تم دعم هذا العمل من خلال منح المعاهد الوطنية للصحة R01-HD093827 و R03-HD090304 (A.J.T).

تم تنفيذ جميع الإجراءات الحيوانية بموجب المبادئ التوجيهية ووافقت عليها لجنة رعاية واستخدام المؤسسية في جامعة كورنيل (# 2002-0095). تم استخدام الفئران AcroSensE2 البالغة من العمر 8-10 أسابيع في الدراسة الحالية. يمكن تقديم طلبات الحصول على معلومات حول توافر الفئران AcroSensE إلى المؤلف المقابل.
1. جمع المنوية وغسلها
<ol><li>جمع المنوية الذيلية البربخية (يتم توفير مزيد من التفاصيل حول هذا الإجراء في11) من الفئران AcroSensE. اترك 15 دقيقة في طبق زراعة الأنسجة 3.5 سم يحتوي على 0.5 مل من وسط ويتن المعدل (MW) عند 37 درجة مئوية. يجب تغطية الطبق لتقليل تبخر MW ، ويجب إمالته بحيث يكون للوسط عمق كاف لتغطية البربخ الذيلي. ملاحظة: يحتوي وسط ويتن المعدل (MW) على 22 مللي متر HEPES ، 1.2 mM MgCl2 ، 100 mM NaCl ، 4.7 mM KCl ، 1 mM حمض البيروفيك ، 4.8 mM حمض اللاكتيك hemi-Ca2+ ملح ، درجة الحموضة 7.35. يتم استكمال الجلوكوز (5.5 mM) ، NaHCO3 (10 mM) ، و 2-hydroxypropyl--cyclodextrin (CD ؛ 3 mM) (انظر جدول المواد) حسب الحاجة لتحريض السعة ، ويمكن تعديل التركيزات لتجارب محددة. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن استخدام مستقبلات ستيرول بديلة بدلا من CD (على سبيل المثال ، ألبومين مصل الأبقار أو البروتينات الدهنية عالية الكثافة).</li>
	<li>باستخدام ملقط رفيع ، قم بإزالة أي نسيج بربخ من طبق جمع السباحة. انقل الوسط الذي يحتوي على المنوية إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مل ، وقم بطرد مركزي للتعليق عند 100 × جم لمدة 1 دقيقة في دوار دلو متأرجح في درجة حرارة الغرفة. باستخدام ماصة بلاستيكية ، قم بإزالة طافي MW الذي يحتوي على المنوية من أي حطام جسيم للأنسجة سيكون قد تم تكويره في هذه الخطوة.</li>
	<li>اجعل المادة الطافية MW التي تحتوي على المنوية إلى حجم إجمالي قدره 3 مل عن طريق إضافة MW عند 37 درجة مئوية. جهاز طرد مركزي عند 400 × جم لمدة 8 دقائق (في درجة حرارة الغرفة) في أنبوب مستدير القاع. قم بإزالة طافي MW ببطء من المنوية الحبيبية بشكل فضفاض.</li>
	<li>إذا كانت قابلة للحياة ، يجب أن تظهر المنوية على شكل حبيبات "رقيقة". أعد تعليق المنوية برفق عن طريق التثليج باستخدام ماصة نقل ذات تجويف كبير أو عن طريق صنابير يدوية لطيفة على الأنبوب ("تحريك الإصبع"). بمجرد إعادة تعليقها بالتساوي ، انقلها إلى أنبوب جديد مستدير القاع. استخدم 10-20 ميكرولتر من معلق المنوية لحساب وتقييم الحركة. تمييع المنوية في ميغاواط للاستخدام. ملاحظة: بالنسبة لمعظم التجارب التي تنطوي على سعة المنوية للفئران ، يتم استخدام تركيز نهائي من 5-10 مليون منوي / مل ميغاواط. لا يتطلب بروتوكول التصوير الموصوف هنا سعة المنوية ، على الرغم من أنه من الضروري أن تكتسب المنوية القدرة على الخضوع للإخراج القمي ذي الصلة من الناحية الفسيولوجية. يمكن للمرء أن يدرس الإخراج الخلوي المرضي أو الإخراج الخلوي الناجم عن الكواشف مثل أيونوفور الكالسيوم دون زيادة المنوية. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن للمرء استكشاف التغيرات المحتملة في الكالسيوم الأكروسومي في الخلايا غير السعوية استجابة للمحفزات المختلفة.</li>
	<li>استخدم المنوية في غضون 3-5 ساعات من جمعها ، مع الحفاظ على الوقت قصيرا قدر الإمكان ومتسقا بين التجارب التجريبية.</li>
	<li>قم بتنفيذ جميع خطوات التجميع والغسيل عند 37 درجة مئوية باستخدام وسط MW ، باستخدام طرق لتقليل تلف الغشاء. يتضمن ذلك استخدام ماصات نقل بلاستيكية كبيرة التجويف أو أطراف ماصة ذات فتحة كبيرة ، والتي يوصى باستخدامها خلال جميع مراحل الإجراء.</li>
</ol>2. بولي-D-ليسين طلاء من أطباق coverslip للتصوير
ملاحظة: يجب تحضير أطباق Poly-D-lysine (PDL) طازجة قبل كل تجربة.
<ol><li>قم بتوزيع قطرة 0.5 ميكرولتر من PDL (0.5 مجم / مل ، انظر جدول المواد) في وسط طبق الغطاء.</li>
	<li>باستخدام طرف مدرج 10 ميكرولتر ، قم بتلطيخ قطرة PDL عبر غطاء الغطاء (نمط متقاطع كما هو موضح في الشكل 1B).</li>
	<li>اتركيه حتى يجف على حرارة 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. احتفظ بالأطباق المطلية ب PDL مغطاة وعلى حرارة 37 درجة مئوية حتى الاستخدام.</li>
