تم دعم هذا العمل من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (NFSC 82101224 إلى YG)

تمت الموافقة على جميع التجارب على (رقم 2021-847) من قبل لجنة جامعة شيان جياوتونغ لاستخدام ورعايتها.
1. التعقيم وإعداد المواد
<ol><li>تعقيم أدوات التشريح باستخدام التطهير بالبخار بدرجة حرارة عالية وضغط عال وتجفيفها في حاضنة 50 درجة مئوية طوال الليل.</li>
	<li>تحضير 100 مل من وسط الاستزراع الذي يحتوي على 10٪ مصل بقري جنيني (FBS) و 10 ملغ / مل من البنسلين / الستربتومايسين (أضف 10 مل من FBS و 10 ميكرولتر من محلول مخزون البنسلين إلى 90 مل من وسط النسر المعدل (EMEM) من Dulbecco) مسبقا وتخزينها في درجة حرارة 4 درجات مئوية.</li>
</ol>2. تشريح وإزالة العظم الصدغي لجمع الظهارة السمعية
<ol><li>القتل الرحيم لما مجموعه 10 فئران حديثي الولادة (تتراوح أعمارهم بين P3 و P5) عن طريق قطع الرأس على الجليد. استخدم منهجية بديلة معتمدة أخلاقيا ، إذا لزم الأمر.</li>
	<li>ثبت الرأس في مكانه ، وافتح فروة الرأس على طول الخيط السهمي باستخدام مقص التشغيل الدقيق ، وافصل فروة الرأس وثبتها بشكل ثنائي بالأصابع ، كما هو موضح في الشكل 1 أ.</li>
	<li>قم بإزالة الدماغ باستخدام مصعد صغير السمحاق وقسم الجمجمة القاعدية. قطع الجمجمة بالمقص والوجه للأمام لفتح الجمجمة. استخدم طرف المقص لكشط الدماغ وفضح قاعدة الجمجمة.</li>
	<li>راقب العظام الصدغية الثنائية في قاعدة الجمجمة (الشكل 1C). استخدم المقص لقطع قاعدة الجمجمة على طول خط الوسط ، وكشط الجلد ، وإزالة أي عظم غير ضروري (الشكل 1D ، D ').</li>
	<li>احتفظ بالعظام الصدغية وانقلها إلى أطباق بتري معقمة مقاس 35 مم تحتوي على محلول ملح هانك المتوازن الطازج (HBSS) (الشكل 1E).</li>
	<li>استخدم ملقطين #5 مدببين لإزالة الفقاعة والأنسجة المحيطة بها من الجزء الصخري من العظم الصدغي (الشكل 1E). ملاحظة: في هذه المرحلة ، لن تكون المتاهة العظمية في العظم الصدغي للفئران متكلسة تماما ويمكن تشريحها بسهولة باستخدام الملقط.</li>
	<li>أمسك الملقط بيد واحدة لإصلاح الجزء نصف الدائري من العظم الصدغي وألصق القدم السفلية للملقط في مكان النافذة المستديرة باليد الأخرى لفصل العظم الجانبي للقوقعة عن دهليز سكالا. قم بإزالة الجزء الصخري من العظم الصدغي بعناية دون لمس ظهارة OC. بعد ذلك ، افصل بعناية وأزل المتاهة العظمية للقوقعة من النهاية القاعدية إلى النهاية القمية (الشكل 1F).</li>
	<li>قم بعزل عضو ظهارة كورتي الحسية بعناية من modiolus باستخدام ملقط # 5 مدبب (الشكل 1G).</li>
	<li>أمسك الرباط الحلزوني ، وافصله بعناية عن الأوعية الدموية السطورية باستخدام ملقط التشغيل الجزئي ، وانقل الظهارة السمعية النظيفة إلى طبق ثقافة معقم 3 مم يحتوي على HBSS باستخدام ماصة 200 ميكرولتر (الشكل 1H).</li>
	<li>اجمع 20 عينة من كل وانقلها بسرعة إلى طبق بتري معقم 100 مم يحتوي على HBSS لخطوة التحضير التالية (الشكل 1).</li>
</ol>3. التصنيف الأنزيمي للحصول على خلايا الشعر السمعية
<ol><li>نقل ظهارة السمع إلى 10 مل من DMEM الطازجة التي تحتوي على 0.25٪ التربسين واحتضانها عند 37 درجة مئوية لمدة 12 دقيقة.</li>
