Questo lavoro è stato sostenuto dalle sovvenzioni R01-HD093827 e R03-HD090304 (A.J.T) del National Institutes of Health.

Tutte le procedure sugli animali sono state eseguite secondo le linee guida e approvate dall'Institutional Animal Care and Use Committee della Cornell University (#2002-0095). Per il presente studio sono stati utilizzati topi AcroSensE2 di 8-10 settimane. Le richieste di informazioni sulla disponibilità dei topi AcroSensE possono essere inoltrate all'autore corrispondente.
1. Raccolta e lavaggio degli spermatozoi
<ol><li>Raccogliere gli spermatozoi dell'epididimo della cauda (maggiori dettagli su questa procedura sono forniti in11) da topi AcroSensE. Lasciare la procedura di swim-out di 15 minuti in una piastra di coltura tissutale da 3,5 cm contenente 0,5 mL di terreno di Whitten modificato (MW) a 37 °C. La piastra deve essere coperta per ridurre l'evaporazione del MW e deve essere inclinata in modo che il mezzo abbia una profondità sufficiente per coprire la cauda epididimi. NOTA: Il terreno di Whitten modificato (MW) include 22 mM di HEPES, 1,2 mM di MgCl2, 100 mM di NaCl, 4,7 mM di KCl, 1 mM di acido piruvico, 4,8 mM di sale di acido lattico hemi-Ca2+ , pH 7,35. Il glucosio (5,5 mM), il NaHCO3 (10 mM) e la 2-idrossipropil--ciclodestrina (CD; 3 mM) sono integrati (vedi Tabella dei materiali) secondo necessità per l'induzione della capacitazione e le concentrazioni possono essere modificate per esperimenti specifici. Inoltre, accettori di steroli alternativi potrebbero essere utilizzati al posto della CD (ad esempio, albumina sierica bovina o lipoproteine ad alta densità).</li>
	<li>Utilizzando una pinza fine, rimuovere l'eventuale tessuto dell'epididimo dalla capsula di raccolta swim-out. Trasferire il terreno contenente lo sperma in una provetta conica da 15 mL e centrifugare la sospensione a 100 x g per 1 minuto in un rotore a secchiello oscillante a temperatura ambiente. Utilizzando una pipetta di plastica, rimuovere il surnatante MW contenente lo sperma da eventuali detriti di tessuto grossolano che si saranno pellettati in questa fase.</li>
	<li>Portare il surnatante MW contenente gli spermatozoi ad un volume totale di 3 mL aggiungendo MW a 37 °C. Centrifugare a 400 x g per 8 minuti (a temperatura ambiente) in una provetta a fondo tondo. Rimuovere lentamente il surnatante di MW dallo sperma debolmente pellettato.</li>
	<li>Se vitale, lo sperma dovrebbe apparire come una pallina dall'aspetto "soffice". Risospendere delicatamente lo sperma mediante triturazione con una pipetta di trasferimento di grande diametro o tramite delicati picchietti manuali sulla provetta ("finger flicking"). Una volta risospesi in modo uniforme, trasferirli in un nuovo tubo a fondo tondo. Utilizzare 10-20 μL di sospensione spermatica per contare e valutare la motilità. Diluire gli spermatozoi in MW per l'uso. NOTA: Per la maggior parte degli esperimenti che coinvolgono la capacitazione degli spermatozoi di topo, viene utilizzata una concentrazione finale di 5-10 milioni di spermatozoi/mL MW. Il protocollo di imaging qui descritto non richiede la capacitazione degli spermatozoi, sebbene sia necessario che gli spermatozoi acquisiscano la capacità di subire l'esocitosi dell'acrosoma fisiologicamente rilevante. Si potrebbe studiare l'esocitosi patologica o l'esocitosi indotta attraverso reagenti come uno ionoforo di calcio senza capacitare lo sperma. Inoltre, si potrebbero esplorare i potenziali cambiamenti nel calcio acrosomiale nelle cellule non capacitate in risposta a vari stimoli.</li>