</ol>3. سحب الشعيرات الدموية ، تحميل للنفخ
<ol><li>اسحب الشعيرات الدموية الزجاجية البورسليكات (OD ، 2 مم ، معرف ، 1.56 مم ، انظر جدول المواد) باستخدام الإعدادات على النحو التالي - الحرارة: 330 ، السحب: 250 ، السرعة: 250 ، والوقت: 70. يجب تحسين هذه الخطوة للمجتذب المحدد المستخدم.</li>
	<li>قبل كل تجربة ، قم بتحميل شعيرات دموية واحدة بمحلول محفز يحتوي على 3-5x تركيز المنشط (لحساب الانتشار السريع للمحلول عند النفخ). قبل التعبئة ، استخدم ملاقط دقيقة لفتح الطرف الشعري عند حوالي 1-2 مم من النهاية. يجب أن ينتج عن ذلك قطر فتح ∼5 ميكرومتر. تلميع الحرارة غير مطلوب.</li>
	<li>باستخدام ماصة نقل بلاستيكية رقيقة ، قم بحقن المحلول المحفز ببطء في الشعيرات الدموية حتى يمتلئ ثلاثة أرباع طوله.</li>
	<li>قم بإزالة أي فقاعات هواء تشكلت أثناء التعبئة عن طريق النقر اللطيف للشعيرات الدموية.</li>
	<li>جبل الشعرية المملوءة على المناور الدقيق (انظر جدول المواد).</li>
</ol>4. إعداد تسليم التحفيز للنفخ
ملاحظة: لتقليل مخاطر إصابة المستخدم ، يجب ارتداء نظارات السلامة أثناء تشغيل إجراء النفخ.
<ol><li>قم بإعداد إعدادات نظام التسليم أحادي الخلية لتوفير نبضة 10 ثوان عند 5 رطل / بوصة مربعة.</li>
	<li>قم بتوصيل الشعيرات الدموية البورسليكات بحامل ماصة نظام التوصيل أحادي الخلية. تأكد من إحكام السداد.</li>
	<li>أثناء مراقبة الطرف الشعري ، ضع نفخة قصيرة من 2 ثانية عند 20 رطل لكل بوصة مربعة للتأكد من أن المحلول يتم الاستغناء عنه بالفعل من خلال نهاية الطرف (يجب أن يكون قطرة صغيرة واضحة في نهاية الطرف).</li>
</ol>5. الفحص المجهري والحصول على الصور
ملاحظة: تتوفر ماركات متعددة من المجاهر ويمكن استخدامها ؛ ومع ذلك ، فإن الحد الأدنى لمعدل الإطارات 3 إطارات / ثانية أمر مرغوب فيه. فيما يتعلق بدرجة الحرارة والتحكم البيئي ، يرجى ملاحظة أنه يجب تأكيد درجة الحرارة الفعلية للوسط في الطبق ، على سبيل المثال ، باستخدام مقياس حرارة بالأشعة تحت الحمراء غير متصل.
<ol><li>أضف 80 ميكرولتر من المنوية المخففة إلى مركز طبق غطاء 35 مم مطلي بمادة بولي دي لايسين. بالنسبة لمعظم التجارب التي تنطوي على سعة المنوية للفأر ، يتم استخدام تركيز نهائي من 5-10 مليون منوي / مل.</li>
	<li>أضف ببطء إلى المنوية 3 مل من الوسائط الأساسية الدافئة (37 درجة مئوية) MW المكملة ب 10 mM CaCl2. ملاحظة: يمكن للمرء إجراء تجارب في درجة حرارة الغرفة لإبطاء العمليات الخلوية ، ولكن من المهم ملاحظة أنه نظرا لأن السعة تتوسط في تبادل الدهون وسيولة المجالات الدقيقة والكلية ، يجب على المرء أن يضع في اعتباره أن السعة ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية و exocytosis acrosome هي عمليات تعتمد على درجة الحرارة.</li>
	<li>قم بتركيب الطبق مع المنوية على المجهر (مسخن مسبقا إلى 37 درجة مئوية).</li>
	<li>قم بإثارة GCaMP3 باستخدام خط ليزر 488 نانومتر وعرض باستخدام مرشح تمرير النطاق 505-550 نانومتر (BP). قم بإثارة mCherry باستخدام خط ليزر 555 نانومتر وعرض باستخدام مرشح ضغط الدم 575-615 نانومتر.</li>
	<li>باستخدام micromanipulator (يوصى بإرفاق المناور بطاولة الهواء التي تم إعداد المجهر عليها.) ، ضع طرف الشعيرات الدموية حوالي 100 ميكرومتر على الجانب و 5-10 ميكرومتر فوق مستوى الخلية المعنية. ملاحظة: تصنع المحاليل المحفزة عند 3-5 أضعاف التركيز الطبيعي للتعويض عن الانتشار السريع الذي يحدث في الحجم بين الشعيرات الدموية والخلية.</li>
	<li>ابدأ تسلسل التصوير على المجهر.</li>
	<li>صور خلايا المنوية بمعدل إطارات مرتفع ، ويفضل أن يكون >10 إطارات / ثانية. هنا ، تم استخدام ماسح ضوئي رنين يتيح التصوير بسرعة 33 مللي ثانية / إطار.</li>
	<li>بعد عشر ثوان من بدء التقاط الصورة على المجهر ، قم بتنشيط نظام توصيل الخلية الواحدة لبدء نفخة المنشطات لمدة 10 ثوان.</li>
	<li>خلايا الصورة لمدة 10-15 دقيقة.</li>
