この研究は、中国国家自然科学基金会(NFSC 82101224 to YG)の支援を受けました

すべての動物実験は、西安交通大学動物の使用と管理に関する委員会によって承認されました(No.2021-847)。
1.滅菌と材料の準備
<ol><li>解剖器具を高温高圧蒸気消毒で滅菌し、50°Cのインキュベーターで一晩乾燥させます。</li>
	<li>10%ウシ胎児血清(FBS)とペニシリン/ストレプトマイシン10 mg/mLを含む培地100 mLを事前に調製し(10 mLのFBSと10 μLのペニシリン原液をダルベッコ修正イーグル培地(EMEM)90 mLに加える)し、4°Cで保存します。</li>
</ol>2.聴覚上皮採取のための側頭骨の解剖と除去
<ol><li>合計10匹の新生児マウス(P3からP5)を氷上で首を切って安楽死させる。必要に応じて、倫理的に承認された別の方法論を使用します。</li>
	<li>図1Aに示すように、頭を所定の位置に保持し、マイクロ操作ハサミを使用して矢状縫合糸に沿って頭皮を開き、指で頭皮を両側に分離して固定します。</li>
	<li>小さな骨膜エレベーターを使用して脳を取り除き、基底頭蓋骨を二等分します。はさみで頭蓋骨を切り、前方にひっくり返して頭蓋骨を開きます。ハサミの先で脳を削り、頭蓋骨の付け根を露出させます。</li>
	<li>頭蓋骨の基部にある両側側頭骨を観察します(図1C)。ハサミを使用して頭蓋骨の基部を正中線に沿って切り、皮膚をこすり落とし、不要な骨を取り除きます(図1D、D')。</li>
	<li>側頭骨を保持し、新鮮なハンク平衡塩溶液(HBSS)を含む35mmの滅菌ペトリ皿に移します(図1E)。</li>
	<li>2つの#5尖った鉗子を使用して、側頭骨の錐体部分から水疱と周囲の組織を取り除きます(図1E)。 注:この段階では、マウスの側頭骨の骨迷路は完全に石灰化しておらず、鉗子を使用して簡単に解剖できます。</li>
	<li>片手で鉗子を持って側頭骨の半円形部分を固定し、もう一方の手で鉗子の下部を丸い窓のニッチに突き刺して、蝸牛の外側骨をスカラ前庭から分離します。OC上皮に触れずに側頭骨の錐体部分を慎重に取り除きます。続いて、蝸牛の骨迷路を基底端から頂端まで慎重に分離して除去します(図1F)。</li>
	<li>#5尖った鉗子を使用して、コルチ感覚上皮の器官をモディオルスから慎重にマイクロ分離します(図1G)。</li>
	<li>らせん靭帯を保持し、微小手術鉗子で脈理血管から慎重に分離し、200 μLのピペットを使用して、清潔な聴覚上皮をHBSSを含む3 mmの滅菌培養皿に移します(図1H)。</li>
	<li>各動物から20個の検体を採取し、次の調製ステップのためにHBSSを含む100 mm滅菌シャーレにすばやく移します(図1)。</li>
</ol>3. 聴覚有毛細胞を得るための酵素解離
<ol><li>0.25%トリプシンを含む10 mLの新鮮DMEMに聴覚上皮を移し、37°Cで12分間インキュベートします。</li>
	<li>200 μLのピペットチップを使用して、手術顕微鏡下で有毛細胞を基底層および他の細胞から静かに分離します。</li>