	<li>Utilizzare gli spermatozoi entro 3-5 ore dal prelievo, mantenendo il tempo il più breve possibile e coerente tra le prove sperimentali.</li>
	<li>Eseguire tutte le fasi di raccolta e lavaggio a 37 °C utilizzando un mezzo MW, impiegando metodi per ridurre al minimo i danni alla membrana. Ciò include l'uso di pipette di trasferimento in plastica di grande diametro o puntali per pipette a orifizio largo, che sono raccomandati per l'uso durante tutte le fasi della procedura.</li>
</ol>2. Rivestimento in poli-D-lisina di piastre coprioggetti per imaging
NOTA: I piatti a base di poli-D-lisina (PDL) devono essere preparati freschi prima di ogni esperimento.
<ol><li>Erogare una gocciolina da 0,5 μL di PDL (0,5 mg/mL, vedere Tabella dei materiali) al centro di un vetrino coprioggetto.</li>
	<li>Utilizzando una punta graduata da 10 μL, spalmare la gocciolina PDL sul vetrino coprioggetto (schema incrociato come mostrato nella Figura 1B).</li>
	<li>Lasciare asciugare a 37 °C per 10 min. Tenere le stoviglie rivestite in PDL coperte e a 37 °C fino all'uso.</li>
</ol>3. Trazione capillare, caricamento per sbuffo
<ol><li>Tirare i capillari in vetro borosilicato (D.E., 2 mm, D.I., 1.56 mm, vedere la tabella dei materiali) utilizzando le seguenti impostazioni: Calore: 330, Tirare: 250, Velocità: 250 e Tempo: 70. Questo passaggio deve essere ottimizzato per l'estrattore specifico in uso.</li>
	<li>Prima di ogni esperimento, caricare un singolo capillare con la soluzione stimolante contenente 3-5 volte la concentrazione dello stimolante (per tenere conto della rapida diffusione della soluzione durante la boccata). Prima di riempire, utilizzare una pinzetta fine per aprire la punta capillare a circa 1-2 mm dall'estremità. Questo dovrebbe produrre un diametro di apertura di ∼5 μm. Non è necessaria la lucidatura a caldo.</li>
	<li>Utilizzando una sottile pipetta di trasferimento in plastica, iniettare lentamente la soluzione stimolante nel capillare fino a riempire i tre quarti della sua lunghezza.</li>
	<li>Rimuovere eventuali bolle d'aria formatesi durante il riempimento muovendo delicatamente il capillare.</li>
	<li>Montare il capillare riempito sul micromanipolatore (vedi Tabella dei materiali).</li>
</ol>4. Preparazione dell'erogazione della stimolazione per il soffio
NOTA: Per ridurre al minimo il rischio di lesioni all'utente, è necessario indossare occhiali di sicurezza durante l'operazione della procedura di sbuffo.
<ol><li>Impostare le impostazioni del sistema di erogazione a cella singola per fornire un impulso di 10 s a 5 psi.</li>
	<li>Collegare il capillare in borosilicato al portapipetta del sistema di erogazione a cella singola. Assicurarsi che le guarnizioni siano ermetiche.</li>
	<li>Osservando la punta capillare, applicare un breve soffio di 2 s a 20 psi per assicurarsi che la soluzione venga effettivamente erogata attraverso l'estremità della punta (una piccola goccia dovrebbe essere evidente all'estremità della punta).</li>
</ol>5. Microscopia e acquisizione di immagini
NOTA: Sono disponibili e possono essere utilizzati microscopi di diverse marche; Tuttavia, è auspicabile un frame rate minimo di 3 fotogrammi/s. Per quanto riguarda la temperatura e il controllo ambientale, si prega di notare che la temperatura effettiva del mezzo nel piatto deve essere confermata, ad esempio, utilizzando un termometro a infrarossi senza contatto.
<ol><li>Aggiungere 80 μL di spermatozoi diluiti al centro di un vetrino coprioggetti da 35 mm rivestito in poli-D-lisina. Per la maggior parte degli esperimenti che coinvolgono la capacitazione degli spermatozoi di topo, viene utilizzata una concentrazione finale di 5-10 milioni di spermatozoi/mL.</li>