	<li>باستخدام نظام التوصيل أحادي الخلية ، قم بتصوير خلايا متعددة من طبق واحد وفقا للمواقع الموضحة في الشكل 1B. ملاحظة: يجب أن تظهر الحيوانات المنوية غير المعالجة / غير المحفزة تحت المجهر حمراء في الغالب ، مع كثافة منخفضة للإشارة الخضراء. يجب ربط رؤوس المنوية بغطاء الغطاء ، ويمكن التعرف على المنوية الحية من خلال ذيولها المتحركة. في المنوية التي تخضع ل AE ، ستزداد الإشارة الخضراء GCaMP3 في البداية ، وستختفي كل من إشارة mCherry الحمراء والإشارة الخضراء GCaMP3 إذا اكتملت AE ، كما هو موضح في الشكل 2. يوفر تقليل مضان mCherry مؤشرا أكثر تحديدا للوقت الذي يبدأ فيه AE لأن التغييرات في تركيزات Ca2+ ستؤدي باستمرار إلى تغييرات في شدة مضان GCaMP3.</li>
</ol>6. تحليل الصور والبيانات
ملاحظة: يتم إجراء تحليل الصور دون اتصال باستخدام ImageJ (انظر جدول المواد). في السابق ، تم الإبلاغ عن العديد من الخطوات الوسيطة في العملية المؤدية إلى AE ، بما في ذلك ارتفاع الكالسيوم الأكروسومي (ACR) ، والاندماج الكامل للغشاء. هذا الأخير يؤدي إلى فقدان مضان mCherry وبالتالي يمثل AE الكامل. في بعض الخلايا ، لوحظت إشارات مشابهة لأحداث القدم قبل الارتفاع (PSF) عند استخدام الأساليب الأمبيرومترية في دراسات الإخراج الخلوي (لمزيد من التفاصيل ، يرجى الاطلاععلى 2). تتوفر العديد من الطرق الاختيارية لتحليل بيانات AcroSensE الأولية لتحديد ACR و AE وخطواتها الوسيطة. فيما يلي وصف لبعض الطرق التحليلية الأساسية.
<ol><li>اعتمادا على امتداد ملف نظام المجهر المحدد ، استخدم أداة تقسيم القناة (Image > Colors > Split Channels) لإنشاء نوافذ فردية لقنوات GCaMP3 و mChere.</li>
	<li>قم بمزامنة النوافذ الفردية باستخدام أداة "مزامنة النافذة" (تحليل أدوات > > مزامنة Windows).</li>
	<li>حدد منطقة الاهتمام (ROI) حول رأس المنوي في القناة الحمراء لتشمل منطقة الجسم القمي (الشكل 3 أ ، ب). تسمح أداة المزامنة بتطبيق نفس تحديد المنطقة تلقائيا على القناة الخضراء ، حيث لا تزال المنوية خافتة جدا بحيث لا تكون مرئية.</li>
	<li>اختر المكون الإضافي "Z Profiler" (المكونات الإضافية > Stacks > Z Profiler) أو "محلل السلاسل الزمنية" (المكونات الإضافية > Stacks > Time Series Analyzer) لرسم التغيير في شدة التألق كدالة للإطارات / الوقت لكل من القناتين.</li>
	<li>انسخ البيانات إلى برنامج جدول بيانات (على سبيل المثال ، Microsoft Excel) للتخطيط والمزيد من التحليل. ملاحظة: بمجرد نسخ البيانات إلى جدول بيانات ، يمكن استخراج معلمات متعددة للتحليل ، بما في ذلك ما يلي ، كما هو موضح في الشكل 4.<ol><li>وقت بدء Fusion Pore (FP): قم بقياس الوقت من النقطة الزمنية 0 إلى النقطة الزمنية التي تبدأ فيها إشارة GCaMP3 في الارتفاع. تشير هذه المعلمة إلى التأخير بين التحفيز واستجابة المنوية ACR.</li>
		<li>وقت بدء AE: قم بقياس الوقت من النقطة الزمنية 0 إلى النقطة الزمنية التي تبدأ فيها إشارة mCherry في الاضمحلال. تشير هذه المعلمة إلى التأخير بين التحفيز واستجابة المنوية AE. يمكن أيضا استخدام هذه المعلمة لحساب التأخير بين تكوين FP واستجابة AE.</li>
		<li>سعة ذروة FP: قم بقياس إشارة التألق من القاعدة إلى ذروة ارتفاع إشارة GCaMP3. تشير هذه المعلمة إلى الزيادة الإجمالية في استجابة ACR.</li>
		<li>معدل فقدان mCherry: حدد هذه المعلمة من خلال ملاءمة خطية أو أسية على قسم فقدان إشارة mCherry (كما هو موضح ب "المنحدر" في الشكل 4B). ملاحظة: بدلا من ذلك، حدد معدل الاضمحلال بطريقة الإشارة المتبقية (R) في نقاط زمنية مختلفة (على سبيل المثال، R60: المدة الزمنية بالثواني إلى إشارة متبقية بنسبة 60٪ من خط الأساس لإشارة mCher). يمكن استخدام هذه المعلمة لتحديد المعدل الذي يتم به تشتيت المحتوى القمي على AE.</li>
		<li>انخفاض الإشارة لفقدان mChere: حدد الفرق في السعة بين شدة مضان mCherry الأساسية والإشارة التي تتبع AE. تشير هذه المعلمة إلى إجمالي كمية المحتوى الأكروسومي المشتت على AE.</li>
		<li>ارسم التغييرات في التألق (F) لكل من القنوات الحمراء والخضراء كبيانات أولية ، أو قم بتطبيعها بواسطة التألق الأولي (F0) والتعبير عنها ك ΔF / F0. يوفر الأخير تصورا أفضل للتغيرات في كل من الأحمر والأخضر على قطعة أرض واحدة (على سبيل المثال ، انظر الشكل 3D والشكل 3H). ملاحظة: أخيرا ، يمكن مقارنة المعلمات المقاسة المختلفة بين الظروف المختلفة لتحديد العلاقة بين التغيرات في تركيز الكالسيوم الأكروسومي و AE. للحصول على أمثلة لمقارنات الحالة التجريبية المختلفة ، انظر المرجع2.</li>
	</ol></li>
</ol>