	<li>さらに10 mLの培地を加えて、凝集を阻害します。</li>
	<li>培地中の懸濁細胞を70μmフィルターでろ過し、濾液を清潔な50mLチューブに回収し、300× g で5分間遠心分離します。</li>
	<li>有毛細胞を少なくとも5 mLの培養培地に再懸濁し、1,000 μLのピペットチップを使用してゆっくりと上下にピペッティングします。気泡の発生は避けてください。</li>
	<li>あらかじめ6ウェルプレートの底にカバーガラスを置きます。細胞をカウントし、6ウェルプレートで106 細胞/mLの密度で培養します。</li>
	<li>接着細胞を2 mLのDMEM(FBS10%、ペニシリン100ユニット/mL、ストレプトマイシン100 μg/mLを含む)で37°Cおよび5%CO2で増殖させます。培地は毎日交換してください。 注:このプロトコルを使用しても、純粋な有毛細胞は得られないことに注意してください。この初代細胞培養法に基づくと、有毛細胞が培養細胞の約70%を占め、良好な状態にある可能性があるため、さらなる研究にはd2またはd3細胞を使用することをお勧めします。</li>
</ol>4. 免疫蛍光染色
<ol><li>培養細胞をd1からd6まで(1日1ウェル)収穫します。培地を吸引し、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で細胞を2回すすぎます。</li>
	<li>細胞を4%パラホルムアルデヒドで室温(RT)で15分間固定します。</li>
	<li>固定液を取り除き、PBSで3 x 3分間細胞をすすぎます。</li>
	<li>0.2% Triton X-100 を含む PBS で細胞を室温で 10 分間透過処理します。</li>
	<li>透過処理した細胞を、PBS中の10%FBSからなるブロッキング溶液と室温で20分間インキュベートします。</li>
	<li>抗ミオシンモノクローナル抗体(PBSで1:200に希釈)で4°Cで一晩細胞を染色します。</li>
	<li>細胞を滅菌PBSで3回洗浄し、二次抗体(Alexa Fluor 594ヤギ抗ウサギMYO7A、PBSで1:500希釈)およびフルオレセイン標識ファロイジン(Alexa Fluor 488、細胞構造を同定)とともに室温で2時間インキュベートします。</li>
	<li>細胞をPBSで3回すすぎ、二次抗体を除去します。</li>
	<li>DAPIを含む封入剤を1〜2滴スライドに加え、カバーガラスをマウントし、レーザー走査型共焦点顕微鏡の下に置いて細胞の写真を撮ります。</li>
</ol>5. 統計解析
<ol><li>二元配置分散分析(ANOVA)とそれに続くテューキーの事後検定を実行して、ミオシン-VIIaとファロイジンの灰色値の経時的な変化を分析します。文字マーキング方法を使用して、統計的な差異をマークします。</li>
	<li>追加の一元配置分散分析を実行し、続いてテューキーの事後検定を実行して、1日目から6日目までの細胞サンプル間のファロイジン陽性細胞比と、同じ日のミオシン-VII陽性細胞比を比較します。</li>
</ol>