	<li>باستخدام طرف ماصة سعة 200 ميكرولتر ، افصل خلايا الشعر برفق عن الصفيحة القاعدية والخلايا الأخرى تحت مجهر التشغيل.</li>
	<li>أضف 10 مل أخرى من وسط الاستزراع لمنع التصنيف.</li>
	<li>قم بتصفية الخلايا العالقة في وسط الاستزراع من خلال مرشح 70 ميكرومتر ، وجمع المرشح في أنبوب نظيف سعة 50 مل ، وطرده مركزيا عند 300 × جم لمدة 5 دقائق.</li>
	<li>أعد تعليق خلايا الشعر في 5 مل على الأقل من وسط المزرعة عن طريق سحبها برفق لأعلى ولأسفل باستخدام طرف ماصة 1000 ميكرولتر. تجنب إدخال الفقاعات.</li>
	<li>ضع غطاء في الجزء السفلي من لوحة ستة آبار مقدما. عد الخلايا واستزراعها بكثافة 106 خلايا / مل في ألواح من ستة آبار.</li>
	<li>تنمو الخلايا الملتصقة في 2 مل من DMEM (تحتوي على 10٪ من FBS ، و 100 وحدة / مل من البنسلين ، و 100 ميكروغرام / مل من الستربتومايسين) عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2. تغيير وسط الثقافة كل يوم. ملاحظة: تجدر الإشارة إلى أن استخدام هذا البروتوكول لا يؤدي إلى الحصول على خلايا الشعر النقية. بناء على طريقة زراعة الخلايا الأولية هذه ، نوصي باستخدام خلايا d2 أو d3 لمزيد من الدراسات ، حيث قد تشكل خلايا الشعر حوالي 70٪ من الخلايا في المزرعة وتكون في حالة جيدة.</li>
</ol>4. تلطيخ المناعي
<ol><li>حصاد الخلايا المستزرعة من d1 إلى d6 (بئر واحد في اليوم). نضح وسط الثقافة وشطف الخلايا 2x بمحلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS).</li>
	<li>إصلاح الخلايا مع 4٪ بارافورمالدهيد لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (RT).</li>
	<li>قم بإزالة الخلايا المثبتة وشطف لمدة 3 × 3 دقائق باستخدام برنامج تلفزيوني.</li>
	<li>تتخلل الخلايا مع PBS التي تحتوي على 0.2٪ Triton X-100 لمدة 10 دقائق في RT.</li>
	<li>احتضان الخلايا المتداخلة بمحلول مانع يتكون من 10٪ FBS في PBS لمدة 20 دقيقة في RT.</li>
	<li>قم بتلطيخ الخلايا بجسم مضاد أحادي النسيلة مضاد للميوسين (مخفف عند 1: 200 في PBS) عند 4 درجات مئوية طوال الليل.</li>
	<li>اغسل الخلايا 3x باستخدام PBS المعقم واحتضانها بجسم مضاد ثانوي (Alexa Fluor 594 الماعز المضاد للأرانب MYO7A ، المخفف 1: 500 في PBS) والفولويدين المسمى بالفلوريسئين (Alexa Fluor 488 ، لتحديد بنية الخلية) لمدة 2 ساعة في RT.</li>
	<li>شطف الخلايا 3x مع برنامج تلفزيوني لإزالة الأجسام المضادة الثانوية.</li>
	<li>أضف 1-2 قطرات من وسيط التركيب باستخدام DAPI على الشرائح ، وقم بتركيب قسائم الغطاء ، وضعها تحت مجهر المسح بالليزر متحد البؤر لالتقاط صور للخلايا.</li>
</ol>5. التحليل الإحصائي
<ol><li>قم بإجراء تحليل ثنائي الاتجاه للتباين (ANOVA) متبوعا باختبارات Tukey اللاحقة لتحليل التغيرات في القيم الرمادية للميوسين-VIIa و phalloidin بمرور الوقت. استخدم طريقة تعليم الحروف لتمييز الفروق الإحصائية.</li>
	<li>قم بإجراء ANOVAs إضافية أحادية الاتجاه متبوعة باختبارات Tukey اللاحقة لمقارنة نسبة الخلايا الإيجابية للفالويدين بين عينات الخلايا من اليوم 1 إلى اليوم 6 ونسبة الخلايا الإيجابية للميوسين السابع في نفس الأيام.</li>
</ol>