الجمع بين التصوير ونظام توصيل المنشطات لدراسة المنوية للفأر الحي

<ol>
	<li>Austin, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Observations+on+the+penetration+of+the+sperm+in+the+mammalian+egg.">Observations on the penetration of the sperm in the mammalian egg.</a> Aust J Sci Res B. 4 (4), 581-596 (1951).</li><li>Cohen, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetically+targeted+sensor+reveals+spatial+and+temporal+dynamics+of+acrosomal+calcium+and+sperm+acrosome+exocytosis.">A genetically targeted sensor reveals spatial and temporal dynamics of acrosomal calcium and sperm acrosome exocytosis.</a> J Biol Chem. 298 (5), 101868 (2022).</li><li>Cohen, R., Mukai, C., Travis, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+regulation+of+acrosome+exocytosis.">Lipid regulation of acrosome exocytosis.</a> Adv Anat Embryol Cell Biol. 220, 107-127 (2016).</li><li>Harper, C. V., Cummerson, J. A., White, M. R., Publicover, S. J., Johnson, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+resolution+of+acrosomal+exocytosis+in+human+sperm.">Dynamic resolution of acrosomal exocytosis in human sperm.</a> J Cell Sci. 121, 2130-2135 (2008).</li><li>Sosa, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetics+of+human+sperm+acrosomal+exocytosis).">Kinetics of human sperm acrosomal exocytosis).</a> Mol Hum Reprod. 21 (3), 244-254 (2015).</li><li>Balestrini, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seeing+is+believing:+Current+methods+to+observe+sperm+acrosomal+exocytosis+in+real+time.">Seeing is believing: Current methods to observe sperm acrosomal exocytosis in real time.</a> Mol Reprod Dev. 87 (12), 1188-1198 (2020).</li><li>Nakanishi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+observation+of+acrosomal+dispersal+from+mouse+sperm+using+GFP+as+a+marker+protein.">Real-time observation of acrosomal dispersal from mouse sperm using GFP as a marker protein.</a> FEBS Lett. 449 (2-3), 277-283 (1999).</li><li>Kim, K. S., Gerton, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+release+of+soluble+and+matrix+components:+evidence+for+intermediate+states+of+secretion+during+spontaneous+acrosomal+exocytosis+in+mouse+sperm.">Differential release of soluble and matrix components: evidence for intermediate states of secretion during spontaneous acrosomal exocytosis in mouse sperm.</a> Dev Biol. 264 (1), 141-152 (2003).</li><li>Hasuwa, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+mouse+sperm+that+have+green+acrosome+and+red+mitochondria+allow+visualization+of+sperm+and+their+acrosome+reaction+in+vivo.">Transgenic mouse sperm that have green acrosome and red mitochondria allow visualization of sperm and their acrosome reaction in vivo.</a> Experimental animals / Japanese Association for Laboratory Animal Science. 59 (1), 105-107 (2010).</li><li>Henderson, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Low-Affinity+GCaMP3+Variant+(GCaMPer)+for+imaging+the+endoplasmic+reticulum+calcium+store.">A Low-Affinity GCaMP3 Variant (GCaMPer) for imaging the endoplasmic reticulum calcium store.</a> PloS one. 10 (10), 0139273 (2015).</li><li>Travis, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+relationships+between+capacitation-dependent+cell+signaling+and+compartmentalized+metabolic+pathways+in+murine+spermatozoa.">Functional relationships between capacitation-dependent cell signaling and compartmentalized metabolic pathways in murine spermatozoa.</a> J Biol Chem. 276 (10), 7630-7636 (2001).</li><li>Cohen, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+modulation+of+calcium+flux+through+CaV2.3+regulates+acrosome+exocytosis+and+fertilization.">Lipid modulation of calcium flux through CaV2.3 regulates acrosome exocytosis and fertilization.</a> Dev Cell. 28 (3), 310-321 (2014).</li><li>Sanchez-Cardenas, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acrosome+reaction+and+Ca(2)(+)+imaging+in+single+human+spermatozoa:+new+regulatory+roles+of+[Ca(2)(+)]i.">Acrosome reaction and Ca(2)(+) imaging in single human spermatozoa: new regulatory roles of [Ca(2)(+)]i.</a> Biol Reprod. 91 (2), 67 (2014).</li></ol>