マウス蝸牛有毛細胞の効率的なIn vitro培養

<ol>
	<li>Tani, T., Koike-Tani, M., Tran, M. T., Shribak, M., Levic, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postnatal+structural+development+of+mammalian+Basilar+Membrane+provides+anatomical+basis+for+the+maturation+of+tonotopic+maps+and+frequency+tuning.">Postnatal structural development of mammalian Basilar Membrane provides anatomical basis for the maturation of tonotopic maps and frequency tuning.</a> Sci Rep. 11 (1), 7581 (2021).</li><li>Goutman, J. D., Elgoyhen, A. B., Gomez-Casati, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cochlear+hair+cells:+The+sound-sensing+machines.">Cochlear hair cells: The sound-sensing machines.</a> FEBS Lett. 589 (22), 3354-3361 (2015).</li><li>Joo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Contribution+of+Ototoxic+Medications+to+Hearing+Loss+Among+Older+Adults.">The Contribution of Ototoxic Medications to Hearing Loss Among Older Adults.</a> J Gerontol A Biol Sci Med Sci. 75 (3), 561-566 (2020).</li><li>Nieman, C. L., Oh, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hearing+Loss.">Hearing Loss.</a> Ann Intern Med. 173 (11), ITC81-ITC96 (2020).</li><li>Mao, H., Chen, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noise-Induced+Hearing+Loss:+Updates+on+Molecular+Targets+and+Potential+Interventions.">Noise-Induced Hearing Loss: Updates on Molecular Targets and Potential Interventions.</a> Neural Plast. 2021, 4784385 (2021).</li><li>Morioka, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hearing+vulnerability+after+noise+exposure+in+a+mouse+model+of+reactive+oxygen+species+overproduction.">Hearing vulnerability after noise exposure in a mouse model of reactive oxygen species overproduction.</a> J Neurochem. 146 (4), 459-473 (2018).</li><li>Liu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+and+cytological+profiling+of+biological+aging+of+mouse+cochlear+inner+and+outer+hair+cells.">Molecular and cytological profiling of biological aging of mouse cochlear inner and outer hair cells.</a> Cell Rep. 39 (2), 110665 (2022).</li><li>Ogier, J. M., Burt, R. A., Drury, H. R., Lim, R., Nayagam, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+Culture+of+Neonatal+Murine+Inner+Ear+Explants.">Organotypic Culture of Neonatal Murine Inner Ear Explants.</a> Front Cell Neurosci. 13, 170 (2019).</li><li>Ding, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cisplatin+ototoxicity+in+rat+cochlear+organotypic+cultures.">Cisplatin ototoxicity in rat cochlear organotypic cultures.</a> Hear Res. 282 (1-2), 196-203 (2011).</li><li>Abitbol, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cisplatin-induced+ototoxicity+in+organotypic+cochlear+cultures+occurs+independent+of+gap+junctional+intercellular+communication.">Cisplatin-induced ototoxicity in organotypic cochlear cultures occurs independent of gap junctional intercellular communication.</a> Cell Death Dis. 11 (5), 342 (2020).</li><li>Li, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myosin-VIIa+is+expressed+in+multiple+isoforms+and+essential+for+tensioning+the+hair+cell+mechanotransduction+complex.">Myosin-VIIa is expressed in multiple isoforms and essential for tensioning the hair cell mechanotransduction complex.</a> Nat Commun. 11 (1), 2066 (2020).</li><li>Kalinec, G. M., Park, C., Thein, P., Kalinec, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Working+with+auditory+HEI-OC1+cells.">Working with auditory HEI-OC1 cells.</a> J Vis Exp. (115), (2016).</li><li>Montgomery, S. C., Cox, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+mount+dissection+and+immunofluorescence+of+the+adult+mouse+cochlea.">Whole mount dissection and immunofluorescence of the adult mouse cochlea.</a> J Vis Exp. (107), (2016).</li><li>Xu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+mouse+cochlear+progenitors+that+develop+hair+and+supporting+cells+in+the+organ+of+Corti.">Identification of mouse cochlear progenitors that develop hair and supporting cells in the organ of Corti.</a> Nat Commun. 8, 15046 (2017).</li><li>Zheng, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prestin+is+the+motor+protein+of+cochlear+outer+hair+cells.">Prestin is the motor protein of cochlear outer hair cells.</a> Nature. 405 (6783), 149-155 (2000).</li><li>Ruel, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impairment+of+SLC17A8+encoding+vesicular+glutamate+transporter-3,+VGLUT3,+underlies+nonsyndromic+deafness+DFNA25+and+inner+hair+cell+dysfunction+in+null+mice.">Impairment of SLC17A8 encoding vesicular glutamate transporter-3, VGLUT3, underlies nonsyndromic deafness DFNA25 and inner hair cell dysfunction in null mice.</a> Am J Hum Genet. 83 (2), 278-292 (2008).</li><li>Seal, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensorineural+deafness+and+seizures+in+mice+lacking+vesicular+glutamate+transporter+3.">Sensorineural deafness and seizures in mice lacking vesicular glutamate transporter 3.</a> Neuron. 57 (2), 263-275 (2008).</li><li>Luo, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three+distinct+Atoh1+enhancers+cooperate+for+sound+receptor+hair+cell+development.">Three distinct Atoh1 enhancers cooperate for sound receptor hair cell development.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 119 (32), e2119850119 (2022).</li><li>Kalinec, G., Thein, P., Park, C., Kalinec, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HEI-OC1+cells+as+a+model+for+investigating+drug+cytotoxicity.">HEI-OC1 cells as a model for investigating drug cytotoxicity.</a> Hear Res. 335, 105-117 (2016).</li></ol>

著者には開示すべき利益相反はありません。

HEI-OC1細胞株と比較して、有毛細胞の初代培養は、in vivoでの細胞の生理学的状態をより正確に再現しました。したがって、蝸牛器官から生細胞を単離し、直ちに培養する聴覚初代培養法は、聴覚系を広く研究する上で貴重なツールとなると考えられます。成功する文化には、特定のテクニックが不可欠です。第一に、側頭骨からコルチの器官が分離する期間を最小限に抑えることで、有毛細?...

