Questo lavoro è stato sostenuto dalla National Natural Science Foundation of China (NFSC 82101224 to YG)

Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati approvati (n. 2021-847) dal Comitato per l'uso e la cura degli animali dell'Università di Xi'an Jiaotong.
1. Sterilizzazione e preparazione del materiale
<ol><li>Sterilizzare gli strumenti di dissezione utilizzando la disinfezione a vapore ad alta temperatura e ad alta pressione e asciugarli in un'incubatrice a 50 °C per una notte.</li>
	<li>Preparare in anticipo 100 mL di terreno di coltura contenente il 10% di siero fetale bovino (FBS) e 10 mg/mL di penicillina/streptomicina (aggiungere 10 mL di FBS e 10 μL di soluzione madre di penicillina a 90 mL di terreno di Dulbecco Modified Eagle Medium (EMEM)) e conservare a 4 °C.</li>
</ol>2. Dissezione e asportazione dell'osso temporale per la raccolta degli epiteli uditivi
<ol><li>Sopprimere un numero totale di 10 topi neonati (di età compresa tra P3 e P5) mediante decapitazione su ghiaccio. Utilizzare una metodologia alternativa ed eticamente approvata, se necessario.</li>
	<li>Tenere la testa in posizione, aprire il cuoio capelluto lungo la sutura sagittale utilizzando forbici microoperatorie e separare e fissare il cuoio capelluto bilateralmente con le dita, come mostrato nella Figura 1A.</li>
	<li>Rimuovere il cervello utilizzando un piccolo elevatore periostale e dividere in due il cranio basale. Taglia il cranio con le forbici e capovolgilo in avanti per aprire il cranio; Usa la punta delle forbici per raschiare il cervello ed esporre la base del cranio.</li>
	<li>Osservare le ossa temporali bilaterali alla base del cranio (Figura 1C). Usa le forbici per tagliare la base del cranio lungo la linea mediana, raschiare via la pelle e rimuovere l'osso non necessario (Figura 1D,D').</li>
	<li>Conservare e trasferire le ossa temporali in piastre di Petri sterili da 35 mm contenenti una soluzione salina bilanciata di Hank (HBSS) fresca (Figura 1E).</li>
	<li>Utilizzare due pinze a punta #5 per rimuovere la bolla e il tessuto circostante dalla porzione petrosa dell'osso temporale (Figura 1E). NOTA: In questa fase, il labirinto osseo nell'osso temporale dei topi non sarebbe completamente calcificato e sarebbe facilmente sezionato usando il forcipe.</li>
	<li>Tenere la pinza con una mano per fissare la parte semicircolare dell'osso temporale e infilare il piede inferiore della pinza nella nicchia rotonda della finestra con l'altra mano per separare l'osso laterale della coclea dal vestibolo della scala. Rimuovere con cautela la porzione petrosa dell'osso temporale senza toccare l'epitelio OC. Successivamente, separare e rimuovere con cura il labirinto osseo della coclea dall'estremità basale all'estremità apicale (Figura 1F).</li>
	<li>Microisolare con cura l'organo dell'epitelio sensoriale di Corti dal modiolo utilizzando una pinza a #5 punte (Figura 1G).</li>
	<li>Tenere il legamento spirale, separarlo con cura dalla stria vascolare con una pinza microoperatoria e trasferire l'epitelio uditivo pulito in una piastra di coltura sterile da 3 mm contenente HBSS utilizzando una pipetta da 200 μL (Figura 1H).</li>
	<li>Raccogliete 20 campioni da ciascun animale e trasferiteli rapidamente in una capsula di Petri sterile da 100 mm contenente HBSS per la fase successiva della preparazione (Figura 1).</li>
</ol>3. Disaggregazione enzimatica per l'ottenimento di cellule ciliate uditive
