USA</td>
			<td>BR26320</td>
			<td>discontinued, 
			any pipet controller will suffice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beaker 1000 mL</td>
			<td>DWK Life Science, Germany</td>
			<td>C118.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Branson&#160; Digital Sonifier W-250 D</td>
			<td>Branson Ultrasonics, USA</td>
			<td>FIS15-338-125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Branson Ultrasonic 3mm TAPERED MICROTIP</td>
			<td>Branson Ultrasonics, USA</td>
			<td>101-148-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Branson Ultrasonics 200- and 400-Watt Sonifiers: Rosette Cooling Cell</td>
			<td>Branson Ultrasonics, USA</td>
			<td>15-338-70</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Avanti JXN-26</td>
			<td>Beckman Instruments, Germany</td>
			<td>B37912</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Optima XPN-100 ultra</td>
			<td>Beckman Instruments, Germany</td>
			<td>8043-30-0031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cOmplete Proteaseinhibtor-Cocktail</td>
			<td>Roche, Switzerland</td>
			<td>11697498001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Sorbit</td>
			<td>Roth, Germany</td>
			<td>6213</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA (Ethylendiamin-tetraacetic acid disodium salt dihydrate)</td>
			<td>Roth, Germany</td>
			<td>8043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Erlenmeyer flask, 100 mL</td>
			<td>Roth, Germany</td>
			<td>X747.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>graduated pipette, Kl. B, 25:0, 0.1</td>
			<td>Hirschmann, Germany</td>
			<td>1180170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>graduated pipette, Kl. B, 5:0, 0.05</td>
			<td>Hirschmann, Germany</td>
			<td>1180153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ice bath</td>
			<td>neoLab, Germany</td>
			<td>&#160;S12651</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stirrer RCT basic</td>
			<td>IKA-Werke GmbH, Germany</td>
			<td>Z645060GB-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOPS (3-(N-Morpholino)propanesulphonic acid)</td>
			<td>Gerbu, Germany</td>
			<td>1081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MyPipetman Select P1000</td>
			<td>Gilson, USA</td>
			<td>FP10006S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MyPipetman Select P20</td>
			<td>Gilson, USA</td>
			<td>FP10003S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MyPipetman Select P200</td>
			<td>Gilson, USA</td>
			<td>FP10005S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Omnifix 1 mL</td>
			<td>Braun, Germany</td>
			<td>4022495251879</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)</td>
			<td>Serva, Germany</td>
			<td>32395.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>STERICAN cannula 21 Gx4 4/5 0.8x120 mm</td>
			<td>Braun, Germany</td>
			<td>4022495052414</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>stirring bar, 15 mm</td>
			<td>VWR, USA</td>
			<td>442-0366</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Merck, Germany</td>
			<td>S8501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SW 41 Ti Swinging-Bucket Rotor</td>
			<td>Beckman Instruments, Germany</td>
			<td>331362</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Test tubes</td>
			<td>Eppendorf, Germany</td>
			<td>3810X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue grinders, Potter-Elvehjem type, 2 mL glass vessel</td>
			<td>VWR, USA</td>
			<td>432-0200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue grinders, Potter-Elvehjem type, 2 mL plunger with serrated tip</td>
			<td>VWR, USA</td>
			<td>432-0212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trichloroacetic acid (TCA)</td>
			<td>Sigma Aldrich, Germany</td>
			<td>33731</td>
			<td>discontinued, 
			any TCA will suffice (CAS: 73-03-9)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIS</td>
			<td>Roth, Germany</td>
			<td>4855</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an improved method to isolate mitochondrial contact sites

Mitokondri hemen hemen tüm ökaryotik hücrelerde bulunur ve enerji üretiminin çok ötesine geçen temel işlevleri yerine getirir, örneğin demir-kükürt kümelerinin, lipitlerin veya proteinlerin sentezi,Ca2+ tamponlama ve apoptozun indüksiyonu. Benzer şekilde, mitokondriyal disfonksiyon kanser, diyabet ve nörodejenerasyon gibi ciddi insan hastalıklarına neden olur. Bu işlevleri yerine getirmek için mitokondri, iki zardan oluşan zarfları boyunca hücrenin geri kalanıyla iletişim kurmak zorundadır. Bu nedenle, bu iki zar sürekli etkileşim halinde olmak zorundadır. Mitokondriyal iç ve dış zarlar arasındaki proteinli temas bölgeleri bu açıdan gereklidir. Şimdiye kadar, birkaç temas yeri tespit edildi. Burada açıklanan yöntemde, Saccharomyces cerevisiae mitokondri, temas bölgelerini izole etmek ve böylece temas bölgesi proteinleri için uygun adayları belirlemek için kullanılır. Bu yöntemi, mayadan insanlara kadar korunan mitokondriyal iç zardaki ana temas bölgesi oluşturan komplekslerden biri olan mitokondriyal temas bölgesini ve cristae organizasyon sistemi (MICOS) kompleksini tanımlamak için kullandık. Son zamanlarda, Cqd1 ve Por1-Om14 kompleksinden oluşan yeni bir temas bölgesini tanımlamak için bu yöntemi daha da geliştirdik.