كفاءة زراعة خلايا شعر قوقعة الفأر في المختبر

<ol>
	<li>Tani, T., Koike-Tani, M., Tran, M. T., Shribak, M., Levic, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postnatal+structural+development+of+mammalian+Basilar+Membrane+provides+anatomical+basis+for+the+maturation+of+tonotopic+maps+and+frequency+tuning.">Postnatal structural development of mammalian Basilar Membrane provides anatomical basis for the maturation of tonotopic maps and frequency tuning.</a> Sci Rep. 11 (1), 7581 (2021).</li><li>Goutman, J. D., Elgoyhen, A. B., Gomez-Casati, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cochlear+hair+cells:+The+sound-sensing+machines.">Cochlear hair cells: The sound-sensing machines.</a> FEBS Lett. 589 (22), 3354-3361 (2015).</li><li>Joo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Contribution+of+Ototoxic+Medications+to+Hearing+Loss+Among+Older+Adults.">The Contribution of Ototoxic Medications to Hearing Loss Among Older Adults.</a> J Gerontol A Biol Sci Med Sci. 75 (3), 561-566 (2020).</li><li>Nieman, C. L., Oh, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hearing+Loss.">Hearing Loss.</a> Ann Intern Med. 173 (11), ITC81-ITC96 (2020).</li><li>Mao, H., Chen, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noise-Induced+Hearing+Loss:+Updates+on+Molecular+Targets+and+Potential+Interventions.">Noise-Induced Hearing Loss: Updates on Molecular Targets and Potential Interventions.</a> Neural Plast. 2021, 4784385 (2021).</li><li>Morioka, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hearing+vulnerability+after+noise+exposure+in+a+mouse+model+of+reactive+oxygen+species+overproduction.">Hearing vulnerability after noise exposure in a mouse model of reactive oxygen species overproduction.</a> J Neurochem. 146 (4), 459-473 (2018).</li><li>Liu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+and+cytological+profiling+of+biological+aging+of+mouse+cochlear+inner+and+outer+hair+cells.">Molecular and cytological profiling of biological aging of mouse cochlear inner and outer hair cells.</a> Cell Rep. 39 (2), 110665 (2022).</li><li>Ogier, J. M., Burt, R. A., Drury, H. R., Lim, R., Nayagam, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+Culture+of+Neonatal+Murine+Inner+Ear+Explants.">Organotypic Culture of Neonatal Murine Inner Ear Explants.</a> Front Cell Neurosci. 13, 170 (2019).</li><li>Ding, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cisplatin+ototoxicity+in+rat+cochlear+organotypic+cultures.">Cisplatin ototoxicity in rat cochlear organotypic cultures.</a> Hear Res. 282 (1-2), 196-203 (2011).</li><li>Abitbol, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cisplatin-induced+ototoxicity+in+organotypic+cochlear+cultures+occurs+independent+of+gap+junctional+intercellular+communication.">Cisplatin-induced ototoxicity in organotypic cochlear cultures occurs independent of gap junctional intercellular communication.</a> Cell Death Dis. 11 (5), 342 (2020).</li><li>Li, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myosin-VIIa+is+expressed+in+multiple+isoforms+and+essential+for+tensioning+the+hair+cell+mechanotransduction+complex.">Myosin-VIIa is expressed in multiple isoforms and essential for tensioning the hair cell mechanotransduction complex.</a> Nat Commun. 11 (1), 2066 (2020).</li><li>Kalinec, G. M., Park, C., Thein, P., Kalinec, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Working+with+auditory+HEI-OC1+cells.">Working with auditory HEI-OC1 cells.</a> J Vis Exp. (115), (2016).</li><li>Montgomery, S. C., Cox, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+mount+dissection+and+immunofluorescence+of+the+adult+mouse+cochlea.">Whole mount dissection and immunofluorescence of the adult mouse cochlea.</a> J Vis Exp. (107), (2016).</li><li>Xu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+mouse+cochlear+progenitors+that+develop+hair+and+supporting+cells+in+the+organ+of+Corti.">Identification of mouse cochlear progenitors that develop hair and supporting cells in the organ of Corti.</a> Nat Commun. 8, 15046 (2017).</li><li>Zheng, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prestin+is+the+motor+protein+of+cochlear+outer+hair+cells.">Prestin is the motor protein of cochlear outer hair cells.</a> Nature. 405 (6783), 149-155 (2000).</li><li>Ruel, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impairment+of+SLC17A8+encoding+vesicular+glutamate+transporter-3,+VGLUT3,+underlies+nonsyndromic+deafness+DFNA25+and+inner+hair+cell+dysfunction+in+null+mice.">Impairment of SLC17A8 encoding vesicular glutamate transporter-3, VGLUT3, underlies nonsyndromic deafness DFNA25 and inner hair cell dysfunction in null mice.</a> Am J Hum Genet. 83 (2), 278-292 (2008).</li><li>Seal, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensorineural+deafness+and+seizures+in+mice+lacking+vesicular+glutamate+transporter+3.">Sensorineural deafness and seizures in mice lacking vesicular glutamate transporter 3.</a> Neuron. 57 (2), 263-275 (2008).</li><li>Luo, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three+distinct+Atoh1+enhancers+cooperate+for+sound+receptor+hair+cell+development.">Three distinct Atoh1 enhancers cooperate for sound receptor hair cell development.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 119 (32), e2119850119 (2022).</li><li>Kalinec, G., Thein, P., Park, C., Kalinec, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HEI-OC1+cells+as+a+model+for+investigating+drug+cytotoxicity.">HEI-OC1 cells as a model for investigating drug cytotoxicity.</a> Hear Res. 335, 105-117 (2016).</li></ol>