蝸牛有毛細胞は、音の検出と聴覚神経への信号伝達に重要な役割を果たします。有毛細胞は、脊椎動物の一次感覚受容器として機能し、音の振動を電気信号に変換する機構的な細胞です。哺乳類の内耳の感覚上皮は、1列の内有毛細胞と3列の外有毛細胞で構成されています。有毛細胞は、さまざまな基本膜領域で、異なる周波数(20〜2,000Hz)の音を知覚します1。外有毛細胞の機能は、哺乳類の内耳を微調整するのに役立つ活発な機械的増幅プロセスであり、音に対する高い感度を与えます。内有毛細胞は音を検出する役割を担っています。段階的な脱分極の後、音響情報は聴覚神経線維2を介して脳に伝達される。
難聴は、遺伝的欠陥、加齢、騒音トラウマ、または耳毒性薬の過剰使用によって引き起こされる可能性があり、これらは世界中で主要な健康上の懸念を構成しています3,4。難聴は、主に有毛細胞への不可逆的な損傷に起因します5.騒音性難聴に関しては、研究者はその病因のいくつかの詳細についてコンセンサスに達していますが、多くの根本的なメカニズムの包括的な理解が欠けています。外側の有毛細胞は、音響の過露出に対して特に脆弱です6。機械感受性蝸牛有毛細胞は加齢性難聴に関与しています。しかし、有毛細胞の変性の根底にある分子的および細胞的メカニズムは不明のままです。分子プロセスにおけるいくつかの変化は、有毛細胞の老化、酸化ストレス、DNA損傷応答、オートファジー、および有毛細胞の特殊化に関連する遺伝子の発現と転写の調節不全につながります7。
内耳は側頭骨に包まれているため、体の最も硬い骨の奥深くにあるため、実験的にはアクセスできず、有毛細胞の修復と再生のメカニズムの研究に課題を投げかけています。したがって、有毛細胞の機能を調べるためのin vitro培養を確立することは、内耳の再生と損傷のメカニズムを研究するための理想的な方法となっています。蝸牛器官型培養を調製する手順は、以前の研究で説明されています8,9,10。世界中の研究者は、さまざまな蝸牛の顕微解剖および表面調製技術を採用しています。根強い課題にもかかわらず、さまざまな初代有毛細胞培養システムがin vitroで成功裏に確立されています。蝸牛器官の培養には、有毛細胞、ダイター細胞、ヘンセン細胞、柱細胞、聴覚神経線維など、さまざまな種類の細胞が含まれています。受傷後の有毛細胞の変化を細胞レベルや分子レベルで深く理解することで、より強力な研究ツールの開発が可能になります。この研究は、新生児マウスから蝸牛器官を分離し、豊富な有毛細胞を酵素的に剥離してin vitro研究を行う手順を実証することを目的としていました。培養細胞の性質は、免疫蛍光染色を用いて確認した。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>100 mm BioLite cell culture dish</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>130182</td>
			<td>using for culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm Nunc cell culture dish</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>150318</td>
			<td>using for culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well palate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>310109005</td>
			<td>using for culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#181;m cell strainers</td>
			<td>BD Company</td>
			<td>352350</td>
			<td>using for filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 Phalloidin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A12379</td>
			<td>immunofluorescent staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-rabbit IgG Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermo Fisher Scientifc</td>
			<td>A11008</td>
			<td>immunofluorescent staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>day 3-5 neonatal murine&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>provided by Xi&#39;an Jiaotong University</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle Medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11965092</td>
			<td>using for culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12483020</td>
			<td>using for culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Dumont</td>
			<td>5#</td>
			<td>using for dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica anatomy microscope</td>
			<td>Germany</td>
			<td>S9i</td>
			<td>using for dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>using for culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit plyclonal to Myosin VIIa</td>
			<td>Abcam company</td>
			<td>ab92996</td>
			<td>immunofluorescent staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissor</td>
			<td>Belevor</td>
			<td>10cm/04.0524.10</td>
			<td>using for dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma Aldrich&#160;</td>
			<td>9036-19-5</td>
			<td>immunofluorescent staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25200072</td>
			<td>using for culture</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and culture of primary cochlear hair cells from neonatal mice

