Este trabalho foi apoiado pela National Natural Science Foundation of China (NFSC 82101224 à YG)

Todos os experimentos com animais foram aprovados (nº 2021-847) pelo Comitê de Uso e Cuidado de Animais da Universidade Xi'an Jiaotong.
1. Esterilização e preparo do material
<ol><li>Esterilizar as ferramentas de dissecção usando desinfecção a vapor de alta temperatura e alta pressão e secá-las em uma incubadora de 50 °C durante a noite.</li>
	<li>Preparar 100 mL do meio de cultura contendo 10% de soro fetal bovino (SFB) e 10 mg/mL de penicilina/estreptomicina (adicionar 10 mL de SFB e 10 μL de solução estoque de penicilina a 90 mL de meio de águia modificado (EMEM) de Dulbecco e armazenar a 4 °C.</li>
</ol>2. Dissecção e remoção do osso temporal para coleta de epitélios auditivos
<ol><li>Eutanásia de um total de 10 camundongos recém-nascidos (com idade entre P3 e P5) por decapitação em gelo. Use uma metodologia alternativa, eticamente aprovada, se necessário.</li>
	<li>Manter a cabeça posicionada, abrir o couro cabeludo ao longo da sutura sagital com tesoura microoperatória e separar e fixar o couro cabeludo bilateralmente com os dedos, como mostra a Figura 1A.</li>
	<li>Remova o cérebro usando um pequeno elevador periosteal e bissetriz o crânio basal. Corte o crânio com uma tesoura e vire para frente para abrir o crânio; Use a ponta da tesoura para raspar o cérebro e expor a base do crânio.</li>
	<li>Observar os ossos temporais bilaterais na base do crânio (Figura 1C). Use tesoura para cortar a base do crânio ao longo da linha média, raspar a pele e remover qualquer osso desnecessário (Figura 1D,D').</li>
	<li>Reter e transferir os ossos temporais para placas de Petri estéreis de 35 mm contendo solução salina balanceada de Hank fresca (HBSS) (Figura 1E).</li>
	<li>Utilizar duas pinças de pontas #5 para remover a bula e o tecido circundante da porção petrosa do osso temporal (Figura 1E). OBS: Nesta fase, o labirinto ósseo no osso temporal dos camundongos não estaria completamente calcificado e seria facilmente dissecado com pinças.</li>
	<li>Segure a pinça com uma mão para fixar a parte semicircular do osso temporal e enfie o pé inferior da pinça no nicho da janela redonda com a outra mão para separar o osso lateral da cóclea do vestíbulo da escala. Remover cuidadosamente a porção petrosa do osso temporal sem tocar o epitélio OC. Em seguida, separar e remover cuidadosamente o labirinto ósseo da cóclea da extremidade basal para a extremidade apical (Figura 1F).</li>
	<li>Microisolar cuidadosamente o órgão do epitélio sensorial de Corti do modíolo usando pinça de pontas #5 (Figura 1G).</li>
	<li>Segurar o ligamento espiral, separá-lo cuidadosamente da estria vascular com pinças microoperadoras e transferir o epitélio auditivo limpo para uma placa de cultura estéril de 3 mm contendo HBSS usando uma pipeta de 200 μL (Figura 1H).</li>
	<li>Coletar 20 espécimes de cada animal e transferi-los rapidamente para uma placa de Petri estéril de 100 mm contendo HBSS para a próxima etapa de preparação (Figura 1).</li>
</ol>3. Desagregado enzimático para obtenção de células ciliadas auditivas