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للكشف عنه.

بالمقارنة مع خط خلايا HEI-OC1 ، فإن الثقافات الأولية لخلايا الشعر تكرر بدقة أكبر الحالة الفسيولوجية للخلايا في الجسم الحي. لذلك ، يبدو أن طريقة الزراعة الأولية السمعية التي تم إنشاؤها عن طريق عزل الخلايا الحية عن أعضاء القوقعة وزراعتها على الفور هي أداة قيمة لإجراء أبحاث مكثفة حول الأنظمة ال...

تلعب خلايا شعيرات القوقعة أدوارا مهمة في اكتشاف الصوت ونقل الإشارات إلى العصب السمعي. خلايا الشعر هي خلايا ميكانيكية تعمل كمستقبلات حسية أولية وتحول الاهتزازات الصوتية إلى إشارات كهربائية في الفقاريات. تتكون الظهارة الحسية للأذن الداخلية للثدييات من صف واحد من خلايا الشعر الداخلية وثلاثة صفوف من خلايا الشعر الخارجية. في مناطق الغشاء الأساسية المختلفة ، تدرك خلايا الشعر الأصوات بترددات مختلفة (بين 20 و 2000 هرتز)1. وظيفة خلايا الشعر الخارجية هي عملية تضخيم ميكانيكية نشطة تساعد على ضبط الأذن الداخلية للثدييات ، مما يمنح حساسية عالية للصوت. خلايا الشعر الداخلية هي المسؤولة عن اكتشاف الأصوات. بعد إزالة الاستقطاب المتدرج ، تنتقل المعلومات الصوتية إلى الدماغ من خلال الألياف العصبية السمعية2.
قد يحدث فقدان السمع بسبب العيوب الوراثية أو الشيخوخة أو صدمة الضوضاء أو الاستخدام المفرط للأدوية السامة للأذن ، والتي تشكل مصدر قلق صحي كبير في جميع أنحاء العالم 3,4. ينتج فقدان السمع بشكل رئيسي عن تلف لا رجعة فيه لخلايا الشعر5. فيما يتعلق بفقدان السمع الناجم عن الضوضاء ، على الرغم من توصل الباحثين إلى توافق في الآراء حول العديد من تفاصيل مسبباته ، إلا أنه لا يوجد فهم شامل للعديد من الآليات الأساسية. خلايا الشعر الخارجية معرضة بشكل خاص للتعرض المفرط السمعي6. تشارك خلايا شعر القوقعة الحساسة ميكانيكيا في فقدان السمع المرتبط بالعمر. ومع ذلك ، فإن الآليات الجزيئية والخلوية الكامنة وراء تنكس خلايا الشعر لا تزال غير معروفة. تؤدي العديد من التغييرات في العمليات الجزيئية إلى شيخوخة خلايا الشعر ، والإجهاد التأكسدي ، واستجابة تلف الحمض النووي ، والالتهام الذاتي ، وعدم تنظيم التعبير عن الجينات المتعلقة بتخصص خلايا الشعرونسخها 7.
نظرا لأن الأذن الداخلية مغلفة بالعظم الصدغي ، في عمق أصعب عظام الجسم ، فلا يمكن الوصول إليها تجريبيا ، مما يشكل تحديا للتحقيقات في آليات إصلاح خلايا الشعر وتجديدها. ومن ثم ، أصبح إنشاء مزارع في المختبر للتحقيق في وظيفة خلايا الشعر طريقة مثالية للبحث في آليات التجديد والإصابة في الأذن الداخلية. تم وصف إجراءات تحضير مزارع النمط العضوي للقوقعة في الدراسات السابقة8،9،10. استخدم الباحثون في جميع أنحاء العالم تقنيات مختلفة لتشريح القوقعة الصناعية وإعداد السطح. على الرغم من التحديات المستمرة ، تم إنشاء العديد من أنظمة زراعة خلايا الشعر الأولية بنجاح في المختبر. تحتوي مزارع أعضاء القوقعة الصناعية على أنواع مختلفة من الخلايا، بما في ذلك خلايا الشعر، وخلايا ديتر، وخلايا هينسن، وخلايا الأعمدة، والألياف العصبية السمعية. إن الفهم المتعمق للتغيرات في خلايا الشعر على المستويين الخلوي والجزيئي بعد الإصابة سيمكن من تطوير أدوات بحث أكثر قوة. هدفت هذه الدراسة إلى توضيح خطوات عزل أعضاء القوقعة من الفئران الوليدية وفصل خلايا الشعر الوفيرة إنزيميا للدراسات في المختبر. تم تأكيد طبيعة الخلايا المستزرعة باستخدام تلطيخ المناعي.