	<li>Aggiungere lentamente allo sperma 3 mL di terreno di base caldo (37 °C) MW integrato con 10 mM di CaCl2. NOTA: Si potrebbero eseguire esperimenti a temperatura ambiente per rallentare i processi cellulari, ma è importante notare che, poiché la capacitazione è mediata dagli scambi lipidici e dalla fluidità dei micro e macro domini, è necessario tenere presente che la capacitazione fisiologicamente rilevante e l'esocitosi dell'acrosoma sono processi dipendenti dalla temperatura.</li>
	<li>Montare la capsula con lo sperma sul microscopio (preriscaldato a 37 °C).</li>
	<li>Eccita il GCaMP3 utilizzando una linea laser da 488 nm e visualizza con un filtro passa-banda (BP) da 505-550 nm. Eccita l'mCherry utilizzando una linea laser da 555 nm e visualizza con un filtro BP da 575-615 nm.</li>
	<li>Utilizzando un micromanipolatore (si consiglia di fissare il manipolatore al tavolo d'aria su cui è stato installato il microscopio), posizionare la punta del capillare a circa 100 μm di lato e 5-10 μm sopra il piano della cella di interesse. NOTA: Le soluzioni stimolanti sono prodotte a 3-5 volte la concentrazione normale per compensare la rapida diffusione che si verifica nel volume tra il capillare e la cellula.</li>
	<li>Avviare la sequenza di imaging al microscopio.</li>
	<li>Immagine di spermatozoi a una frequenza di fotogrammi elevata, preferibilmente >10 fotogrammi/s. In questo caso, è stato utilizzato uno scanner risonante che consente l'imaging a 33 ms/fotogramma.</li>
	<li>Dieci secondi dopo aver avviato l'acquisizione dell'immagine al microscopio, attivare il sistema di rilascio a cellula singola per avviare il soffio di 10 secondi di stimolante.</li>
	<li>Celle di immagine per una durata di 10-15 min.</li>
	<li>Utilizzando il sistema di somministrazione a cella singola, è possibile acquisire l'immagine di più cellule da una singola parabola in base alle posizioni fornite nella Figura 1B. NOTA: Gli spermatozoi non trattati/non stimolati al microscopio dovrebbero apparire per lo più rossi, con una bassa intensità del segnale verde. Le teste degli spermatozoi devono essere attaccate al vetrino coprioggetti e gli spermatozoi vivi possono essere identificati dalle loro code in movimento. Negli spermatozoi sottoposti a AE, il segnale verde GCaMP3 inizialmente aumenta e sia il segnale rosso mCherry che il segnale verde GCaMP3 scompaiono se l'AE è completa, come illustrato nella Figura 2. La riduzione della fluorescenza mCherry fornisce un indicatore più specifico del momento in cui inizia l'AE perché i cambiamenti nelle concentrazioni di Ca2+ causeranno continuamente cambiamenti nell'intensità della fluorescenza GCaMP3.</li>
</ol>6. Analisi delle immagini e dei dati
NOTA: L'analisi delle immagini offline viene eseguita utilizzando ImageJ (vedere Tabella dei materiali). In precedenza, sono stati riportati diversi passaggi intermedi nel processo che porta all'AE, tra cui l'aumento acrosomiale del calcio (ACR) e la fusione completa della membrana. Quest'ultimo porta alla perdita di fluorescenza mCherry e quindi rappresenta un AE completo. In alcune cellule, si osservano segnali simili agli eventi pre-spike foot (PSF) quando si utilizzano approcci amperometrici negli studi di esocitosi (per maggiori dettagli, vedere2). Sono disponibili diversi metodi opzionali per analizzare i dati grezzi di AcroSensE per quantificare ACR, AE e i relativi passaggi intermedi. Di seguito vengono descritti alcuni dei metodi analitici di base.