<ol><li>Transferir o epitélio auditivo para 10 mL de DMEM fresco contendo tripsina a 0,25% e incubar a 37 °C por 12 min.</li>
	<li>Usando uma ponta de pipeta de 200 μL, separe suavemente as células ciliadas da lâmina basal e outras células sob um microscópio cirúrgico.</li>
	<li>Adicionar mais 10 mL de meio de cultura para inibir a desagregação.</li>
	<li>Filtrar as células em suspensão no meio de cultura através de um filtro de 70 μm, recolher o filtrado num tubo limpo de 50 ml e centrifugar a 300 × g durante 5 minutos.</li>
	<li>Ressuspender as células ciliadas em pelo menos 5 mL de meio de cultura, pipetando-as suavemente para cima e para baixo usando uma ponta de pipeta de 1.000 μL. Evite introduzir bolhas.</li>
	<li>Coloque uma tampa no fundo de uma placa de seis poços com antecedência. Contar as células e cultivá-las a uma densidade de 10a 6 células/mL em placas de seis poços.</li>
	<li>Cultivar as células aderentes em 2 mL de DMEM (contendo 10% de SFB, 100 unidades/mL de penicilina e 100 μg/mL de estreptomicina) a 37 °C e 5% de CO2. Mude o meio cultural todos os dias. OBS: Deve-se mencionar que a utilização deste protocolo não resulta na obtenção de células ciliadas puras. Com base neste método primário de cultura celular, recomendamos o uso de células d2 ou d3 para estudos posteriores, pois as células ciliadas podem constituir aproximadamente 70% das células em cultura e estar em bom estado.</li>
</ol>4. Coloração por imunofluorescência
<ol><li>Colher as células cultivadas de d1 a d6 (um poço por dia). Aspirar o meio de cultura e enxaguar as células 2x com solução salina tamponada com fosfato (PBS).</li>
	<li>Fixar as células com paraformaldeído a 4% por 15 min à temperatura ambiente (TR).</li>
	<li>Retire o fixador e enxágue as células por 3 x 3 min com PBS.</li>
	<li>Permeabilizar as células com PBS contendo Triton X-100 a 0,2% por 10 min no TR.</li>
	<li>Incubar as células permeabilizadas com uma solução de bloqueio composta por SFB a 10% em PBS por 20 min no TR.</li>
	<li>Manchar as células com anticorpo monoclonal antimiosina (diluído a 1:200 em PBS) a 4 °C durante a noite.</li>
	<li>Lavar as células 3x com PBS estéril e incubá-las com anticorpo secundário (Alexa Fluor 594 cabra anti-coelho MYO7A, diluído 1:500 em PBS) e faloidina marcada com fluoresceína (Alexa Fluor 488, para identificar a estrutura celular) por 2 h no RT.</li>
	<li>Enxaguar as células 3x com PBS para remover os anticorpos secundários.</li>
	<li>Adicione 1-2 gotas de meio de montagem com DAPI nas lâminas, monte as lamínulas e coloque-as sob um microscópio confocal de varredura a laser para capturar fotos das células.</li>
</ol>5. Análise estatística
<ol><li>Realizar análise de variância (ANOVA) two-way seguida de testes post hoc de Tukey para analisar as mudanças nos valores de cinza de miosina-VIIa e faloidina ao longo do tempo. Use o método de marcação de letras para marcar diferenças estatísticas.</li>
	<li>Realizar ANOVAs unidirecionais adicionais seguidas de testes post-hoc de Tukey para comparar a razão de células positivas para faloidina entre amostras de células do dia 1 ao dia 6 e a razão de células positivas para miosina VII nos mesmos dias.</li>
</ol>