لا يوجد لدى المؤلفين تضارب في المصالح للإبلاغ عن هذا العمل.

هنا ، يتم وصف طريقة قائمة على الفحص المجهري لاستخدام نموذج الماوس AcroSensE الذي تم إنشاؤه حديثا للمراقبة في الوقت الفعلي أحادي الخلية وتحليل التفاعل بين ديناميكيات الكالسيوم الأكروسومية والخطوات الوسيطة المؤدية إلى AE. جنبا إلى جنب مع الأساليب الجينية المتاحة بسهولة ، مثل التهجين مع النماذج...

تكتسب المنوية القدرة على الإخصاب أثناء عملية تسمى السعة1. إحدى نقاط النهاية لهذه العملية هي أن المنوية تكتسب القدرة على الخضوع ل AE. أكثر من عقدين من البيانات تدعم وجود نموذج معقد متعدد الخطوات من AE في المنوية للثدييات (ملخصة في2،3). ومع ذلك ، فإن دراسة AE في المنوية الحية أمر صعب ، والطرق المتاحة حاليا لمراقبة هذه العملية بدقة كافية مرهقة وتتطلب خطوات تحضير متعددة4 ، وتقتصر على اكتشاف الخطوة الأخيرة من AE (على سبيل المثال ، باستخدام PNA5) ، تقتصر على قياسات التغيرات في الكالسيوم الخلوي (على عكس ديناميكيات الكالسيوم الأكروسومي) ، أو تقتصر على قياسات ديناميات الكالسيوم الخلوية أو AE6.
للتغلب على بعض القيود الرئيسية لدراسات AE في الوقت الفعلي في ظل الظروف الفسيولوجية ولتمكين التحقيق في التفاعل بين ديناميكيات الكالسيوم و AE ، تم إنشاء نموذج فأر فريد. في نموذج الفأر هذا ، يتم التعبير عن بروتين اندماج يتكون من مستشعر Ca2+ المشفر وراثيا (GCaMP3) و mCherry واستهدافه إلى الجسيم القمي باستخدام محفز أكروسين وببتيد إشارة2. يتيح مستشعر GCaMP3-mCherry المزدوج المستهدف إجراء قياسات متزامنة في الوقت الفعلي لتركيزات الكالسيوم وحالة المحتويات القحمية في المنوية الحية في ظل الظروف الفسيولوجية باستخدام الفحص المجهري ونظام توصيل المنشطات أحادي الخلية (الشكل 1). كمكون من مكونات المصفوفة القمي، فإن الاندماج الغشائي و AE سيؤدي إلى فقدان مضان mCherry القابل للضوء وغير الحساس للأس الهيدروجيني من المنوية؛ حيث ينتشر هذا البروتين خارج حويصلة الجسيم القمي. في هذا الصدد ، فإن قدرة النموذج على عكس توقيت وحدوث AE تشبه فوائد خط الماوس GFP المستهدفللجسيم القمي 7،8،9.
يحتوي متغير GCaMP3 المستخدم في خط الماوس المعدل وراثيا هذا على دينار كويتي تقريبي يبلغ 400 ميكرومتر ونطاق ديناميكي ل Ca2+ من 10-4-10-3 M10 ، وهو مناسب لهذه الحويصلة. لقد أظهرنا أن هذا المزيج من ميزات GCaMP3 يمكن أن يكشف عن تكوين مسام الاندماج بين غشاء البلازما والغشاء الأكروسومي الخارجي (OAM) 2. إن اكتشاف مسام الاندماج هو نتيجة لكون حجم المسام صغيرا جدا بحيث لا يسمح لبروتين AcroSensE بالانتشار خارج الجسم القمي (عن طريق فقدان محتوى الجسيم القمي) مع توفير "قناة" غشائية تمكن من تدفق أيونات الكالسيوم2+ إلى تجويف الجسم القمي ، مما يؤدي إلى زيادة كثافة مضان GCaMP3.
يدعم البروتين الفلوري mCherry اللامع والأحادي وغير الحساس للكالسيوم تصور الجسيم القمي بينما تكون إشارة GCaMP3 باهتة (على سبيل المثال ، قبل ربط Ca2+ ، الشكل 2) ، والأهم من ذلك ، أنه يسمح أيضا بتحديد خلايا المنوية السليمة القمي المناسبة للتصوير.
يصف البروتوكول التالي استخدام نموذج الماوس AcroSensE الفريد وطرق الفحص المجهري المستخدمة تجريبيا لدراسة ديناميكيات الكالسيوم AE المنوية بدقة مكانية وزمانية عالية.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>100x oil objective&#160;</td>
			<td>Olympus Japan</td>
			<td>UPlanApo,</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-hydroxypropyl-b-cyclodextrin&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C0926</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm coverslip dish, 1.5 thickness</td>
			<td>MatTek Corp.&#160;</td>
			<td>P35G-1.5-20-C&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL round-bottomed tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate glass capilarries</td>
			<td>Sutter Instrument Co. CA USA</td>
			<td>B200-156-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C4901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Olympus Japan</td>
			<td>Olympus FluoView&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7528</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graduated tip&#160;</td>
			<td>TipOne, USA Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H7006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ&#160;</td>
			<td>National Institutes of Health</td>
			<td></td>
			<td>https://imagej.nih.gov/ij/plugins/index.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lactic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G5889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Live-Cell Microscope Incubation Systems&#160;</td>
			<td>TOKAI HIT Shizuoka, Japan</td>
			<td>Model STX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette Puller&#160;</td>
			<td>Sutter Instrument Co. CA USA</td>
			<td>Model P-97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S3014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S6297</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic transfer pipette&#160;</td>
			<td>FisherBrand&#160;</td>
			<td>13-711-6M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-lysine&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyruvic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>107360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single cell delivery system</td>
			<td>Parker, Hauppauge, NY</td>
			<td>Picospritzer III</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