<ol><li>A seconda dell'estensione specifica del file di sistema del microscopio, utilizzare lo strumento Dividi canale (Immagine > Colori > Dividi canali) per generare finestre individuali per i canali GCaMP3 e mCherry.</li>
	<li>Sincronizza le singole finestre utilizzando lo strumento "Sincronizza finestra" (Analizza > Strumenti > Sincronizza finestre).</li>
	<li>Selezionare una regione di interesse (ROI) attorno alla testa dello spermatozoo nel canale rosso per includere la regione dell'acrosoma (Figura 3A,B). Lo strumento di sincronizzazione consente di applicare automaticamente la stessa selezione dell'area sul canale verde, in cui gli spermatozoi sono ancora troppo deboli per essere visibili.</li>
	<li>Scegli il plug-in "Z Profiler" (Plugins > Stacks > Z Profiler) o "Time Series Analyzer" (Plugins > Stacks > Time Series Analyzer) per tracciare la variazione dell'intensità della fluorescenza in funzione dei fotogrammi/tempo per ciascuno dei due canali.</li>
	<li>Copiare i dati in un software per fogli di calcolo (ad esempio, Microsoft Excel) per la creazione di grafici e ulteriori analisi. NOTA: una volta copiati i dati in un foglio di calcolo, è possibile estrarre più parametri per l'analisi, inclusi i seguenti, come illustrato nella Figura 4.<ol><li>Tempo di inizio del poro di fusione (FP): misura il tempo dal punto di tempo 0 al punto di tempo in cui il segnale GCaMP3 inizia a salire. Questo parametro indica il ritardo tra la stimolazione e la risposta ACR degli spermatozoi.</li>
		<li>Ora di inizio AE: misura il tempo dal punto di tempo 0 al punto di tempo in cui il segnale mCherry inizia a decadere. Questo parametro indica il ritardo tra la stimolazione e la risposta AE degli spermatozoi. Questo parametro potrebbe anche essere utilizzato per calcolare il ritardo tra la formazione di FP e la risposta AE.</li>
		<li>Ampiezza FP di picco: misura il segnale di fluorescenza dalla base al picco dell'aumento del segnale GCaMP3. Questo parametro indica l'aumento totale della risposta del Registro Azure Container.</li>
		<li>Tasso di perdita di mCherry: determinare questo parametro mediante un adattamento lineare o esponenziale sulla sezione della perdita di segnale di mCherry (come indicato da "pendenza" nella Figura 4B). NOTA: In alternativa, determinare il tasso di decadimento con il metodo del segnale residuo (R) in vari punti temporali (ad es. R60: tempo di durata in secondi a un segnale residuo del 60% dalla linea di base del segnale mCherry). Questo parametro può essere utilizzato per quantificare la velocità con cui il contenuto acrosomiale viene disperso durante l'AE.</li>
		<li>Diminuzione del segnale per la perdita di mCherry: determinare la differenza di ampiezza tra l'intensità di fluorescenza di mCherry al basale e il segnale successivo all'AE. Questo parametro indica la quantità totale di contenuto acrosomiale disperso su AE.</li>
		<li>Tracciare le variazioni di fluorescenza (F) per entrambi i canali rosso e verde come dati grezzi, oppure normalizzarle in base alla fluorescenza iniziale (F0) ed esprimerle come ΔF/F0. Quest'ultimo fornisce una migliore visualizzazione delle variazioni sia in rosso che in verde su un singolo grafico (ad esempio, vedere la Figura 3D e la Figura 3H). NOTA: Infine, i diversi parametri misurati possono essere confrontati tra diverse condizioni per determinare la relazione tra le variazioni della concentrazione acrosomiale di calcio e l'AE. Per esempi di vari confronti di condizioni sperimentali, vedere il riferimento2.</li>
	</ol></li>
</ol>