Cultivo in vitro eficiente de células ciliadas cocleares de camundongos

<ol>
	<li>Tani, T., Koike-Tani, M., Tran, M. T., Shribak, M., Levic, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postnatal+structural+development+of+mammalian+Basilar+Membrane+provides+anatomical+basis+for+the+maturation+of+tonotopic+maps+and+frequency+tuning.">Postnatal structural development of mammalian Basilar Membrane provides anatomical basis for the maturation of tonotopic maps and frequency tuning.</a> Sci Rep. 11 (1), 7581 (2021).</li><li>Goutman, J. D., Elgoyhen, A. B., Gomez-Casati, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cochlear+hair+cells:+The+sound-sensing+machines.">Cochlear hair cells: The sound-sensing machines.</a> FEBS Lett. 589 (22), 3354-3361 (2015).</li><li>Joo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Contribution+of+Ototoxic+Medications+to+Hearing+Loss+Among+Older+Adults.">The Contribution of Ototoxic Medications to Hearing Loss Among Older Adults.</a> J Gerontol A Biol Sci Med Sci. 75 (3), 561-566 (2020).</li><li>Nieman, C. L., Oh, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hearing+Loss.">Hearing Loss.</a> Ann Intern Med. 173 (11), ITC81-ITC96 (2020).</li><li>Mao, H., Chen, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noise-Induced+Hearing+Loss:+Updates+on+Molecular+Targets+and+Potential+Interventions.">Noise-Induced Hearing Loss: Updates on Molecular Targets and Potential Interventions.</a> Neural Plast. 2021, 4784385 (2021).</li><li>Morioka, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hearing+vulnerability+after+noise+exposure+in+a+mouse+model+of+reactive+oxygen+species+overproduction.">Hearing vulnerability after noise exposure in a mouse model of reactive oxygen species overproduction.</a> J Neurochem. 146 (4), 459-473 (2018).</li><li>Liu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+and+cytological+profiling+of+biological+aging+of+mouse+cochlear+inner+and+outer+hair+cells.">Molecular and cytological profiling of biological aging of mouse cochlear inner and outer hair cells.</a> Cell Rep. 39 (2), 110665 (2022).</li><li>Ogier, J. M., Burt, R. A., Drury, H. R., Lim, R., Nayagam, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+Culture+of+Neonatal+Murine+Inner+Ear+Explants.">Organotypic Culture of Neonatal Murine Inner Ear Explants.</a> Front Cell Neurosci. 13, 170 (2019).</li><li>Ding, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cisplatin+ototoxicity+in+rat+cochlear+organotypic+cultures.">Cisplatin ototoxicity in rat cochlear organotypic cultures.</a> Hear Res. 282 (1-2), 196-203 (2011).</li><li>Abitbol, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cisplatin-induced+ototoxicity+in+organotypic+cochlear+cultures+occurs+independent+of+gap+junctional+intercellular+communication.">Cisplatin-induced ototoxicity in organotypic cochlear cultures occurs independent of gap junctional intercellular communication.</a> Cell Death Dis. 11 (5), 342 (2020).</li><li>Li, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myosin-VIIa+is+expressed+in+multiple+isoforms+and+essential+for+tensioning+the+hair+cell+mechanotransduction+complex.">Myosin-VIIa is expressed in multiple isoforms and essential for tensioning the hair cell mechanotransduction complex.</a> Nat Commun. 11 (1), 2066 (2020).</li><li>Kalinec, G. M., Park, C., Thein, P., Kalinec, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Working+with+auditory+HEI-OC1+cells.">Working with auditory HEI-OC1 cells.</a> J Vis Exp. (115), (2016).</li><li>Montgomery, S. C., Cox, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+mount+dissection+and+immunofluorescence+of+the+adult+mouse+cochlea.">Whole mount dissection and immunofluorescence of the adult mouse cochlea.</a> J Vis Exp. (107), (2016).</li><li>Xu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+mouse+cochlear+progenitors+that+develop+hair+and+supporting+cells+in+the+organ+of+Corti.">Identification of mouse cochlear progenitors that develop hair and supporting cells in the organ of Corti.</a> Nat Commun. 8, 15046 (2017).</li><li>Zheng, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prestin+is+the+motor+protein+of+cochlear+outer+hair+cells.">Prestin is the motor protein of cochlear outer hair cells.</a> Nature. 405 (6783), 149-155 (2000).</li><li>Ruel, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impairment+of+SLC17A8+encoding+vesicular+glutamate+transporter-3,+VGLUT3,+underlies+nonsyndromic+deafness+DFNA25+and+inner+hair+cell+dysfunction+in+null+mice.">Impairment of SLC17A8 encoding vesicular glutamate transporter-3, VGLUT3, underlies nonsyndromic deafness DFNA25 and inner hair cell dysfunction in null mice.</a> Am J Hum Genet. 83 (2), 278-292 (2008).</li><li>Seal, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensorineural+deafness+and+seizures+in+mice+lacking+vesicular+glutamate+transporter+3.">Sensorineural deafness and seizures in mice lacking vesicular glutamate transporter 3.</a> Neuron. 57 (2), 263-275 (2008).</li><li>Luo, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three+distinct+Atoh1+enhancers+cooperate+for+sound+receptor+hair+cell+development.">Three distinct Atoh1 enhancers cooperate for sound receptor hair cell development.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 119 (32), e2119850119 (2022).</li><li>Kalinec, G., Thein, P., Park, C., Kalinec, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HEI-OC1+cells+as+a+model+for+investigating+drug+cytotoxicity.">HEI-OC1 cells as a model for investigating drug cytotoxicity.</a> Hear Res. 335, 105-117 (2016).</li></ol>

Os autores não têm conflitos de interesse a declarar.