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>100 mm BioLite cell culture dish</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>130182</td>
			<td>using for culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm Nunc cell culture dish</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>150318</td>
			<td>using for culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well palate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>310109005</td>
			<td>using for culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#181;m cell strainers</td>
			<td>BD Company</td>
			<td>352350</td>
			<td>using for filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 Phalloidin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A12379</td>
			<td>immunofluorescent staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-rabbit IgG Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermo Fisher Scientifc</td>
			<td>A11008</td>
			<td>immunofluorescent staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>day 3-5 neonatal murine&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>provided by Xi&#39;an Jiaotong University</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle Medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11965092</td>
			<td>using for culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12483020</td>
			<td>using for culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Dumont</td>
			<td>5#</td>
			<td>using for dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica anatomy microscope</td>
			<td>Germany</td>
			<td>S9i</td>
			<td>using for dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>using for culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit plyclonal to Myosin VIIa</td>
			<td>Abcam company</td>
			<td>ab92996</td>
			<td>immunofluorescent staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissor</td>
			<td>Belevor</td>
			<td>10cm/04.0524.10</td>
			<td>using for dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma Aldrich&#160;</td>
			<td>9036-19-5</td>
			<td>immunofluorescent staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25200072</td>
			<td>using for culture</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and culture of primary cochlear hair cells from neonatal mice