蝸牛有毛細胞は、聴覚系の感覚受容器です。これらの細胞は、内耳の骨迷路内の聴覚を司る感覚器官であるコルチの器官にあります。蝸牛有毛細胞は、解剖学的にも機能的にも異なる2つのタイプ、すなわち外有毛細胞と内有毛細胞で構成されています。どちらかが損傷すると、難聴になります。特に、内有毛細胞は再生できず、損傷は永久的です。したがって、初代有毛細胞の in vitro 培養は、蝸牛有毛細胞の保護効果または再生効果を調べるために不可欠です。本研究は、マウス有毛細胞の単離・培養方法の発見を目的としています。 
蝸牛側壁を手作業で除去した後、顕微鏡下で蝸牛モディオルスから聴覚上皮を細心の注意を払って解剖し、0.25%トリプシン-EDTAからなる混合物中で37°Cで10分間インキュベートし、200μLのピペットチップを使用して培地に静かに懸濁した。細胞懸濁液を細胞フィルターに通し、濾液を遠心分離し、細胞を24ウェルプレートで培養した。有毛細胞は、運動緊張に関与するメカノトランスダクション複合体であるミオシン-VIIaを発現する能力と、ファロイジンを用いたF-アクチンの選択的標識に基づいて同定されました。細胞は、培養で4d後に>90%のコンフルエントに達しました。この方法は、in vitro培養有毛細胞の生物学的特性の理解を深め、蝸牛有毛細胞培養の効率を実証し、さらなる聴覚研究のための確固たる方法論的基盤を確立することができます。

Cochlear hair cells play important roles in sound detection and signal transmission to the auditory nerve. Hair cells are mechanistic cells that function as primary sensory receptors and convert sound vibrations into electrical signals in vertebrates. The sensory epithelium of the mammalian inner ear comprises a single row of inner hair cells and three rows of outer hair cells. In different basic membrane areas, hair cells perceive sounds at different frequencies (between 20 and 2,000 Hz)1. The function of outer hair cells is an active mechanical amplification process that helps fine-tune the mammalian inner ear, conferring high sensitivity to sound. Inner hair cells are responsible for detecting sounds. After graded depolarization, acoustic information is transmitted to the brain through the auditory nerve fibers2.
Hearing loss may be caused by genetic defects, aging, noise trauma, or the excessive use of ototoxic drugs, which constitute a major health concern worldwide3,4. Hearing loss mainly results from irreversible damage to hair cells5. Regarding noise-induced hearing loss, although researchers have reached a consensus on several details of its etiology, a comprehensive understanding of the numerous underlying mechanisms is lacking. Outer hair cells are particularly vulnerable to acoustic overexposure6. Mechanosensitive cochlear hair cells are involved in age-related hearing loss; however, the molecular and cellular mechanisms underlying hair cell degeneration remain unknown. Several changes in the molecular processes lead to hair cell aging, oxidative stress, DNA damage response, autophagy, and dysregulation of the expression and transcription of genes related to hair cell specialization7.
As the inner ear is encased in the temporal bone, deep in the hardest bone of the body, it is experimentally inaccessible, posing a challenge to investigations into the mechanisms of hair cell repair and regeneration. Hence, establishing in vitro cultures for investigating the function of hair cells has become an ideal method for research on the regeneration and injury mechanisms of the inner ear. The procedures for preparing cochlear organotypic cultures have been described in earlier studies8,9,10. Investigators worldwide have employed various cochlear microdissection and surface preparation techniques. Despite the persistent challenges, various primary hair cell culture systems have been successfully established in vitro. Cochlear organ cultures contain various cell types, including hair cells, Deiters cells, Hensen&#39;s cells, pillar cells, and auditory nerve fibers. An in-depth understanding of the changes in hair cells at the cellular and molecular levels after injury will enable the development of more powerful research tools. This study aimed to demonstrate the steps for isolating cochlear organs from neonatal mice and enzymatically detaching the abundant hair cells for in vitro studies. The nature of the cultured cells was confirmed using immunofluorescence staining.