Em comparação com a linhagem celular HEI-OC1, culturas primárias de células ciliadas replicaram com mais precisão o estado fisiológico das células in vivo. Portanto, o método de cultura primária auditiva estabelecido pelo isolamento de células vivas dos órgãos cocleares e sua cultura imediata parece ser uma ferramenta valiosa para uma extensa pesquisa sobre sistemas auditivos. Certas técnicas são cruciais para uma cultura de sucesso. Primeiro, minimizar a duração da separação do órgão de Corti do osso...

As células ciliadas da cóclea desempenham papéis importantes na detecção do som e na transmissão do sinal para o nervo auditivo. As células ciliadas são células mecanicistas que funcionam como receptores sensoriais primários e convertem vibrações sonoras em sinais elétricos em vertebrados. O epitélio sensorial da orelha interna de mamíferos é composto por uma única fileira de células ciliadas internas e três fileiras de células ciliadas externas. Em diferentes áreas da membrana básica, as células ciliadas percebem sons em diferentes frequências (entre 20 e 2.000 Hz)1. A função das células ciliadas externas é um processo de amplificação mecânica ativa que ajuda a ajustar o ouvido interno dos mamíferos, conferindo alta sensibilidade ao som. As células ciliadas internas são responsáveis pela detecção de sons. Após a despolarização gradual, a informação acústica é transmitida ao cérebro através das fibras do nervoauditivo2.
A perda auditiva pode ser causada por defeitos genéticos, envelhecimento, trauma sonoro ou uso excessivo de drogas ototóxicas, que constituem um grande problema de saúde em todo omundo3,4. A perda auditiva resulta, principalmente, de danos irreversíveis às células ciliadas5. Em relação à perda auditiva induzida por ruído, embora os pesquisadores tenham chegado a um consenso sobre vários detalhes de sua etiologia, falta uma compreensão abrangente dos inúmeros mecanismos subjacentes. As células ciliadas externas são particularmente vulneráveis à superexposição acústica6. As células ciliadas mecanossensíveis da cóclea estão envolvidas na perda auditiva relacionada à idade; no entanto, os mecanismos moleculares e celulares subjacentes à degeneração das células ciliadas permanecem desconhecidos. Diversas alterações nos processos moleculares levam ao envelhecimento das células ciliadas, estresse oxidativo, resposta a danos ao DNA, autofagia e desregulação da expressão e transcrição de genes relacionados à especialização das células ciliadas7.
Como a orelha interna está envolta no osso temporal, profundamente no osso mais duro do corpo, ela é experimentalmente inacessível, representando um desafio para as investigações sobre os mecanismos de reparação e regeneração das células ciliadas. Assim, o estabelecimento de culturas in vitro para investigação da função das células ciliadas tornou-se um método ideal para pesquisas sobre os mecanismos de regeneração e lesão da orelha interna. Os procedimentos de preparo das culturas organotípicas da cóclea foram descritos em estudos anteriores 8,9,10. Pesquisadores em todo o mundo têm empregado várias técnicas de microdissecção coclear e preparação de superfície. Apesar dos desafios persistentes, vários sistemas primários de cultura de células ciliadas foram estabelecidos com sucesso in vitro. As culturas de órgãos cocleares contêm vários tipos de células, incluindo células ciliadas, células de Deiters, células de Hensen, células pilares e fibras do nervo auditivo. Uma compreensão profunda das mudanças nas células ciliadas em nível celular e molecular após a lesão permitirá o desenvolvimento de ferramentas de pesquisa mais poderosas. Este estudo teve como objetivo demonstrar os passos para isolar órgãos cocleares de camundongos neonatais e desprender enzimaticamente as células ciliadas abundantes para estudos in vitro. A natureza das células cultivadas foi confirmada pela coloração de imunofluorescência.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>100 mm BioLite cell culture dish</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>130182</td>
			<td>using for culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm Nunc cell culture dish</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>150318</td>
			<td>using for culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well palate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>310109005</td>
			<td>using for culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#181;m cell strainers</td>
			<td>BD Company</td>
			<td>352350</td>
			<td>using for filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 Phalloidin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A12379</td>
			<td>immunofluorescent staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-rabbit IgG Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermo Fisher Scientifc</td>
			<td>A11008</td>
			<td>immunofluorescent staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>day 3-5 neonatal murine&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>provided by Xi&#39;an Jiaotong University</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle Medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11965092</td>
			<td>using for culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12483020</td>
			<td>using for culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Dumont</td>
			<td>5#</td>
			<td>using for dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica anatomy microscope</td>
			<td>Germany</td>
			<td>S9i</td>
			<td>using for dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>using for culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit plyclonal to Myosin VIIa</td>
			<td>Abcam company</td>
			<td>ab92996</td>
			<td>immunofluorescent staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissor</td>
			<td>Belevor</td>
			<td>10cm/04.0524.10</td>
			<td>using for dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma Aldrich&#160;</td>
			<td>9036-19-5</td>
			<td>immunofluorescent staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25200072</td>
			<td>using for culture</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and culture of primary cochlear hair cells from neonatal mice