خلايا شعر القوقعة هي المستقبلات الحسية للنظام السمعي. تقع هذه الخلايا في عضو كورتي ، العضو الحسي المسؤول عن السمع ، داخل المتاهة العظمية للأذن الداخلية. تتكون خلايا شعيرات القوقعة من نوعين متميزين تشريحيا ووظيفيا: خلايا الشعر الخارجية والداخلية. الأضرار التي لحقت أي منهما يؤدي إلى فقدان السمع. والجدير بالذكر أن خلايا الشعر الداخلية لا يمكن أن تتجدد ، والضرر الذي يلحق بها دائم. ومن ثم، فإن زراعة خلايا الشعر الأولية في المختبر أمر لا غنى عنه للتحقيق في الآثار الوقائية أو التجديدية لخلايا الشعر القوقعي. هدفت هذه الدراسة إلى اكتشاف طريقة لعزل وزراعة خلايا شعر الفأر. 
بعد الإزالة اليدوية للجدار الجانبي للقوقعة ، تم تشريح الظهارة السمعية بدقة من القوقعة تحت المجهر ، وتم تحضينها في خليط يتكون من 0.25٪ trypsin-EDTA لمدة 10 دقائق عند 37 درجة مئوية ، وتم تعليقها برفق في وسط الاستزراع باستخدام طرف ماصة 200 ميكرولتر. تم تمرير تعليق الخلية من خلال مرشح الخلية ، وتم طرد المرشح بالطرد المركزي ، وتم استزراع الخلايا في 24 لوحة بئر. تم تحديد خلايا الشعر بناء على قدرتها على التعبير عن مركب النقل الميكانيكي ، الميوسين-VIIa ، الذي يشارك في التوترات الحركية ، وعن طريق وضع العلامات الانتقائية على F-actin باستخدام phalloidin. وصلت الخلايا إلى التقاء >90٪ بعد 4 د في الثقافة. يمكن لهذه الطريقة أن تعزز فهمنا للخصائص البيولوجية لخلايا الشعر المستزرعة في المختبر وتوضح كفاءة مزارع خلايا الشعر القوقعة ، مما يضع أساسا منهجيا متينا لمزيد من البحث السمعي.

Cochlear hair cells play important roles in sound detection and signal transmission to the auditory nerve. Hair cells are mechanistic cells that function as primary sensory receptors and convert sound vibrations into electrical signals in vertebrates. The sensory epithelium of the mammalian inner ear comprises a single row of inner hair cells and three rows of outer hair cells. In different basic membrane areas, hair cells perceive sounds at different frequencies (between 20 and 2,000 Hz)1. The function of outer hair cells is an active mechanical amplification process that helps fine-tune the mammalian inner ear, conferring high sensitivity to sound. Inner hair cells are responsible for detecting sounds. After graded depolarization, acoustic information is transmitted to the brain through the auditory nerve fibers2.
Hearing loss may be caused by genetic defects, aging, noise trauma, or the excessive use of ototoxic drugs, which constitute a major health concern worldwide3,4. Hearing loss mainly results from irreversible damage to hair cells5. Regarding noise-induced hearing loss, although researchers have reached a consensus on several details of its etiology, a comprehensive understanding of the numerous underlying mechanisms is lacking. Outer hair cells are particularly vulnerable to acoustic overexposure6. Mechanosensitive cochlear hair cells are involved in age-related hearing loss; however, the molecular and cellular mechanisms underlying hair cell degeneration remain unknown. Several changes in the molecular processes lead to hair cell aging, oxidative stress, DNA damage response, autophagy, and dysregulation of the expression and transcription of genes related to hair cell specialization7.
As the inner ear is encased in the temporal bone, deep in the hardest bone of the body, it is experimentally inaccessible, posing a challenge to investigations into the mechanisms of hair cell repair and regeneration. Hence, establishing in vitro cultures for investigating the function of hair cells has become an ideal method for research on the regeneration and injury mechanisms of the inner ear. The procedures for preparing cochlear organotypic cultures have been described in earlier studies8,9,10. Investigators worldwide have employed various cochlear microdissection and surface preparation techniques. Despite the persistent challenges, various primary hair cell culture systems have been successfully established in vitro. Cochlear organ cultures contain various cell types, including hair cells, Deiters cells, Hensen&#39;s cells, pillar cells, and auditory nerve fibers. An in-depth understanding of the changes in hair cells at the cellular and molecular levels after injury will enable the development of more powerful research tools. This study aimed to demonstrate the steps for isolating cochlear organs from neonatal mice and enzymatically detaching the abundant hair cells for in vitro studies. The nature of the cultured cells was confirmed using immunofluorescence staining.