real-time imaging of acrosomal calcium dynamics and exocytosis in live mouse sperm

الإخراج الخلوي القمي (AE) ، حيث تندمج الحويصلة الخارجية المفردة للحيوانات المنوية مع غشاء البلازما ، هي عملية معقدة تعتمد على الكالسيوم ضرورية للتخصيب. ومع ذلك ، فإن فهمنا لكيفية تنظيم إشارات الكالسيوم AE لا يزال غير مكتمل. على وجه الخصوص ، التفاعل بين ديناميكيات الكالسيوم داخل الأكروسوم والخطوات الوسيطة المؤدية إلى AE غير محدد جيدا. هنا ، نصف طريقة توفر رؤى مكانية وزمانية لديناميكيات الكالسيوم الأكروسومية وعلاقتها باندماج الغشاء والإخراج الخلوي اللاحق للحويصلة القمي. تستخدم الطريقة فأرا جديدا معدلا وراثيا يعبر عن مستشعر يستهدف Acrosome للإخراج الخلوي (AcroSensE). يجمع المستشعر بين مؤشر الكالسيوم المشفر وراثيا (GCaMP) المنصهر مع mCherry. تم تصميم بروتين الاندماج هذا خصيصا لتمكين المراقبة المتزامنة لديناميكيات الكالسيوم الأكروسومية وأحداث اندماج الغشاء. يتم تحقيق المراقبة في الوقت الفعلي لديناميكيات الكالسيوم الأكروسومية و AE في المنوية الحية AcroSensE باستخدام مزيج من التصوير بمعدل إطارات مرتفع ونظام توصيل المنشطات الذي يمكن أن يستهدف المنوية المفردة. يوفر هذا البروتوكول أيضا العديد من الأمثلة على الطرق الأساسية لتحديد وتحليل البيانات الأولية. نظرا لأن نموذج AcroSensE مشفر وراثيا ، يمكن زيادة أهميته العلمية باستخدام الأدوات الجينية المتاحة بسهولة ، مثل التهجين مع النماذج الجينية الأخرى للفئران أو الأساليب القائمة على تحرير الجينات (CRISPR). باستخدام هذه الاستراتيجية ، يمكن حل أدوار مسارات الإشارات الإضافية في سعة المنوية والإخصاب. باختصار ، توفر الطريقة الموضحة هنا أداة ملائمة وفعالة لدراسة ديناميكيات الكالسيوم في حجرة تحت خلوية محددة - الجسيم القمي للحيوانات المنوية - وكيف تنظم هذه الديناميات الخطوات الوسيطة التي تؤدي إلى اندماج الغشاء وكثرة الخلايا القمي.

Sperm acquire the ability to fertilize during a process called capacitation1. One endpoint of this process is that the sperm acquire the ability to undergo AE. Over two decades of data support the presence of a complex, multi-step model of AE in mammalian sperm (summarized in2,3). However, studying AE in live sperm is challenging, and currently available methods to monitor this process with adequate resolution are cumbersome and require multiple preparation steps4, are limited to the detection of the final step of AE (e.g., using PNA5), are limited to measurements of changes in cytosolic calcium (in contrast to acrosomal calcium dynamics), or are limited to measurements of either cytosolic calcium dynamics or AE6.
To overcome some of the key limitations of real-time AE studies under physiological conditions and to enable investigation of the interplay between calcium dynamics and AE, a unique mouse model was generated. In this mouse model, a fusion protein composed of the genetically encoded Ca2+-sensor (GCaMP3) and mCherry is expressed and targeted to the acrosome using an acrosin promoter and signaling peptide2. The targeted dual GCaMP3-mCherry sensor enables simultaneous real-time measurements of calcium concentrations and the status of the acrosomal contents in live sperm under physiological conditions using microscopy and a single-cell stimulant delivery system (Figure 1). As a component of the acrosomal matrix, membrane fusion, and AE would result in the loss of the photostable and pH-insensitive mCherry fluorescence from the sperm, as this protein diffuses out of the acrosome vesicle. In this regard, the model&#39;s ability to reflect the timing and occurrence of AE is akin to the benefits of the acrosome-targeted GFP mouse line7,8,9.
The GCaMP3 variant used in this transgenic mouse line has an approximate KD of 400 &#181;M and a dynamic range for Ca2+ of 10-4-10-3 M10, which is suitable for this vesicle. We showed that this combination of features of GCaMP3 could reveal fusion pore formation between the plasma membrane and the outer acrosomal membrane (OAM)2. The fusion pore detection is a result of the pore size being too small to allow the AcroSensE protein to disperse out of the acrosome (via loss of acrosome content) while providing a membrane &#34;channel&#34; that enables the influx of Ca2+ ions into the acrosome lumen, leading to an increase in fluorescence intensity of the GCaMP3.
The bright, monomeric, non-calcium-sensitive fluorescent protein mCherry supports visualization of the acrosome while the GCaMP3 signal is faint (e.g., prior to Ca2+ binding, Figure 2), and importantly, it also allows for the identification of acrosome-intact sperm cells suitable for imaging.
The following protocol describes the utilization of the unique AcroSensE mouse model and the methods for microscopy used experimentally to study AE and sperm calcium dynamics with high spatial and temporal resolution.