As células ciliadas da cóclea são os receptores sensoriais do sistema auditivo. Essas células estão localizadas no órgão de Corti, órgão sensorial responsável pela audição, dentro do labirinto ósseo da orelha interna. As células ciliadas da cóclea consistem em dois tipos anatomicamente e funcionalmente distintos: células ciliadas externas e internas. Danos a qualquer um deles resultam em perda auditiva. Notavelmente, como as células ciliadas internas não podem se regenerar, e os danos a elas são permanentes. Assim, o cultivo in vitro de células ciliadas primárias é indispensável para investigar os efeitos protetores ou regenerativos das células ciliadas da cóclea. Este estudo teve como objetivo descobrir um método para isolar e cultivar células ciliadas de camundongos. 
Após a remoção manual da parede lateral da cóclea, o epitélio auditivo foi meticulosamente dissecado do modíolo coclear ao microscópio, incubado em uma mistura composta de tripsina-EDTA a 0,25% por 10 min a 37 °C e suavemente suspenso em meio de cultura com ponta de pipeta de 200 μL. A suspensão celular foi passada através de um filtro de células, o filtrado foi centrifugado e as células foram cultivadas em placas de 24 poços. As células ciliadas foram identificadas com base em sua capacidade de expressar um complexo mecanotransdutor, a miosina-VIIa, que está envolvido em tensões motoras, e via marcação seletiva de F-actina usando faloidina. As células atingiram >90% de confluência após 4 dias em cultura. Este método pode melhorar nossa compreensão das características biológicas de células ciliadas cultivadas in vitro e demonstrar a eficiência das culturas de células ciliadas cocleares, estabelecendo uma base metodológica sólida para futuras pesquisas auditivas.

Cochlear hair cells play important roles in sound detection and signal transmission to the auditory nerve. Hair cells are mechanistic cells that function as primary sensory receptors and convert sound vibrations into electrical signals in vertebrates. The sensory epithelium of the mammalian inner ear comprises a single row of inner hair cells and three rows of outer hair cells. In different basic membrane areas, hair cells perceive sounds at different frequencies (between 20 and 2,000 Hz)1. The function of outer hair cells is an active mechanical amplification process that helps fine-tune the mammalian inner ear, conferring high sensitivity to sound. Inner hair cells are responsible for detecting sounds. After graded depolarization, acoustic information is transmitted to the brain through the auditory nerve fibers2.
Hearing loss may be caused by genetic defects, aging, noise trauma, or the excessive use of ototoxic drugs, which constitute a major health concern worldwide3,4. Hearing loss mainly results from irreversible damage to hair cells5. Regarding noise-induced hearing loss, although researchers have reached a consensus on several details of its etiology, a comprehensive understanding of the numerous underlying mechanisms is lacking. Outer hair cells are particularly vulnerable to acoustic overexposure6. Mechanosensitive cochlear hair cells are involved in age-related hearing loss; however, the molecular and cellular mechanisms underlying hair cell degeneration remain unknown. Several changes in the molecular processes lead to hair cell aging, oxidative stress, DNA damage response, autophagy, and dysregulation of the expression and transcription of genes related to hair cell specialization7.
As the inner ear is encased in the temporal bone, deep in the hardest bone of the body, it is experimentally inaccessible, posing a challenge to investigations into the mechanisms of hair cell repair and regeneration. Hence, establishing in vitro cultures for investigating the function of hair cells has become an ideal method for research on the regeneration and injury mechanisms of the inner ear. The procedures for preparing cochlear organotypic cultures have been described in earlier studies8,9,10. Investigators worldwide have employed various cochlear microdissection and surface preparation techniques. Despite the persistent challenges, various primary hair cell culture systems have been successfully established in vitro. Cochlear organ cultures contain various cell types, including hair cells, Deiters cells, Hensen&#39;s cells, pillar cells, and auditory nerve fibers. An in-depth understanding of the changes in hair cells at the cellular and molecular levels after injury will enable the development of more powerful research tools. This study aimed to demonstrate the steps for isolating cochlear organs from neonatal mice and enzymatically detaching the abundant hair cells for in vitro studies. The nature of the cultured cells was confirmed using immunofluorescence staining.