تسليط الضوء على المؤلف: التطورات في زراعة خلايا شعر الفأر للبحث السمعي 

عزل وزراعة خلايا شعر القوقعة الأولية من الفئران حديثي الولادة

The inner ear is encased in the temporal bone, deep in the hardest bone of the body, posing a challenging to investigations. The cultivation of primary hair cells is indispensable for investigating cochlear hair cells. This study aimed to discover a method for isolating and cultivating mouse hair cells.We demonstrate the steps for isolating cochlear organs from your natural mice and asymmetrically detaching the abundant hair cells for in-vitro studies. The nature of the cultured cells, was confirmed using immunofluorescence staining. There are three primary culture method established by isolating living cells from cochlear organs, and immediately coaching them, pair to be a valuable tool for extensive research, are all three system.This method can enhance our understanding of the biological characteristics of in-vivo cultured hair cells, and demonstrate the efficiency of cochlear hair cell cultures, establishing a solid methodological foundation for further auditory research.

باتباع هذا البروتوكول ، قمنا بزرع الخلايا المعزولة. اعتبرت بذور خلايا شعر القوقعة الأولية ناجحة إذا لم تطفو الخلايا في وسط الاستزراع وانتشرت في غضون 24 ساعة. حددنا عدد خلايا الشعر بعد التصاقها وانتشارها إلى مجاميع مسطحة في قاع الطبق. بعد 1 يوم ، تم التصاق خلايا الشعر الحية بإحكام في الجزء ال...

Watch this Scientific Journal Video about Advancements in Cultivating Mouse Hair Cells for Auditory Research at JoVE.com

نقدم هنا بروتوكولا مفصلا لعزل وزراعة خلايا شعيرات القوقعة الأولية من الفئران. في البداية ، تم تشريح عضو كورتي من قوقعة الفئران حديثي الولادة (الذين تتراوح أعمارهم بين 3-5 أيام) تحت المجهر. بعد ذلك ، تم هضم الخلايا إنزيميا في تعليق خلية واحدة وتحديدها باستخدام التألق المناعي بعد عدة أيام في الثقافة.

Cochlear hair cells are the sensory receptors of the auditory system. These cells are located in the organ of Corti, the sensory organ responsible for ...

الأذن الداخلية مغلفة بالعظم الصدغي ، في عمق أصعب عظم في الجسم ، مما يشكل تحديا للتحقيقات. لا غنى عن زراعة خلايا الشعر الأولية لدراسة خلايا شعيرات القوقعة. هدفت هذه الدراسة إلى اكتشاف طريقة لعزل وزراعة خلايا شعر الفأر.نوضح خطوات عزل أعضاء قوقعة الأذن عن الفئران الطبيعية وفصل خلايا الشعر الوفيرة بشكل غير متماثل للدراسات في المختبر. تم تأكيد طبيعة الخلايا المستزرعة باستخدام تلطيخ المناعي. هناك ثلاث طرق زراعة أساسية تم إنشاؤها عن طريق عزل الخلايا الحية عن أعضاء القوقعة ، وتدريبها على الفور ، لتكون أداة قيمة للبحث المكثف ، هي جميع الأنظمة الثلاثة.يمكن لهذه الطريقة أن تعزز فهمنا للخصائص البيولوجية لخلايا الشعر المستزرعة في الجسم الحي ، وتوضح كفاءة مزارع خلايا الشعر القوقعة ، مما يضع أساسا منهجيا متينا لمزيد من البحث السمعي.

isolation-culture-primary-cochlear-hair-cells-from-neonatal

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation and Culture of Primary Cochlear Hair Cells from Neonatal Mice

1.6K Views.  The Second Affiliated Hospital of Xi’an Jiaotong University. الأذن الداخلية مغلفة بالعظم الصدغي ، في عمق أصعب عظم في الجسم ، مما يشكل تحديا للتحقيقات. لا غنى عن زراعة خلايا الشعر الأولية لدراسة خلايا شعيرات القوقعة. هدفت هذه الدراسة إلى اكتشاف طريقة لعزل وزراعة خلايا شعر الفأر.نوضح خطوات عزل أعضاء قوقعة الأذن عن الفئران الطبيعية ...