Combinazione dell'imaging con un sistema di somministrazione di stimolanti per studiare lo sperma di topo vivo

<ol>
	<li>Austin, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Observations+on+the+penetration+of+the+sperm+in+the+mammalian+egg.">Observations on the penetration of the sperm in the mammalian egg.</a> Aust J Sci Res B. 4 (4), 581-596 (1951).</li><li>Cohen, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetically+targeted+sensor+reveals+spatial+and+temporal+dynamics+of+acrosomal+calcium+and+sperm+acrosome+exocytosis.">A genetically targeted sensor reveals spatial and temporal dynamics of acrosomal calcium and sperm acrosome exocytosis.</a> J Biol Chem. 298 (5), 101868 (2022).</li><li>Cohen, R., Mukai, C., Travis, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+regulation+of+acrosome+exocytosis.">Lipid regulation of acrosome exocytosis.</a> Adv Anat Embryol Cell Biol. 220, 107-127 (2016).</li><li>Harper, C. V., Cummerson, J. A., White, M. R., Publicover, S. J., Johnson, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+resolution+of+acrosomal+exocytosis+in+human+sperm.">Dynamic resolution of acrosomal exocytosis in human sperm.</a> J Cell Sci. 121, 2130-2135 (2008).</li><li>Sosa, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetics+of+human+sperm+acrosomal+exocytosis).">Kinetics of human sperm acrosomal exocytosis).</a> Mol Hum Reprod. 21 (3), 244-254 (2015).</li><li>Balestrini, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seeing+is+believing:+Current+methods+to+observe+sperm+acrosomal+exocytosis+in+real+time.">Seeing is believing: Current methods to observe sperm acrosomal exocytosis in real time.</a> Mol Reprod Dev. 87 (12), 1188-1198 (2020).</li><li>Nakanishi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+observation+of+acrosomal+dispersal+from+mouse+sperm+using+GFP+as+a+marker+protein.">Real-time observation of acrosomal dispersal from mouse sperm using GFP as a marker protein.</a> FEBS Lett. 449 (2-3), 277-283 (1999).</li><li>Kim, K. S., Gerton, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+release+of+soluble+and+matrix+components:+evidence+for+intermediate+states+of+secretion+during+spontaneous+acrosomal+exocytosis+in+mouse+sperm.">Differential release of soluble and matrix components: evidence for intermediate states of secretion during spontaneous acrosomal exocytosis in mouse sperm.</a> Dev Biol. 264 (1), 141-152 (2003).</li><li>Hasuwa, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+mouse+sperm+that+have+green+acrosome+and+red+mitochondria+allow+visualization+of+sperm+and+their+acrosome+reaction+in+vivo.">Transgenic mouse sperm that have green acrosome and red mitochondria allow visualization of sperm and their acrosome reaction in vivo.</a> Experimental animals / Japanese Association for Laboratory Animal Science. 59 (1), 105-107 (2010).</li><li>Henderson, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Low-Affinity+GCaMP3+Variant+(GCaMPer)+for+imaging+the+endoplasmic+reticulum+calcium+store.">A Low-Affinity GCaMP3 Variant (GCaMPer) for imaging the endoplasmic reticulum calcium store.</a> PloS one. 10 (10), 0139273 (2015).</li><li>Travis, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+relationships+between+capacitation-dependent+cell+signaling+and+compartmentalized+metabolic+pathways+in+murine+spermatozoa.">Functional relationships between capacitation-dependent cell signaling and compartmentalized metabolic pathways in murine spermatozoa.</a> J Biol Chem. 276 (10), 7630-7636 (2001).</li><li>Cohen, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+modulation+of+calcium+flux+through+CaV2.3+regulates+acrosome+exocytosis+and+fertilization.">Lipid modulation of calcium flux through CaV2.3 regulates acrosome exocytosis and fertilization.</a> Dev Cell. 28 (3), 310-321 (2014).</li><li>Sanchez-Cardenas, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acrosome+reaction+and+Ca(2)(+)+imaging+in+single+human+spermatozoa:+new+regulatory+roles+of+[Ca(2)(+)]i.">Acrosome reaction and Ca(2)(+) imaging in single human spermatozoa: new regulatory roles of [Ca(2)(+)]i.</a> Biol Reprod. 91 (2), 67 (2014).</li></ol>