Autor em destaque: Avanços no cultivo de células ciliadas de camundongos para pesquisa auditiva 

Isolamento e Cultura de Células Ciliadas Cocleares Primárias de Camundongos Neonatais

The inner ear is encased in the temporal bone, deep in the hardest bone of the body, posing a challenging to investigations. The cultivation of primary hair cells is indispensable for investigating cochlear hair cells. This study aimed to discover a method for isolating and cultivating mouse hair cells.We demonstrate the steps for isolating cochlear organs from your natural mice and asymmetrically detaching the abundant hair cells for in-vitro studies. The nature of the cultured cells, was confirmed using immunofluorescence staining. There are three primary culture method established by isolating living cells from cochlear organs, and immediately coaching them, pair to be a valuable tool for extensive research, are all three system.This method can enhance our understanding of the biological characteristics of in-vivo cultured hair cells, and demonstrate the efficiency of cochlear hair cell cultures, establishing a solid methodological foundation for further auditory research.

Seguindo este protocolo, as células isoladas foram semeadas. Sementes de células ciliadas primárias da cóclea foram consideradas bem-sucedidas se as células não flutuassem no meio de cultura e se espalhassem em 24 h. Determinamos o número de células ciliadas após aderirem e se espalharem em agregados planos no fundo da placa. Após 1 dia, as células ciliadas vivas foram firmemente aderidas ao fundo da placa de cultura e as células não aderentes foram removidas por enxágüe com PBS. Tipicamente, o número de ...

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Neste trabalho, apresentamos um protocolo detalhado para isolamento e cultivo de células ciliadas primárias da cóclea de camundongos. Inicialmente, o órgão de Corti foi dissecado de cócleas murinas neonatais (idade 3-5 dias) sob um microscópio. Posteriormente, as células foram digeridas enzimaticamente em uma suspensão unicelular e identificadas por imunofluorescência após vários dias em cultura.

Cochlear hair cells are the sensory receptors of the auditory system. These cells are located in the organ of Corti, the sensory organ responsible for ...

A orelha interna está envolta no osso temporal, profundamente no osso mais duro do corpo, representando um desafio para as investigações. O cultivo de células ciliadas primárias é indispensável para a investigação das células ciliadas da cóclea. Este estudo teve como objetivo descobrir um método para isolar e cultivar células ciliadas de camundongos.Demonstramos os passos para isolar os órgãos cocleares de seus camundongos naturais e destacar assimetricamente as células ciliadas abundantes para estudos in vitro. A natureza das células cultivadas foi confirmada pela coloração de imunofluorescência. Existem três métodos primários de cultura estabelecidos pelo isolamento de células vivas dos órgãos cocleares, e imediatamente treiná-los, par para ser uma ferramenta valiosa para a pesquisa extensiva, são todos os três sistemas.Este método pode melhorar nossa compreensão das características biológicas de células ciliadas cultivadas in vivo e demonstrar a eficiência das culturas de células ciliadas cocleares, estabelecendo uma base metodológica sólida para futuras pesquisas auditivas.

isolation-culture-primary-cochlear-hair-cells-from-neonatal

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation and Culture of Primary Cochlear Hair Cells from Neonatal Mice

1.6K visualizações.  The Second Affiliated Hospital of Xi’an Jiaotong University. A orelha interna está envolta no osso temporal, profundamente no osso mais duro do corpo, representando um desafio para as investigações. O cultivo de células ciliadas primárias é indispensável para a investigação das células ciliadas da cóclea. Este estudo teve como objetivo descobrir um método para isolar e cultivar células ciliadas de camundongos.Demonstramos os passos para isolar os órgãos cocleares de seus camundongos naturais e destacar assimetricamente as células...