<ol><li>Trasferire l'epitelio uditivo in 10 mL di DMEM fresco contenente lo 0,25% di tripsina e incubare a 37 °C per 12 min.</li>
	<li>Utilizzando un puntale per pipette da 200 μL, separare delicatamente le cellule ciliate dalla lamina basale e dalle altre cellule al microscopio operatorio.</li>
	<li>Aggiungere altri 10 mL di terreno di coltura per inibire la disaggregazione.</li>
	<li>Filtrare le cellule sospese nel terreno di coltura attraverso un filtro da 70 μm, raccogliere il filtrato in una provetta pulita da 50 ml e centrifugarlo a 300 × g per 5 minuti.</li>
	<li>Risospendere le cellule ciliate in almeno 5 mL di terreno di coltura pipettandole delicatamente su e giù utilizzando un puntale per pipette da 1.000 μL. Evitare di introdurre bolle.</li>
	<li>Posizionare in anticipo un vetrino coprioggetti sul fondo di una piastra a sei pozzetti. Contare le cellule e coltivarle a una densità di 10,6 cellule/mL in piastre a sei pozzetti.</li>
	<li>Far crescere le cellule aderenti in 2 mL di DMEM (contenente il 10% di FBS, 100 unità/mL di penicillina e 100 μg/mL di streptomicina) a 37 °C e il 5% di CO2 . Cambiare il terreno di coltura ogni giorno. NOTA: Va detto che l'utilizzo di questo protocollo non comporta l'ottenimento di cellule ciliate pure. Sulla base di questo metodo di coltura cellulare primaria, si consiglia di utilizzare cellule d2 o d3 per ulteriori studi, poiché le cellule ciliate potrebbero costituire circa il 70% delle cellule in coltura ed essere in buono stato.</li>
</ol>4. Colorazione immunofluorescente
<ol><li>Prelevare le cellule coltivate da d1 a d6 (un pozzetto al giorno). Aspirare il terreno di coltura e sciacquare le cellule 2 volte con soluzione salina tamponata con fosfato (PBS).</li>
	<li>Fissare le cellule con paraformaldeide al 4% per 15 minuti a temperatura ambiente (RT).</li>
	<li>Rimuovere il fissativo e sciacquare le cellule per 3 x 3 minuti con PBS.</li>
	<li>Permeabilizzare le cellule con PBS contenente lo 0,2% di Triton X-100 per 10 minuti a RT.</li>
	<li>Incubare le cellule permeabilizzate con una soluzione bloccante costituita da FBS al 10% in PBS per 20 minuti a RT.</li>
	<li>Colorare le cellule con anticorpo monoclonale anti-miosina (diluito a 1:200 in PBS) a 4 °C durante la notte.</li>
	<li>Lavare le cellule 3 volte con PBS sterile e incubarle con anticorpo secondario (Alexa Fluor 594 goat anti-rabbit MYO7A, diluito 1:500 in PBS) e falloidina marcata con fluoresceina (Alexa Fluor 488, per identificare la struttura cellulare) per 2 ore a RT.</li>
	<li>Sciacquare le cellule 3 volte con PBS per rimuovere gli anticorpi secondari.</li>
	<li>Aggiungere 1-2 gocce di mezzo di montaggio con DAPI sui vetrini, montare i vetrini coprioggetti e posizionarli sotto un microscopio confocale a scansione laser per catturare foto delle cellule.</li>
</ol>5. Analisi statistica
<ol><li>Eseguire l'analisi della varianza a due vie (ANOVA) seguita dai test post hoc di Tukey per analizzare le variazioni dei valori di grigio della miosina-VIIa e della falloidina nel tempo. Utilizzare il metodo di marcatura delle lettere per contrassegnare le differenze statistiche.</li>
	<li>Eseguire ulteriori ANOVA unidirezionali seguite dai test post-hoc di Tukey per confrontare il rapporto cellulare falloidina-positivo tra i campioni cellulari dal giorno 1 al giorno 6 e il rapporto cellulare miosina-VII-positivo negli stessi giorni.</li>
</ol>