Mitochondria perform a variety of different functions in eukaryotes, with the most well-known being the production of ATP through oxidative phosphorylation. Other functions include the production of iron-sulfur clusters, lipid synthesis, and in higher eukaryotes, Ca2+ signaling, and the induction of apoptosis1,2,3,4. These functions are inseparably linked to their complex ultrastructure.
The mitochondrial ultrastructure was first described by electron microscopy5. It was shown that mitochondria are rather complex organelles consisting of two membranes: the mitochondrial outer membrane and the mitochondrial inner membrane. Thus, two aqueous compartments are formed by these membranes: the intermembrane space and the matrix. The mitochondrial inner membrane can be even further divided into different sections. The inner boundary membrane stays in close proximity to the outer membrane, and the cristae form invaginations. So-called crista junctions connect the inner boundary membrane and the cristae (Figure 1). Furthermore, electron micrographs of osmotically shrunken mitochondria reveal that sites exist at which the mitochondrial membranes are tightly connected6,7. These so-called contact sites are formed by protein complexes spanning the two membranes (Figure 1). It is thought that these interaction sites are essential for cell viability due to their importance for the regulation of mitochondrial dynamics and inheritance, as well as the transfer of metabolites and signals between the cytosol and the matrix8.
The MICOS complex in the mitochondrial inner membrane is probably the best characterized and the most versatile contact site-forming complex. MICOS was described in yeast in 2011, and it consists of six subunits9,10,11: Mic60, Mic27, Mic26, Mic19, Mic12, and Mic10. These form a complex of approximately 1.5 MDa that localizes to the crista junctions9,10,11. The deletion of either core subunit, Mic10 or Mic60, leads to the absence of this complex9,11, meaning these two subunits are essential for the stability of MICOS. Interestingly, MICOS forms not only one but multiple contact sites with various mitochondrial outer membrane proteins and complexes: the TOM complex11,12, the TOB/SAM complex9,12,13,14,15,16, the Fzo1-Ugo1 complex9, Por110, OM4510, and Miro17. This strongly indicates that the MICOS complex is involved in various mitochondrial processes, such as protein import, phospholipid metabolism, and the generation of the mitochondrial ultrastructure18. The latter function is probably the major function of&#160;MICOS, as the absence of the MICOS complex induced through the deletion of MIC10&#160;or MIC60&#160;leads to an abnormal mitochondrial ultrastructure that virtually completely lacks regular cristae. Instead, internal membrane vesicles without connection to the inner boundary membrane accumulate19, 20. Importantly, MICOS is conserved in form and function from yeast to&#160;human21. The association of mutations in MICOS subunits with severe human diseases also emphasizes its importance for higher eukaryotes22,23. Although MICOS is highly versatile, additional contact sites must exist (based on our unpublished observations). Indeed, several other contact sites have been identified, for instance, the mitochondrial fusion machineries Mgm1-Ugo1/Fzo124,25,26&#160;or Mdm31-Por1, which is involved in the biosynthesis of the mitochondrial-specific phospholipid cardiolipin27. Recently, we improved the method that led us to the identification of MICOS to identify Cqd1 as part of a novel contact site formed with the outer membrane complex Por1-Om1428. Interestingly, this contact site also seems to be involved in multiple processes such as mitochondrial membrane homeostasis, phospholipid metabolism, and the distribution of coenzyme Q28,29.
Here, we used a variation of the previously described fractionation of mitochondria9,30,31,32,33. Osmotic treatment of mitochondria leads to the disruption of the mitochondrial outer membrane and to a shrinkage of the matrix space, leaving the two membranes only in close proximity at contact sites. This allows for the generation of vesicles that consist exclusively of mitochondrial outer membrane or mitochondrial inner membrane or at contain contact sites of both membranes through mild sonication. Due to the mitochondrial inner membrane possessing a much higher protein-to-lipid ratio, mitochondrial inner membrane vesicles exhibit a higher density compared to mitochondrial outer membrane vesicles. The difference in density can be used to separate the membrane vesicles through sucrose buoyant density gradient centrifugation. Thus, the mitochondrial outer membrane vesicles accumulate at low sucrose concentrations, while the mitochondrial inner membrane vesicles are enriched at high sucrose concentrations. The vesicles containing contact sites concentrate at intermediate sucrose concentrations (Figure 2). The following protocol describes this improved method, which requires less specialized equipment, time, and energy compared to our previously established one32, in detail and provides a useful tool for the identification of possible contact site proteins.