Vídeo: Autor em destaque: Avanços no cultivo de células ciliadas de camundongos para pesquisa auditiva 

Cochlear hair cells are the sensory receptors of the auditory system. These cells are located in the organ of Corti, the sensory organ responsible for hearing, within the osseous labyrinth of the inner ear. Cochlear hair cells consist of two anatomically and functionally distinct types: outer and inner hair cells. Damage to either of them results in hearing loss. Notably, as inner hair cells cannot regenerate, and damage to them is permanent. Hence, in vitro cultivation of primary hair cells is indispensable for investigating the protective or regenerative effects of cochlear hair cells. This study aimed to discover a method for isolating and cultivating mouse hair cells. 
After manual removal of the cochlear lateral wall, the auditory epithelium was meticulously dissected from the cochlear modiolus under a microscope, incubated in a mixture consisting of 0.25% trypsin-EDTA for 10 min at 37 &#176;C, and gently suspended in culture medium using a 200 &#181;L pipette tip. The cell suspension was passed through a cell filter, the filtrate was centrifuged, and cells were cultured in 24-well plates. Hair cells were identified based on their capacity to express a mechanotransduction complex, myosin-VIIa, which is involved in motor tensions, and via selective labeling of F-actin using phalloidin. Cells reached &gt;90% confluence after 4 d in culture. This method can enhance our understanding of the biological characteristics of in vitro cultured hair cells and demonstrate the efficiency of cochlear hair cell cultures, establishing a solid methodological foundation for further auditory research.

Herein, we present a detailed protocol for isolating and culturing primary cochlear hair cells from mice. Initially, the organ of Corti was dissected from neonatal (aged 3-5 days) murine cochleae under a microscope. Subsequently, cells were enzymatically digested into a single-cell suspension and identified using immunofluorescence after several days in culture.

Biologia

Dissection and Removal of the Temporal Bone to Collect Auditory Epithelia from Newborn Mice

To begin, securely hold the head of the euthanized newborn mice in place. Using micro operating scissors, open the scalp along the sagittal suture. Then, separate and immobilize the scalp bilaterally with the fingers.Use scissors to sever the cranium and flip it forward to access the skull. Employ a small periosteal elevator to extract the brain and then use the tip of the scissors to gently scrape the brain, revealing the base of the skull. Now, examine the bilateral temporal bones at the skull's base.Employ scissors to incise the base of the skull along the midline. Then, scrape off the skin and eliminate any unnecessary bone. Preserve and transfer the temporal bones to 35-millimeter sterile Petri dishes filled with fresh HBSS.Next, use a pair of 5 number pointed forceps to eliminate the bola and surrounding tissue from the petrous portion of the temporal bone. Hold the forceps with one hand to stabilize the semi-circular part of the temporal bone. Use the other hand to insert the lower tip of the forceps into the round window niche, separating the lateral bone of the cochlea from the scale of vestibule.Carefully remove the petrous portion of the temporal bone without contacting the Organ of Corti epithelium. Then, meticulously detach and extract the bony labyrinth of the cochlea, starting from the basal to the apical end. Using 5 number pointed forceps, carefully micro isolate the sensory epithelium of the Organ of Corti from the modiolus.Next, employ micro-operating forceps to hold the spiral ligament, and gently separate it from the stria vascularis. Transfer the clean auditory epithelium, using a 200 microliter pipette, to a three millimeter sterile culture dish containing HBSS. Place the isolated auditory epithelium in a 100 millimeter sterile Petri dish filled with HBSS for the subsequent preparation steps.

Dissecção e Remoção do Osso Temporal para Coleta de Epitélios Auditivos de Camundongos Recém-Nascidos

Enzymatic Disaggregation of the Auditory Epithelium to Obtain Auditory Hair Cells

To begin, isolate the auditory epithelium from the temporal bone of newborn mice and transfer it to 10 milliliters of fresh DMEM containing 0.25%Trypsin, incubate the mixture at 37 degrees Celsius for 12 minutes. Using a 200 microliter pipette tip, gently separate the hair cells from the basal lamina and other cells using an operating microscope. Then add another 10 milliliters of culture medium to inhibit the disaggregation.Filter the suspended cells through a 70 micrometer filter. Collect the filtrate in a clean 50 milliliter tube and centrifuge it at 300G for five minutes. Using a 1000 microliter pipette tip, re suspend the hair cells in five milliliters of culture medium by gentle pipetting.Now place a cover slip at the bottom of a six well plate in advance. Count the cells and culture them at 10 to the sixth cells per milliliter density in the six well plate, grow the adherence cells in two milliliters of DMEM at 37 degrees Celsius and 5%carbon dioxide. After one day of culturing the hair cells adhered firmly to the bottom of the dish.By the third day, the number of cells had doubled.