Coltivazione efficiente in vitro di cellule ciliate cocleari di topo

<ol>
	<li>Tani, T., Koike-Tani, M., Tran, M. T., Shribak, M., Levic, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postnatal+structural+development+of+mammalian+Basilar+Membrane+provides+anatomical+basis+for+the+maturation+of+tonotopic+maps+and+frequency+tuning.">Postnatal structural development of mammalian Basilar Membrane provides anatomical basis for the maturation of tonotopic maps and frequency tuning.</a> Sci Rep. 11 (1), 7581 (2021).</li><li>Goutman, J. D., Elgoyhen, A. B., Gomez-Casati, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cochlear+hair+cells:+The+sound-sensing+machines.">Cochlear hair cells: The sound-sensing machines.</a> FEBS Lett. 589 (22), 3354-3361 (2015).</li><li>Joo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Contribution+of+Ototoxic+Medications+to+Hearing+Loss+Among+Older+Adults.">The Contribution of Ototoxic Medications to Hearing Loss Among Older Adults.</a> J Gerontol A Biol Sci Med Sci. 75 (3), 561-566 (2020).</li><li>Nieman, C. L., Oh, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hearing+Loss.">Hearing Loss.</a> Ann Intern Med. 173 (11), ITC81-ITC96 (2020).</li><li>Mao, H., Chen, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noise-Induced+Hearing+Loss:+Updates+on+Molecular+Targets+and+Potential+Interventions.">Noise-Induced Hearing Loss: Updates on Molecular Targets and Potential Interventions.</a> Neural Plast. 2021, 4784385 (2021).</li><li>Morioka, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hearing+vulnerability+after+noise+exposure+in+a+mouse+model+of+reactive+oxygen+species+overproduction.">Hearing vulnerability after noise exposure in a mouse model of reactive oxygen species overproduction.</a> J Neurochem. 146 (4), 459-473 (2018).</li><li>Liu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+and+cytological+profiling+of+biological+aging+of+mouse+cochlear+inner+and+outer+hair+cells.">Molecular and cytological profiling of biological aging of mouse cochlear inner and outer hair cells.</a> Cell Rep. 39 (2), 110665 (2022).</li><li>Ogier, J. M., Burt, R. A., Drury, H. R., Lim, R., Nayagam, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+Culture+of+Neonatal+Murine+Inner+Ear+Explants.">Organotypic Culture of Neonatal Murine Inner Ear Explants.</a> Front Cell Neurosci. 13, 170 (2019).</li><li>Ding, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cisplatin+ototoxicity+in+rat+cochlear+organotypic+cultures.">Cisplatin ototoxicity in rat cochlear organotypic cultures.</a> Hear Res. 282 (1-2), 196-203 (2011).</li><li>Abitbol, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cisplatin-induced+ototoxicity+in+organotypic+cochlear+cultures+occurs+independent+of+gap+junctional+intercellular+communication.">Cisplatin-induced ototoxicity in organotypic cochlear cultures occurs independent of gap junctional intercellular communication.</a> Cell Death Dis. 11 (5), 342 (2020).</li><li>Li, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myosin-VIIa+is+expressed+in+multiple+isoforms+and+essential+for+tensioning+the+hair+cell+mechanotransduction+complex.">Myosin-VIIa is expressed in multiple isoforms and essential for tensioning the hair cell mechanotransduction complex.</a> Nat Commun. 11 (1), 2066 (2020).</li><li>Kalinec, G. M., Park, C., Thein, P., Kalinec, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Working+with+auditory+HEI-OC1+cells.">Working with auditory HEI-OC1 cells.</a> J Vis Exp. (115), (2016).</li><li>Montgomery, S. C., Cox, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+mount+dissection+and+immunofluorescence+of+the+adult+mouse+cochlea.">Whole mount dissection and immunofluorescence of the adult mouse cochlea.</a> J Vis Exp. (107), (2016).</li><li>Xu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+mouse+cochlear+progenitors+that+develop+hair+and+supporting+cells+in+the+organ+of+Corti.">Identification of mouse cochlear progenitors that develop hair and supporting cells in the organ of Corti.</a> Nat Commun. 8, 15046 (2017).</li><li>Zheng, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prestin+is+the+motor+protein+of+cochlear+outer+hair+cells.">Prestin is the motor protein of cochlear outer hair cells.</a> Nature. 405 (6783), 149-155 (2000).</li><li>Ruel, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impairment+of+SLC17A8+encoding+vesicular+glutamate+transporter-3,+VGLUT3,+underlies+nonsyndromic+deafness+DFNA25+and+inner+hair+cell+dysfunction+in+null+mice.">Impairment of SLC17A8 encoding vesicular glutamate transporter-3, VGLUT3, underlies nonsyndromic deafness DFNA25 and inner hair cell dysfunction in null mice.</a> Am J Hum Genet. 83 (2), 278-292 (2008).</li><li>Seal, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensorineural+deafness+and+seizures+in+mice+lacking+vesicular+glutamate+transporter+3.">Sensorineural deafness and seizures in mice lacking vesicular glutamate transporter 3.</a> Neuron. 57 (2), 263-275 (2008).</li><li>Luo, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three+distinct+Atoh1+enhancers+cooperate+for+sound+receptor+hair+cell+development.">Three distinct Atoh1 enhancers cooperate for sound receptor hair cell development.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 119 (32), e2119850119 (2022).</li><li>Kalinec, G., Thein, P., Park, C., Kalinec, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HEI-OC1+cells+as+a+model+for+investigating+drug+cytotoxicity.">HEI-OC1 cells as a model for investigating drug cytotoxicity.</a> Hear Res. 335, 105-117 (2016).</li></ol>

Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.

Rispetto alla linea cellulare HEI-OC1, le colture primarie di cellule ciliate hanno replicato in modo più accurato lo stato fisiologico delle cellule in vivo. Pertanto, il metodo di coltura primaria uditiva stabilito isolando cellule viventi dagli organi cocleari e coltivandole immediatamente sembra essere uno strumento prezioso per una ricerca approfondita sui sistemi uditivi. Alcune tecniche sono fondamentali per una cultura di successo. In primo luogo, ridurre al minimo la durata della separazione dell'organo di Cort...

Le cellule ciliate cocleari svolgono un ruolo importante nel rilevamento del suono e nella trasmissione del segnale al nervo uditivo. Le cellule ciliate sono cellule meccanicistiche che funzionano come recettori sensoriali primari e convertono le vibrazioni sonore in segnali elettrici nei vertebrati. L'epitelio sensoriale dell'orecchio interno dei mammiferi comprende una singola fila di cellule ciliate interne e tre file di cellule ciliate esterne. In diverse aree di base della membrana, le cellule ciliate percepiscono i suoni a frequenze diverse (tra 20 e 2.000 Hz)1. La funzione delle cellule ciliate esterne è un processo di amplificazione meccanica attiva che aiuta a mettere a punto l'orecchio interno dei mammiferi, conferendo un'elevata sensibilità al suono. Le cellule ciliate interne sono responsabili del rilevamento dei suoni. Dopo la depolarizzazione graduale, le informazioni acustiche vengono trasmesse al cervello attraverso le fibre nervose uditive2.
La perdita dell'udito può essere causata da difetti genetici, invecchiamento, traumi da rumore o dall'uso eccessivo di farmaci ototossici, che costituiscono un grave problema di salute in tutto il mondo 3,4. La perdita dell'udito deriva principalmente da danni irreversibili alle cellule ciliate5. Per quanto riguarda la perdita dell'udito indotta dal rumore, sebbene i ricercatori abbiano raggiunto un consenso su diversi dettagli della sua eziologia, manca una comprensione completa dei numerosi meccanismi sottostanti. Le cellule ciliate esterne sono particolarmente vulnerabili alla sovraesposizione acustica6. Le cellule ciliate cocleari meccanosensibili sono coinvolte nella perdita dell'udito legata all'età; Tuttavia, i meccanismi molecolari e cellulari alla base della degenerazione delle cellule ciliate rimangono sconosciuti. Diversi cambiamenti nei processi molecolari portano all'invecchiamento delle cellule ciliate, allo stress ossidativo, alla risposta al danno del DNA, all'autofagia e alla disregolazione dell'espressione e della trascrizione dei geni correlati alla specializzazione delle cellule ciliate7.
Poiché l'orecchio interno è racchiuso nell'osso temporale, in profondità nell'osso più duro del corpo, è sperimentalmente inaccessibile, ponendo una sfida alle indagini sui meccanismi di riparazione e rigenerazione delle cellule ciliate. Quindi, la creazione di colture in vitro per studiare la funzione delle cellule ciliate è diventata un metodo ideale per la ricerca sui meccanismi di rigenerazione e lesione dell'orecchio interno. Le procedure per la preparazione di colture organotipiche cocleari sono state descritte in studi precedenti 8,9,10. I ricercatori di tutto il mondo hanno impiegato varie tecniche di microdissezione cocleare e di preparazione della superficie. Nonostante le sfide persistenti, vari sistemi di coltura di cellule ciliate primarie sono stati stabiliti con successo in vitro. Le colture di organi cocleari contengono vari tipi di cellule, tra cui cellule ciliate, cellule di Deiters, cellule di Hensen, cellule pilastro e fibre nervose uditive. Una comprensione approfondita dei cambiamenti nelle cellule ciliate a livello cellulare e molecolare dopo una lesione consentirà lo sviluppo di strumenti di ricerca più potenti. Questo studio mirava a dimostrare i passaggi per isolare gli organi cocleari dai topi neonatali e staccare enzimaticamente le abbondanti cellule ciliate per gli studi in vitro. La natura delle cellule coltivate è stata confermata utilizzando la colorazione in immunofluorescenza.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>100 mm BioLite cell culture dish</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>130182</td>