تسليط الضوء على المؤلف: تقنية تصوير الخلايا الحية لدراسة إشارات الكالسيوم وكثرة الخلايا القمية في المنوية للفأر 

التصوير في الوقت الحقيقي لديناميات الكالسيوم الأكروسومي والإخراج الخلوي في المنوية للفأر الحي

Our research goal is to better understand the molecular mechanisms that regulate sperm function, including the processes such as capacitation and fertilization. Specifically, we're exploring how membrane lipids activate calcium signaling and acrosome exocytosis. This protocol addresses the gap in our understanding of the interplay between capacitation, sperm activation, calcium signaling, and acrosome exocytosis.The advantages of this protocol include imaging sperm under physiological conditions, as well as its ability to simultaneously monitor both calcium signaling and acrosome exocytosis without the need for complicated preloading or standing procedures.

يقدم الشكل 2 توضيحا مبسطا يوضح تتابع التغيرات الفلورية المتوقعة بعد التحفيز الناجح للحيوانات المنوية. توضح اللوحة العلوية من الشكل 2 التغيرات في شدة مضان GCaMP3 ، حيث تكون الإشارة خافتة في البداية (تركيزات الكالسيوم الأكروسومية الأساسية أقل من GCaMP3 KD) ، وعند دخ...

Watch this Scientific Journal Video about A Live Cell Imaging Technique to Study Calcium Signaling and Acrosome Exocytosis in Mouse Sperm at JoVE.com

يوفر نموذج الفأر AcroSensE وطرق تصوير الخلايا الحية الموصوفة هنا نهجا جديدا لدراسة ديناميكيات الكالسيوم في المقصورة تحت الخلوية للحيوانات المنوية القمية وكيفية تنظيمها للخطوات الوسيطة التي تؤدي إلى اندماج الغشاء وكثرة الخلايا القمي.

Acrosome exocytosis (AE), in which the sperm&#39;s single exocytotic vesicle fuses with the plasma membrane, is a complex, calcium-dependent process ...

هدفنا البحثي هو فهم أفضل للآليات الجزيئية التي تنظم وظيفة المنوية ، بما في ذلك العمليات مثل السعة والإخصاب. على وجه التحديد ، نستكشف كيف تنشط الدهون الغشائية إشارات الكالسيوم والإخراج الخلوي القمي. يعالج هذا البروتوكول الفجوة في فهمنا للتفاعل بين السعة وتنشيط المنوية وإشارات الكالسيوم وكثرة الخلايا القمي.تشمل مزايا هذا البروتوكول تصوير المنوية في ظل الظروف الفسيولوجية ، فضلا عن قدرته على مراقبة كل من إشارات الكالسيوم و exocytosis في وقت واحد دون الحاجة إلى إجراءات التحميل المسبق أو الدائمة المعقدة.

real-time-imaging-acrosomal-calcium-dynamics-exocytosis-live-mouse

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Real-Time Imaging of Acrosomal Calcium Dynamics and Exocytosis in Live Mouse Sperm

686 Views.  Cornell University. هدفنا البحثي هو فهم أفضل للآليات الجزيئية التي تنظم وظيفة المنوية ، بما في ذلك العمليات مثل السعة والإخصاب. على وجه التحديد ، نستكشف كيف تنشط الدهون الغشائية إشارات الكالسيوم والإخراج الخلوي القمي. يعالج هذا البروتوكول الفجوة في فهمنا للتفاعل بين السعة وتنشيط المنوية وإش?...