著者スポットライト:聴覚研究のためのマウス有毛細胞の培養における進歩 

新生仔マウスの初代蝸牛有毛細胞の単離と培養

The inner ear is encased in the temporal bone, deep in the hardest bone of the body, posing a challenging to investigations. The cultivation of primary hair cells is indispensable for investigating cochlear hair cells. This study aimed to discover a method for isolating and cultivating mouse hair cells.We demonstrate the steps for isolating cochlear organs from your natural mice and asymmetrically detaching the abundant hair cells for in-vitro studies. The nature of the cultured cells, was confirmed using immunofluorescence staining. There are three primary culture method established by isolating living cells from cochlear organs, and immediately coaching them, pair to be a valuable tool for extensive research, are all three system.This method can enhance our understanding of the biological characteristics of in-vivo cultured hair cells, and demonstrate the efficiency of cochlear hair cell cultures, establishing a solid methodological foundation for further auditory research.

このプロトコルに続いて、単離された細胞に播種しました。初代蝸牛有毛細胞の種子は、細胞が培地中に浮遊せず、24時間以内に拡散した場合に成功したと見なされました。有毛細胞が付着し、皿の底で平らな凝集体に広がった後の有毛細胞の数を決定しました。1日後、生きた有毛細胞を培養皿の底にしっかりと接着させ、PBSでリンスすることにより非接着細胞を除去した。通常、細胞数は3...

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ここでは、マウスから初代蝸牛有毛細胞を単離して培養するための詳細なプロトコルを紹介します。最初に、コルチの器官は、顕微鏡下で新生児(3〜5日齢)のマウス蝸牛から解剖されました。その後、細胞を酵素的に消化して単一細胞懸濁液とし、数日間培養した後に免疫蛍光法を用いて同定しました。

Cochlear hair cells are the sensory receptors of the auditory system. These cells are located in the organ of Corti, the sensory organ responsible for ...

内耳は側頭骨に包まれており、体の中で最も硬い骨の奥深くにあるため、調査は困難です。初代有毛細胞の培養は、蝸牛有毛細胞の研究に欠かせません。本研究は、マウス有毛細胞の単離・培養方法の発見を目的としています。天然マウスから人工内牛を単離し、豊富な有毛細胞を非対称に剥離してin vitro研究を行う手順を実演します。培養細胞の性質は、免疫蛍光染色を用いて確認した。人工内耳器官から生きた細胞を単離し、すぐに指導することで確立された3つの主要な培養方法があり、広範な研究のための貴重なツールとなるペアは、3つのシステムすべてです。この手法は、生体内で培養した有毛細胞の生物学的特性の理解を深め、蝸牛有毛細胞培養の効率を実証し、さらなる聴覚研究のための確固たる方法論的基盤を確立することができます。

isolation-culture-primary-cochlear-hair-cells-from-neonatal

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation and Culture of Primary Cochlear Hair Cells from Neonatal Mice

1.6K ビュー.  The Second Affiliated Hospital of Xi’an Jiaotong University. 内耳は側頭骨に包まれており、体の中で最も硬い骨の奥深くにあるため、調査は困難です。初代有毛細胞の培養は、蝸牛有毛細胞の研究に欠かせません。本研究は、マウス有毛細胞の単離・培養方法の発見を目的としています。天然マウスから人工内牛を単離し、豊富な有毛細胞を非対称に剥離してin vitro研究を行う手順を実演します。培養細胞の性質は、免疫蛍?...