			<td>using for culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm Nunc cell culture dish</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>150318</td>
			<td>using for culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well palate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>310109005</td>
			<td>using for culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#181;m cell strainers</td>
			<td>BD Company</td>
			<td>352350</td>
			<td>using for filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 Phalloidin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A12379</td>
			<td>immunofluorescent staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-rabbit IgG Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermo Fisher Scientifc</td>
			<td>A11008</td>
			<td>immunofluorescent staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>day 3-5 neonatal murine&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>provided by Xi&#39;an Jiaotong University</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle Medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11965092</td>
			<td>using for culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12483020</td>
			<td>using for culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Dumont</td>
			<td>5#</td>
			<td>using for dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica anatomy microscope</td>
			<td>Germany</td>
			<td>S9i</td>
			<td>using for dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>using for culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit plyclonal to Myosin VIIa</td>
			<td>Abcam company</td>
			<td>ab92996</td>
			<td>immunofluorescent staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissor</td>
			<td>Belevor</td>
			<td>10cm/04.0524.10</td>
			<td>using for dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma Aldrich&#160;</td>
			<td>9036-19-5</td>
			<td>immunofluorescent staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25200072</td>
			<td>using for culture</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and culture of primary cochlear hair cells from neonatal mice

Le cellule ciliate cocleari sono i recettori sensoriali del sistema uditivo. Queste cellule si trovano nell'organo di Corti, l'organo sensoriale responsabile dell'udito, all'interno del labirinto osseo dell'orecchio interno. Le cellule ciliate cocleari sono costituite da due tipi anatomicamente e funzionalmente distinti: cellule ciliate esterne e interne. Il danno a uno di essi provoca la perdita dell'udito. In particolare, poiché le cellule ciliate interne non possono rigenerarsi e il loro danno è permanente. Pertanto, la coltivazione in vitro di cellule ciliate primarie è indispensabile per studiare gli effetti protettivi o rigenerativi delle cellule ciliate cocleari. Questo studio mirava a scoprire un metodo per isolare e coltivare le cellule ciliate di topo. 
Dopo la rimozione manuale della parete laterale cocleare, l'epitelio uditivo è stato meticolosamente sezionato dal miolo cocleare al microscopio, incubato in una miscela composta da tripsina-EDTA allo 0,25% per 10 minuti a 37 °C e delicatamente sospeso nel terreno di coltura utilizzando un puntale per pipette da 200 μL. La sospensione cellulare è stata fatta passare attraverso un filtro cellulare, il filtrato è stato centrifugato e le cellule sono state coltivate in piastre a 24 pozzetti. Le cellule ciliate sono state identificate in base alla loro capacità di esprimere un complesso di meccanotrasduzione, la miosina-VIIa, che è coinvolta nelle tensioni motorie, e tramite marcatura selettiva della F-actina utilizzando falloidina. Le cellule hanno raggiunto l'>90% di confluenza dopo 4 giorni in coltura. Questo metodo può migliorare la nostra comprensione delle caratteristiche biologiche delle cellule ciliate coltivate in vitro e dimostrare l'efficienza delle colture di cellule ciliate cocleari, stabilendo una solida base metodologica per ulteriori ricerche uditive.