Video: تسليط الضوء على المؤلف: تقنية تصوير الخلايا الحية لدراسة إشارات الكالسيوم وكثرة الخلايا القمية في المنوية للفأر 

Acrosome exocytosis (AE), in which the sperm&#39;s single exocytotic vesicle fuses with the plasma membrane, is a complex, calcium-dependent process essential for fertilization. However, our understanding of how calcium signaling regulates AE is still incomplete. In particular, the interplay between intra-acrosomal calcium dynamics and the intermediate steps leading to AE is not well-defined. Here, we describe a method that provides spatial and temporal insights into acrosomal calcium dynamics and their relationship to membrane fusion and subsequent exocytosis of the acrosome vesicle. The method utilizes a novel transgenic mouse expressing an Acrosome-targeted Sensor for Exocytosis (AcroSensE). The sensor combines a genetically encoded calcium indicator (GCaMP) fused with mCherry. This fusion protein was specifically designed to enable the concurrent observation of acrosomal calcium dynamics and membrane fusion events. Real-time monitoring of acrosomal calcium dynamics and AE in live AcroSensE sperm is achieved using a combination of high frame-rate imaging and a stimulant delivery system that can target single sperm. This protocol also provides several examples of basic methods to quantify and analyze the raw data. Because the AcroSensE model is genetically encoded, its scientific significance can be augmented by using readily available genetic tools, such as crossbreeding with other mouse genetic models or gene-editing (CRISPR) based methods. With this strategy, the roles of additional signaling pathways in sperm capacitation and fertilization can be resolved. In summary, the method described here provides a convenient and effective tool to study calcium dynamics in a specific subcellular compartment-the sperm acrosome-and how those dynamics regulate the intermediate steps leading to membrane fusion and acrosome exocytosis.

The AcroSensE mouse model and live cell imaging methods described here provide a new approach to studying calcium dynamics in the subcellular compartment of the sperm acrosome and how they regulate intermediate steps leading to membrane fusion and acrosome exocytosis.

Collection and Washing of Sperm from the AcroSensE Mouse Model for Real-Time Imaging

Begin by collecting sperm from the cota epididymus, isolated from a transgenic model mouse expressing AcroSensE. Perform the sperm collection in a 3.5 centimeter tissue culture dish containing 0.5 milliliters of MW medium by allowing a 15 minute swim out procedure at 37 degrees Celsius. Then using fine forceps, carefully remove any epididymal tissue from the swim out collection dish.Transfer the medium containing the sperm into a 15 milliliter conical tube and using a swinging bucket rotor centrifuge the suspension at 100 G for one minute at room temperature. With the help of a plastic pipette, collect the MW supernatant containing the sperm while discarding any pellet of gross tissue debris and transfer it to a round bottom tube. Adjust the supernatant volume to one milliliter by adding 500 microliters of MW medium prewarmed to 37 degrees Celsius.Centrifuge this mixture at 400 G for eight minutes at room temperature in a round bottom tube. Then carefully remove the supernatant while leaving behind the loosely pelleted sperm. Using a large bore transfer pipe, re-suspend the sperm by gently tapping the tube manually known as finger flicking.Once the sperm are evenly re-suspended, transfer them into a new round bottom tube.

جمع وغسل المنوية من نموذج الماوس AcroSensE للتصوير في الوقت الحقيقي

Setting up the Single Cell Stimulant Delivery System for Real-Time Monitoring of Live Mouse Sperm

To begin, pull borosilicate glass capillaries with an outer diameter of two millimeters and an inner diameter of 1.56 millimeters, following appropriate settings. Prior to filling the capillary before each experiment, use fine tweezers to break open the tip of the capillary. For loading the capillary, use the stimulating solution at three to five times the normal concentration of the stimulant required.With a thin plastic transfer pipette, slowly inject the stimulating solution into the capillary until 3/4 of its length is filled. Eliminate any air bubbles that may form during the filling process by gently flicking the capillary. Then, mount the filled capillary on the micromanipulator.Configure the single cell delivery system settings to provide a 10-second pulse at five psi. Connect the borosilicate capillary mounted on the micromanipulator to the single cell delivery system pipette holder. Apply a brief puff lasting two seconds at a pressure of 20 psi, while observing the capillary tip to confirm that the solution is being dispensed through the tip's end.The setup is now ready for use with microscopy for real-time imaging of a single mouse sperm.

إعداد نظام توصيل المنشطات أحادية الخلية للمراقبة في الوقت الحقيقي للحيوانات المنوية للفأر الحي

Combining Microscopy with a Stimulant Delivery System to Monitor Live Sperm from an AcroSensE Model Mouse

Begin by coating the 35-millimeter coverslip dishes with Poly-D-Lysine, or PDL. To do so, dispense a 0.5 microliter droplet of PDL at the center of a coverslip dish. Using a 10-microliter graduated pipette, smear the PDL droplet across the coverslip.Allow the coated coverslip dish to dry at 37 degrees Celsius for 10 minutes. For imaging the freshly collected sperm from a mouse model expressing AcroSensE, add 80 microliters of the prepared sperm suspension to the center of the PDL-coated coverslip dish. Then, slowly add three milliliters of supplemented, modified Whitten's base media pre-warmed to 37 degrees Celsius to the dish.Proceed to perform the imaging using a combination of a microscope with the single cell stimulant delivery setup. First, mount the dish containing the sperm on the microscope. Then, using the micromanipulator, position the capillary tip of the stimulant delivery system about 100 microns to the side and five to 10 microns above the plane of the cell of interest.Position the capillary within 100 microns from the sperm head. Next, start the imaging sequence on the microscope. Image sperm cells at a high frame rate, preferably greater than 10 frames per second.10 seconds after initiating the image acquisition, activate the single cell delivery system to deliver a 10-second puff of stimulant. Continue capturing images of cells for a duration of 10 to 15 minutes. In a similar manner, image multiple cells from a single dish according to the locations shown on the screen.