Nessun autore ha conflitti di interesse da segnalare in relazione a questo lavoro.

Qui, viene descritto un metodo basato sulla microscopia per utilizzare il modello murino AcroSensE appena generato per il monitoraggio in tempo reale di una singola cellula e l'analisi dell'interazione tra la dinamica del calcio acrosomiale e i passaggi intermedi che portano all'AE. Insieme ad approcci genetici prontamente disponibili, come l'incrocio con altri modelli genetici murini o l'editing genetico, questo modello e metodo forniscono un potente sistema per studiare il ruolo di vari componenti e percorsi che prendo...

Gli spermatozoi acquisiscono la capacità di fecondare durante un processo chiamato capacitazione1. Un endpoint di questo processo è che gli spermatozoi acquisiscono la capacità di sottoporsi a AE. Oltre due decenni di dati supportano la presenza di un modello complesso e multi-step di AE negli spermatozoi dei mammiferi (riassunto in 2,3). Tuttavia, lo studio dell'AE negli spermatozoi vivi è impegnativo e i metodi attualmente disponibili per monitorare questo processo con una risoluzione adeguata sono ingombranti e richiedono più fasi di preparazione4, sono limitati al rilevamento della fase finale dell'AE (ad esempio, utilizzando PNA5), sono limitati alle misurazioni dei cambiamenti nel calcio citosolico (in contrasto con la dinamica del calcio acrosomiale), o sono limitati alle misurazioni della dinamica del calcio citosolico o dell'AE6.
Per superare alcuni dei limiti chiave degli studi di eventi avversi in tempo reale in condizioni fisiologiche e per consentire lo studio dell'interazione tra la dinamica del calcio e l'evento avverso, è stato generato un modello murino unico. In questo modello murino, una proteina di fusione composta dal sensore Ca2+ geneticamente codificato (GCaMP3) e mCherry viene espressa e indirizzata all'acrosoma utilizzando un promotore dell'acrosina e un peptidedi segnalazione 2. Il doppio sensore GCaMP3-mCherry consente di misurare simultaneamente in tempo reale le concentrazioni di calcio e lo stato del contenuto acrosomiale negli spermatozoi vivi in condizioni fisiologiche utilizzando la microscopia e un sistema di somministrazione di stimolanti a singola cellula (Figura 1). Come componente della matrice acrosomiale, la fusione della membrana e l'AE comporterebbero la perdita della fluorescenza fotostabile e insensibile al pH mCherry dallo sperma, poiché questa proteina si diffonde fuori dalla vescicola acrosomiale. A questo proposito, la capacità del modello di riflettere la tempistica e l'occorrenza dell'AE è simile ai benefici della lineamurina GFP mirata all'acrosoma 7,8,9.
La variante GCaMP3 utilizzata in questa linea di topi transgenici ha un KD approssimativo di 400 μM e un intervallo dinamico per Ca2+ di 10-4-10-3 M10, che è adatto a questa vescicola. Abbiamo dimostrato che questa combinazione di caratteristiche di GCaMP3 potrebbe rivelare la formazione di pori di fusione tra la membrana plasmatica e la membrana acrosomiale esterna (OAM)2. Il rilevamento dei pori di fusione è il risultato del fatto che la dimensione dei pori è troppo piccola per consentire alla proteina AcroSensE di disperdersi fuori dall'acrosoma (attraverso la perdita di contenuto dell'acrosoma), fornendo al contempo un "canale" di membrana che consente l'afflusso di ioni Ca2+ nel lume dell'acrosoma, portando ad un aumento dell'intensità di fluorescenza del GCaMP3.
La proteina fluorescente mCherry, luminosa, monomerica e non sensibile al calcio, supporta la visualizzazione dell'acrosoma mentre il segnale GCaMP3 è debole (ad esempio, prima del legame con Ca2+ , Figura 2) e, soprattutto, consente anche l'identificazione di spermatozoi intatti dell'acrosoma adatti per l'imaging.
Il seguente protocollo descrive l'utilizzo dell'esclusivo modello murino AcroSensE e i metodi per la microscopia utilizzati sperimentalmente per studiare la dinamica degli eventi avversi e del calcio degli spermatozoi con un'elevata risoluzione spaziale e temporale.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>100x oil objective&#160;</td>
			<td>Olympus Japan</td>
			<td>UPlanApo,</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-hydroxypropyl-b-cyclodextrin&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C0926</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm coverslip dish, 1.5 thickness</td>
			<td>MatTek Corp.&#160;</td>
			<td>P35G-1.5-20-C&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL round-bottomed tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate glass capilarries</td>
			<td>Sutter Instrument Co. CA USA</td>
			<td>B200-156-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C4901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Olympus Japan</td>
			<td>Olympus FluoView&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7528</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graduated tip&#160;</td>
			<td>TipOne, USA Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H7006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ&#160;</td>
			<td>National Institutes of Health</td>
			<td></td>
			<td>https://imagej.nih.gov/ij/plugins/index.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lactic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G5889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Live-Cell Microscope Incubation Systems&#160;</td>
			<td>TOKAI HIT Shizuoka, Japan</td>
			<td>Model STX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette Puller&#160;</td>
			<td>Sutter Instrument Co. CA USA</td>
			<td>Model P-97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S3014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S6297</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic transfer pipette&#160;</td>
			<td>FisherBrand&#160;</td>
			<td>13-711-6M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-lysine&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyruvic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>107360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single cell delivery system</td>
			<td>Parker, Hauppauge, NY</td>
			<td>Picospritzer III</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

real-time imaging of acrosomal calcium dynamics and exocytosis in live mouse sperm