Cochlear hair cells play important roles in sound detection and signal transmission to the auditory nerve. Hair cells are mechanistic cells that function as primary sensory receptors and convert sound vibrations into electrical signals in vertebrates. The sensory epithelium of the mammalian inner ear comprises a single row of inner hair cells and three rows of outer hair cells. In different basic membrane areas, hair cells perceive sounds at different frequencies (between 20 and 2,000 Hz)1. The function of outer hair cells is an active mechanical amplification process that helps fine-tune the mammalian inner ear, conferring high sensitivity to sound. Inner hair cells are responsible for detecting sounds. After graded depolarization, acoustic information is transmitted to the brain through the auditory nerve fibers2.
Hearing loss may be caused by genetic defects, aging, noise trauma, or the excessive use of ototoxic drugs, which constitute a major health concern worldwide3,4. Hearing loss mainly results from irreversible damage to hair cells5. Regarding noise-induced hearing loss, although researchers have reached a consensus on several details of its etiology, a comprehensive understanding of the numerous underlying mechanisms is lacking. Outer hair cells are particularly vulnerable to acoustic overexposure6. Mechanosensitive cochlear hair cells are involved in age-related hearing loss; however, the molecular and cellular mechanisms underlying hair cell degeneration remain unknown. Several changes in the molecular processes lead to hair cell aging, oxidative stress, DNA damage response, autophagy, and dysregulation of the expression and transcription of genes related to hair cell specialization7.
As the inner ear is encased in the temporal bone, deep in the hardest bone of the body, it is experimentally inaccessible, posing a challenge to investigations into the mechanisms of hair cell repair and regeneration. Hence, establishing in vitro cultures for investigating the function of hair cells has become an ideal method for research on the regeneration and injury mechanisms of the inner ear. The procedures for preparing cochlear organotypic cultures have been described in earlier studies8,9,10. Investigators worldwide have employed various cochlear microdissection and surface preparation techniques. Despite the persistent challenges, various primary hair cell culture systems have been successfully established in vitro. Cochlear organ cultures contain various cell types, including hair cells, Deiters cells, Hensen&#39;s cells, pillar cells, and auditory nerve fibers. An in-depth understanding of the changes in hair cells at the cellular and molecular levels after injury will enable the development of more powerful research tools. This study aimed to demonstrate the steps for isolating cochlear organs from neonatal mice and enzymatically detaching the abundant hair cells for in vitro studies. The nature of the cultured cells was confirmed using immunofluorescence staining.

Autore in primo piano: Progressi nella coltivazione di cellule ciliate di topo per la ricerca uditiva 

Isolamento e coltura di cellule ciliate cocleari primarie da topi neonatali

The inner ear is encased in the temporal bone, deep in the hardest bone of the body, posing a challenging to investigations. The cultivation of primary hair cells is indispensable for investigating cochlear hair cells. This study aimed to discover a method for isolating and cultivating mouse hair cells.We demonstrate the steps for isolating cochlear organs from your natural mice and asymmetrically detaching the abundant hair cells for in-vitro studies. The nature of the cultured cells, was confirmed using immunofluorescence staining. There are three primary culture method established by isolating living cells from cochlear organs, and immediately coaching them, pair to be a valuable tool for extensive research, are all three system.This method can enhance our understanding of the biological characteristics of in-vivo cultured hair cells, and demonstrate the efficiency of cochlear hair cell cultures, establishing a solid methodological foundation for further auditory research.