Video: تسليط الضوء على المؤلف: التطورات في زراعة خلايا شعر الفأر للبحث السمعي 

Cochlear hair cells are the sensory receptors of the auditory system. These cells are located in the organ of Corti, the sensory organ responsible for hearing, within the osseous labyrinth of the inner ear. Cochlear hair cells consist of two anatomically and functionally distinct types: outer and inner hair cells. Damage to either of them results in hearing loss. Notably, as inner hair cells cannot regenerate, and damage to them is permanent. Hence, in vitro cultivation of primary hair cells is indispensable for investigating the protective or regenerative effects of cochlear hair cells. This study aimed to discover a method for isolating and cultivating mouse hair cells. 
After manual removal of the cochlear lateral wall, the auditory epithelium was meticulously dissected from the cochlear modiolus under a microscope, incubated in a mixture consisting of 0.25% trypsin-EDTA for 10 min at 37 &#176;C, and gently suspended in culture medium using a 200 &#181;L pipette tip. The cell suspension was passed through a cell filter, the filtrate was centrifuged, and cells were cultured in 24-well plates. Hair cells were identified based on their capacity to express a mechanotransduction complex, myosin-VIIa, which is involved in motor tensions, and via selective labeling of F-actin using phalloidin. Cells reached &gt;90% confluence after 4 d in culture. This method can enhance our understanding of the biological characteristics of in vitro cultured hair cells and demonstrate the efficiency of cochlear hair cell cultures, establishing a solid methodological foundation for further auditory research.

Herein, we present a detailed protocol for isolating and culturing primary cochlear hair cells from mice. Initially, the organ of Corti was dissected from neonatal (aged 3-5 days) murine cochleae under a microscope. Subsequently, cells were enzymatically digested into a single-cell suspension and identified using immunofluorescence after several days in culture.

Dissection and Removal of the Temporal Bone to Collect Auditory Epithelia from Newborn Mice

To begin, securely hold the head of the euthanized newborn mice in place. Using micro operating scissors, open the scalp along the sagittal suture. Then, separate and immobilize the scalp bilaterally with the fingers.Use scissors to sever the cranium and flip it forward to access the skull. Employ a small periosteal elevator to extract the brain and then use the tip of the scissors to gently scrape the brain, revealing the base of the skull. Now, examine the bilateral temporal bones at the skull's base.Employ scissors to incise the base of the skull along the midline. Then, scrape off the skin and eliminate any unnecessary bone. Preserve and transfer the temporal bones to 35-millimeter sterile Petri dishes filled with fresh HBSS.Next, use a pair of 5 number pointed forceps to eliminate the bola and surrounding tissue from the petrous portion of the temporal bone. Hold the forceps with one hand to stabilize the semi-circular part of the temporal bone. Use the other hand to insert the lower tip of the forceps into the round window niche, separating the lateral bone of the cochlea from the scale of vestibule.Carefully remove the petrous portion of the temporal bone without contacting the Organ of Corti epithelium. Then, meticulously detach and extract the bony labyrinth of the cochlea, starting from the basal to the apical end. Using 5 number pointed forceps, carefully micro isolate the sensory epithelium of the Organ of Corti from the modiolus.Next, employ micro-operating forceps to hold the spiral ligament, and gently separate it from the stria vascularis. Transfer the clean auditory epithelium, using a 200 microliter pipette, to a three millimeter sterile culture dish containing HBSS. Place the isolated auditory epithelium in a 100 millimeter sterile Petri dish filled with HBSS for the subsequent preparation steps.

تشريح وإزالة العظم الصدغي لجمع الظهارة السمعية من الفئران حديثي الولادة

Enzymatic Disaggregation of the Auditory Epithelium to Obtain Auditory Hair Cells

To begin, isolate the auditory epithelium from the temporal bone of newborn mice and transfer it to 10 milliliters of fresh DMEM containing 0.25%Trypsin, incubate the mixture at 37 degrees Celsius for 12 minutes. Using a 200 microliter pipette tip, gently separate the hair cells from the basal lamina and other cells using an operating microscope. Then add another 10 milliliters of culture medium to inhibit the disaggregation.Filter the suspended cells through a 70 micrometer filter. Collect the filtrate in a clean 50 milliliter tube and centrifuge it at 300G for five minutes. Using a 1000 microliter pipette tip, re suspend the hair cells in five milliliters of culture medium by gentle pipetting.Now place a cover slip at the bottom of a six well plate in advance. Count the cells and culture them at 10 to the sixth cells per milliliter density in the six well plate, grow the adherence cells in two milliliters of DMEM at 37 degrees Celsius and 5%carbon dioxide. After one day of culturing the hair cells adhered firmly to the bottom of the dish.By the third day, the number of cells had doubled.