L'esocitosi acrosomica (AE), in cui la singola vescicola esocitotica dello spermatozoo si fonde con la membrana plasmatica, è un processo complesso e calcio-dipendente essenziale per la fecondazione. Tuttavia, la nostra comprensione di come la segnalazione del calcio regoli l'AE è ancora incompleta. In particolare, l'interazione tra la dinamica del calcio intra-acrosomiale e le fasi intermedie che portano all'AE non è ben definita. Qui, descriviamo un metodo che fornisce approfondimenti spaziali e temporali sulla dinamica del calcio acrosomiale e sulla loro relazione con la fusione di membrana e la successiva esocitosi della vescicola acrosomiale. Il metodo utilizza un nuovo topo transgenico che esprime un sensore per l'esocitosi mirato all'acrosoma (AcroSensE). Il sensore combina un indicatore di calcio geneticamente codificato (GCaMP) fuso con mCherry. Questa proteina di fusione è stata specificamente progettata per consentire l'osservazione simultanea della dinamica del calcio acrosomiale e degli eventi di fusione della membrana. Il monitoraggio in tempo reale della dinamica del calcio acrosomiale e dell'AE negli spermatozoi vivi AcroSensE si ottiene utilizzando una combinazione di imaging ad alta frequenza di fotogrammi e un sistema di somministrazione stimolante in grado di colpire singoli spermatozoi. Questo protocollo fornisce anche diversi esempi di metodi di base per quantificare e analizzare i dati grezzi. Poiché il modello AcroSensE è geneticamente codificato, il suo significato scientifico può essere aumentato utilizzando strumenti genetici prontamente disponibili, come l'incrocio con altri modelli genetici murini o metodi basati sull'editing genetico (CRISPR). Con questa strategia, è possibile risolvere il ruolo di ulteriori vie di segnalazione nella capacitazione e nella fecondazione degli spermatozoi. In sintesi, il metodo qui descritto fornisce uno strumento conveniente ed efficace per studiare la dinamica del calcio in uno specifico compartimento subcellulare - l'acrosoma spermatico - e come tali dinamiche regolano i passaggi intermedi che portano alla fusione della membrana e all'esocitosi dell'acrosoma.

Sperm acquire the ability to fertilize during a process called capacitation1. One endpoint of this process is that the sperm acquire the ability to undergo AE. Over two decades of data support the presence of a complex, multi-step model of AE in mammalian sperm (summarized in2,3). However, studying AE in live sperm is challenging, and currently available methods to monitor this process with adequate resolution are cumbersome and require multiple preparation steps4, are limited to the detection of the final step of AE (e.g., using PNA5), are limited to measurements of changes in cytosolic calcium (in contrast to acrosomal calcium dynamics), or are limited to measurements of either cytosolic calcium dynamics or AE6.
To overcome some of the key limitations of real-time AE studies under physiological conditions and to enable investigation of the interplay between calcium dynamics and AE, a unique mouse model was generated. In this mouse model, a fusion protein composed of the genetically encoded Ca2+-sensor (GCaMP3) and mCherry is expressed and targeted to the acrosome using an acrosin promoter and signaling peptide2. The targeted dual GCaMP3-mCherry sensor enables simultaneous real-time measurements of calcium concentrations and the status of the acrosomal contents in live sperm under physiological conditions using microscopy and a single-cell stimulant delivery system (Figure 1). As a component of the acrosomal matrix, membrane fusion, and AE would result in the loss of the photostable and pH-insensitive mCherry fluorescence from the sperm, as this protein diffuses out of the acrosome vesicle. In this regard, the model&#39;s ability to reflect the timing and occurrence of AE is akin to the benefits of the acrosome-targeted GFP mouse line7,8,9.
The GCaMP3 variant used in this transgenic mouse line has an approximate KD of 400 &#181;M and a dynamic range for Ca2+ of 10-4-10-3 M10, which is suitable for this vesicle. We showed that this combination of features of GCaMP3 could reveal fusion pore formation between the plasma membrane and the outer acrosomal membrane (OAM)2. The fusion pore detection is a result of the pore size being too small to allow the AcroSensE protein to disperse out of the acrosome (via loss of acrosome content) while providing a membrane &#34;channel&#34; that enables the influx of Ca2+ ions into the acrosome lumen, leading to an increase in fluorescence intensity of the GCaMP3.
The bright, monomeric, non-calcium-sensitive fluorescent protein mCherry supports visualization of the acrosome while the GCaMP3 signal is faint (e.g., prior to Ca2+ binding, Figure 2), and importantly, it also allows for the identification of acrosome-intact sperm cells suitable for imaging.
The following protocol describes the utilization of the unique AcroSensE mouse model and the methods for microscopy used experimentally to study AE and sperm calcium dynamics with high spatial and temporal resolution.