Seguendo questo protocollo, abbiamo seminato le cellule isolate. I semi primari di cellule ciliate cocleari sono stati considerati efficaci se le cellule non galleggiavano nel terreno di coltura e non si diffondevano entro 24 ore. Abbiamo determinato il numero di cellule ciliate dopo che hanno aderito e si sono diffuse in aggregati piatti sul fondo del piatto. Dopo 1 giorno, le cellule ciliate vive sono state strettamente aderenti al fondo della piastra di coltura e le cellule non aderenti sono state rimosse mediante ris...

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In questo articolo, presentiamo un protocollo dettagliato per l'isolamento e la coltura di cellule ciliate cocleari primarie dai topi. Inizialmente, l'organo di Corti è stato sezionato da coclee murine neonatali (di 3-5 giorni) al microscopio. Successivamente, le cellule sono state digerite enzimaticamente in una sospensione unicellulare e identificate utilizzando l'immunofluorescenza dopo diversi giorni in coltura.

Cochlear hair cells are the sensory receptors of the auditory system. These cells are located in the organ of Corti, the sensory organ responsible for ...

L'orecchio interno è racchiuso nell'osso temporale, in profondità nell'osso più duro del corpo, ponendo una sfida alle indagini. La coltivazione di cellule ciliate primarie è indispensabile per lo studio delle cellule ciliate cocleari. Questo studio mirava a scoprire un metodo per isolare e coltivare le cellule ciliate di topo.Dimostriamo i passaggi per isolare gli organi cocleari dai topi naturali e staccare asimmetricamente le abbondanti cellule ciliate per gli studi in vitro. La natura delle cellule coltivate è stata confermata utilizzando la colorazione a immunofluorescenza. Ci sono tre metodi di coltura primari stabiliti isolando le cellule viventi dagli organi cocleari, e immediatamente addestrarli, coppia per essere uno strumento prezioso per una ricerca approfondita, sono tutti e tre il sistema.Questo metodo può migliorare la nostra comprensione delle caratteristiche biologiche delle cellule ciliate coltivate in vivo e dimostrare l'efficienza delle colture di cellule ciliate cocleari, stabilendo una solida base metodologica per ulteriori ricerche uditive.

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Research

JoVE Journal

Biology

Isolation and Culture of Primary Cochlear Hair Cells from Neonatal Mice

1.6K Views.  The Second Affiliated Hospital of Xi’an Jiaotong University. L'orecchio interno è racchiuso nell'osso temporale, in profondità nell'osso più duro del corpo, ponendo una sfida alle indagini. La coltivazione di cellule ciliate primarie è indispensabile per lo studio delle cellule ciliate cocleari. Questo studio mirava a scoprire un metodo per isolare e coltivare le cellule ciliate di topo.Dimostriamo i passaggi per isolare gli organi cocleari dai topi naturali e staccare asimmetricamente le abbondanti cellule ciliate per gli studi in vitro. La...

Video: Autore in primo piano: Progressi nella coltivazione di cellule ciliate di topo per la ricerca uditiva 