ビデオ: 著者スポットライト:聴覚研究のためのマウス有毛細胞の培養における進歩 

Cochlear hair cells are the sensory receptors of the auditory system. These cells are located in the organ of Corti, the sensory organ responsible for hearing, within the osseous labyrinth of the inner ear. Cochlear hair cells consist of two anatomically and functionally distinct types: outer and inner hair cells. Damage to either of them results in hearing loss. Notably, as inner hair cells cannot regenerate, and damage to them is permanent. Hence, in vitro cultivation of primary hair cells is indispensable for investigating the protective or regenerative effects of cochlear hair cells. This study aimed to discover a method for isolating and cultivating mouse hair cells. 
After manual removal of the cochlear lateral wall, the auditory epithelium was meticulously dissected from the cochlear modiolus under a microscope, incubated in a mixture consisting of 0.25% trypsin-EDTA for 10 min at 37 &#176;C, and gently suspended in culture medium using a 200 &#181;L pipette tip. The cell suspension was passed through a cell filter, the filtrate was centrifuged, and cells were cultured in 24-well plates. Hair cells were identified based on their capacity to express a mechanotransduction complex, myosin-VIIa, which is involved in motor tensions, and via selective labeling of F-actin using phalloidin. Cells reached &gt;90% confluence after 4 d in culture. This method can enhance our understanding of the biological characteristics of in vitro cultured hair cells and demonstrate the efficiency of cochlear hair cell cultures, establishing a solid methodological foundation for further auditory research.

Herein, we present a detailed protocol for isolating and culturing primary cochlear hair cells from mice. Initially, the organ of Corti was dissected from neonatal (aged 3-5 days) murine cochleae under a microscope. Subsequently, cells were enzymatically digested into a single-cell suspension and identified using immunofluorescence after several days in culture.

生物学

Dissection and Removal of the Temporal Bone to Collect Auditory Epithelia from Newborn Mice

To begin, securely hold the head of the euthanized newborn mice in place. Using micro operating scissors, open the scalp along the sagittal suture. Then, separate and immobilize the scalp bilaterally with the fingers.Use scissors to sever the cranium and flip it forward to access the skull. Employ a small periosteal elevator to extract the brain and then use the tip of the scissors to gently scrape the brain, revealing the base of the skull. Now, examine the bilateral temporal bones at the skull's base.Employ scissors to incise the base of the skull along the midline. Then, scrape off the skin and eliminate any unnecessary bone. Preserve and transfer the temporal bones to 35-millimeter sterile Petri dishes filled with fresh HBSS.Next, use a pair of 5 number pointed forceps to eliminate the bola and surrounding tissue from the petrous portion of the temporal bone. Hold the forceps with one hand to stabilize the semi-circular part of the temporal bone. Use the other hand to insert the lower tip of the forceps into the round window niche, separating the lateral bone of the cochlea from the scale of vestibule.Carefully remove the petrous portion of the temporal bone without contacting the Organ of Corti epithelium. Then, meticulously detach and extract the bony labyrinth of the cochlea, starting from the basal to the apical end. Using 5 number pointed forceps, carefully micro isolate the sensory epithelium of the Organ of Corti from the modiolus.Next, employ micro-operating forceps to hold the spiral ligament, and gently separate it from the stria vascularis. Transfer the clean auditory epithelium, using a 200 microliter pipette, to a three millimeter sterile culture dish containing HBSS. Place the isolated auditory epithelium in a 100 millimeter sterile Petri dish filled with HBSS for the subsequent preparation steps.

新生仔マウスの聴覚上皮を採取するための側頭骨の解剖と除去

Enzymatic Disaggregation of the Auditory Epithelium to Obtain Auditory Hair Cells

To begin, isolate the auditory epithelium from the temporal bone of newborn mice and transfer it to 10 milliliters of fresh DMEM containing 0.25%Trypsin, incubate the mixture at 37 degrees Celsius for 12 minutes. Using a 200 microliter pipette tip, gently separate the hair cells from the basal lamina and other cells using an operating microscope. Then add another 10 milliliters of culture medium to inhibit the disaggregation.Filter the suspended cells through a 70 micrometer filter. Collect the filtrate in a clean 50 milliliter tube and centrifuge it at 300G for five minutes. Using a 1000 microliter pipette tip, re suspend the hair cells in five milliliters of culture medium by gentle pipetting.Now place a cover slip at the bottom of a six well plate in advance. Count the cells and culture them at 10 to the sixth cells per milliliter density in the six well plate, grow the adherence cells in two milliliters of DMEM at 37 degrees Celsius and 5%carbon dioxide. After one day of culturing the hair cells adhered firmly to the bottom of the dish.By the third day, the number of cells had doubled.