Yazar Spotlight: Mitokondriyal İletişim Sitelerinin ve Mimari İçgörülerin Ortaya Çıkarılması 

Mitokondriyal Temas Bölgelerini İzole Etmek için Geliştirilmiş Bir Yöntem

We aim to understand the molecular function of mitochondrial contact sites, allowing the communication between the two mitochondrial membranes. This actually is a prerequisite to grasp the function for mitochondrial biogenesis and thus, cell viability. We discovered a new contact site between the mitochondrial inner and outer membrane created by Cqd1 and Om14-Por1.Our data suggests that this site might assist in lipid import like phosphatidic acid. Based on the identification of the MICOS complex, we contributed to get a deeper understanding of how mitochondrial membrane architecture is generated. This allowed us to develop a working model that explains how the two forms of mitochondrial cristae, lamellar and tubular cristae are formed.Our research was done in yeast in the past. However, we are convinced that the formation of correct mitochondrial architecture is important for higher eukaryotes too. So the next step in our research is analyzing the role of mitochondrial architecture elements in more complex models such as primary neurons.

Mitokondriyal iç ve dış zarları ayırmak nispeten kolaydır. Bununla birlikte, temas yeri içeren veziküllerin oluşturulması ve ayrılması çok daha zordur. Bize göre, iki adım kritik ve esastır: sonikasyon koşulları ve kullanılan gradyan.
Genellikle, doğrusal gradyanların adım gradyanlarına kıyasla daha iyi bir çözünürlüğe sahip olduğu düşünülür. Bununla birlikte, tekrarlanabilir üretimleri sıkıcıdır ve özel ekipman gerektirir. Bu nedenle, tek tek adımlar...

Watch this Scientific Journal Video about Unveiling Mitochondrial Contact Sites and Architectural Insights at JoVE.com

Mitokondriyal temas bölgeleri, mitokondriyal iç ve dış zar proteinleri ile etkileşime giren protein kompleksleridir. Bu bölgeler, mitokondriyal membranlar arasındaki ve dolayısıyla sitozol ile mitokondriyal matris arasındaki iletişim için gereklidir. Burada, bu spesifik protein sınıfına uygun adayları belirlemek için bir yöntem açıklıyoruz.

Mitochondria are present in virtually all eukaryotic cells and perform essential functions that go far beyond energy production, for instance, the ...

İki mitokondriyal membran arasındaki iletişimi sağlayan mitokondriyal temas bölgelerinin moleküler işlevini anlamayı amaçlıyoruz. Bu aslında mitokondriyal biyogenez işlevini ve dolayısıyla hücre canlılığını kavramak için bir ön koşuldur. Cqd1 ve Om14-Por1 tarafından oluşturulan mitokondriyal iç ve dış zar arasında yeni bir temas bölgesi keşfettik.Verilerimiz, bu sitenin fosfatidik asit gibi lipit ithalatına yardımcı olabileceğini düşündürmektedir. MICOS kompleksinin tanımlanmasına dayanarak, mitokondriyal membran mimarisinin nasıl oluşturulduğuna dair daha derin bir anlayış elde etmeye katkıda bulunduk. Bu, iki mitokondriyal cristae, lameller ve tübüler cristae formunun nasıl oluştuğunu açıklayan bir çalışma modeli geliştirmemizi sağladı.Araştırmamız geçmişte mayada yapıldı. Bununla birlikte, doğru mitokondriyal mimarinin oluşumunun daha yüksek ökaryotlar için de önemli olduğuna inanıyoruz. Bu yüzden araştırmamızdaki bir sonraki adım, birincil nöronlar gibi daha karmaşık modellerde mitokondriyal mimari elemanlarının rolünü analiz etmektir.

an-improved-method-to-isolate-mitochondrial-contact-sites

Research

JoVE Journal

Biochemistry

An Improved Method to Isolate Mitochondrial Contact Sites

1.0K Görüntüleme.  Ludwig-Maximilians University Munich. İki mitokondriyal membran arasındaki iletişimi sağlayan mitokondriyal temas bölgelerinin moleküler işlevini anlamayı amaçlıyoruz. Bu aslında mitokondriyal biyogenez işlevini ve dolayısıyla hücre canlılığını kavramak için bir ön koşuldur. Cqd1 ve Om14-Por1 tarafından oluşturulan mitokondriyal iç ve dış zar arasında yeni bir temas bölgesi keşfettik.Verilerimiz, bu sitenin fosfatidik asit gibi lipit ithalatına yardımcı olabileceğini düşündürmektedir....