Cochlear hair cells are the sensory receptors of the auditory system. These cells are located in the organ of Corti, the sensory organ responsible for hearing, within the osseous labyrinth of the inner ear. Cochlear hair cells consist of two anatomically and functionally distinct types: outer and inner hair cells. Damage to either of them results in hearing loss. Notably, as inner hair cells cannot regenerate, and damage to them is permanent. Hence, in vitro cultivation of primary hair cells is indispensable for investigating the protective or regenerative effects of cochlear hair cells. This study aimed to discover a method for isolating and cultivating mouse hair cells. 
After manual removal of the cochlear lateral wall, the auditory epithelium was meticulously dissected from the cochlear modiolus under a microscope, incubated in a mixture consisting of 0.25% trypsin-EDTA for 10 min at 37 &#176;C, and gently suspended in culture medium using a 200 &#181;L pipette tip. The cell suspension was passed through a cell filter, the filtrate was centrifuged, and cells were cultured in 24-well plates. Hair cells were identified based on their capacity to express a mechanotransduction complex, myosin-VIIa, which is involved in motor tensions, and via selective labeling of F-actin using phalloidin. Cells reached &gt;90% confluence after 4 d in culture. This method can enhance our understanding of the biological characteristics of in vitro cultured hair cells and demonstrate the efficiency of cochlear hair cell cultures, establishing a solid methodological foundation for further auditory research.

Herein, we present a detailed protocol for isolating and culturing primary cochlear hair cells from mice. Initially, the organ of Corti was dissected from neonatal (aged 3-5 days) murine cochleae under a microscope. Subsequently, cells were enzymatically digested into a single-cell suspension and identified using immunofluorescence after several days in culture.

Ricerca

Biologia

Dissection and Removal of the Temporal Bone to Collect Auditory Epithelia from Newborn Mice

To begin, securely hold the head of the euthanized newborn mice in place. Using micro operating scissors, open the scalp along the sagittal suture. Then, separate and immobilize the scalp bilaterally with the fingers.Use scissors to sever the cranium and flip it forward to access the skull. Employ a small periosteal elevator to extract the brain and then use the tip of the scissors to gently scrape the brain, revealing the base of the skull. Now, examine the bilateral temporal bones at the skull's base.Employ scissors to incise the base of the skull along the midline. Then, scrape off the skin and eliminate any unnecessary bone. Preserve and transfer the temporal bones to 35-millimeter sterile Petri dishes filled with fresh HBSS.Next, use a pair of 5 number pointed forceps to eliminate the bola and surrounding tissue from the petrous portion of the temporal bone. Hold the forceps with one hand to stabilize the semi-circular part of the temporal bone. Use the other hand to insert the lower tip of the forceps into the round window niche, separating the lateral bone of the cochlea from the scale of vestibule.Carefully remove the petrous portion of the temporal bone without contacting the Organ of Corti epithelium. Then, meticulously detach and extract the bony labyrinth of the cochlea, starting from the basal to the apical end. Using 5 number pointed forceps, carefully micro isolate the sensory epithelium of the Organ of Corti from the modiolus.Next, employ micro-operating forceps to hold the spiral ligament, and gently separate it from the stria vascularis. Transfer the clean auditory epithelium, using a 200 microliter pipette, to a three millimeter sterile culture dish containing HBSS. Place the isolated auditory epithelium in a 100 millimeter sterile Petri dish filled with HBSS for the subsequent preparation steps.

Dissezione e rimozione dell'osso temporale per raccogliere epiteli uditivi da topi neonati

Enzymatic Disaggregation of the Auditory Epithelium to Obtain Auditory Hair Cells

To begin, isolate the auditory epithelium from the temporal bone of newborn mice and transfer it to 10 milliliters of fresh DMEM containing 0.25%Trypsin, incubate the mixture at 37 degrees Celsius for 12 minutes. Using a 200 microliter pipette tip, gently separate the hair cells from the basal lamina and other cells using an operating microscope. Then add another 10 milliliters of culture medium to inhibit the disaggregation.Filter the suspended cells through a 70 micrometer filter. Collect the filtrate in a clean 50 milliliter tube and centrifuge it at 300G for five minutes. Using a 1000 microliter pipette tip, re suspend the hair cells in five milliliters of culture medium by gentle pipetting.Now place a cover slip at the bottom of a six well plate in advance. Count the cells and culture them at 10 to the sixth cells per milliliter density in the six well plate, grow the adherence cells in two milliliters of DMEM at 37 degrees Celsius and 5%carbon dioxide. After one day of culturing the hair cells adhered firmly to the bottom of the dish.By the third day, the number of cells had doubled.