Autore in primo piano: una tecnica di imaging di cellule vive per studiare la segnalazione del calcio e l'esocitosi dell'acrosomia nello sperma di topo 

Imaging in tempo reale della dinamica del calcio acrosomiale e dell'esocitosi in spermatozoi di topo vivi

La Figura 2 fornisce un'illustrazione semplificata che mostra la sequenza di cambiamenti di fluorescenza previsti dopo la stimolazione riuscita degli spermatozoi. Il pannello superiore della Figura 2 illustra i cambiamenti nell'intensità della fluorescenza GCaMP3, dove il segnale è inizialmente debole (le concentrazioni di calcio acrosomiale al basale sono inferiori a GCaMP3 KD) e all'ingresso di ioni calcio attraverso i pori di fusione, la fluorescen...

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Il modello murino AcroSensE e i metodi di imaging di cellule vive qui descritti forniscono un nuovo approccio allo studio della dinamica del calcio nel compartimento subcellulare dell'acrosoma spermatico e di come regolano i passaggi intermedi che portano alla fusione della membrana e all'esocitosi dell'acrosoma.

Acrosome exocytosis (AE), in which the sperm&#39;s single exocytotic vesicle fuses with the plasma membrane, is a complex, calcium-dependent process ...

Il nostro obiettivo di ricerca è quello di comprendere meglio i meccanismi molecolari che regolano la funzione degli spermatozoi, compresi i processi come la capacitazione e la fecondazione. In particolare, stiamo esplorando il modo in cui i lipidi di membrana attivano la segnalazione del calcio e l'esocitosi dell'acrosoma. Questo protocollo affronta la lacuna nella nostra comprensione dell'interazione tra capacitazione, attivazione degli spermatozoi, segnalazione del calcio ed esocitosi dell'acrosoma.I vantaggi di questo protocollo includono l'imaging degli spermatozoi in condizioni fisiologiche, nonché la sua capacità di monitorare contemporaneamente sia la segnalazione del calcio che l'esocitosi dell'acrosoma senza la necessità di complicate procedure di precarico o in piedi.

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Real-Time Imaging of Acrosomal Calcium Dynamics and Exocytosis in Live Mouse Sperm

718 Views.  Cornell University. Il nostro obiettivo di ricerca è quello di comprendere meglio i meccanismi molecolari che regolano la funzione degli spermatozoi, compresi i processi come la capacitazione e la fecondazione. In particolare, stiamo esplorando il modo in cui i lipidi di membrana attivano la segnalazione del calcio e l'esocitosi dell'acrosoma. Questo protocollo affronta la lacuna nella nostra comprensione dell'interazione tra capacitazione, attivazione degli spermatozoi, segnalazione del calcio ed esocitosi del...

Video: Autore in primo piano: una tecnica di imaging di cellule vive per studiare la segnalazione del calcio e l'esocitosi dell'acrosomia nello sperma di topo 

Acrosome exocytosis (AE), in which the sperm&#39;s single exocytotic vesicle fuses with the plasma membrane, is a complex, calcium-dependent process essential for fertilization. However, our understanding of how calcium signaling regulates AE is still incomplete. In particular, the interplay between intra-acrosomal calcium dynamics and the intermediate steps leading to AE is not well-defined. Here, we describe a method that provides spatial and temporal insights into acrosomal calcium dynamics and their relationship to membrane fusion and subsequent exocytosis of the acrosome vesicle. The method utilizes a novel transgenic mouse expressing an Acrosome-targeted Sensor for Exocytosis (AcroSensE). The sensor combines a genetically encoded calcium indicator (GCaMP) fused with mCherry. This fusion protein was specifically designed to enable the concurrent observation of acrosomal calcium dynamics and membrane fusion events. Real-time monitoring of acrosomal calcium dynamics and AE in live AcroSensE sperm is achieved using a combination of high frame-rate imaging and a stimulant delivery system that can target single sperm. This protocol also provides several examples of basic methods to quantify and analyze the raw data. Because the AcroSensE model is genetically encoded, its scientific significance can be augmented by using readily available genetic tools, such as crossbreeding with other mouse genetic models or gene-editing (CRISPR) based methods. With this strategy, the roles of additional signaling pathways in sperm capacitation and fertilization can be resolved. In summary, the method described here provides a convenient and effective tool to study calcium dynamics in a specific subcellular compartment-the sperm acrosome-and how those dynamics regulate the intermediate steps leading to membrane fusion and acrosome exocytosis.

The AcroSensE mouse model and live cell imaging methods described here provide a new approach to studying calcium dynamics in the subcellular compartment of the sperm acrosome and how they regulate intermediate steps leading to membrane fusion and acrosome exocytosis.