Diese Arbeit wurde durch die National Institutes of Health Grants R01-HD093827 und R03-HD090304 (A.J.T.) unterstützt.

Alle Tierbehandlungen wurden gemäß den Richtlinien durchgeführt und vom Institutional Animal Care and Use Committee der Cornell University genehmigt (#2002-0095). Für die vorliegende Studie wurden 8-10 Wochen alte AcroSensE-Mäuse2 verwendet. Anfragen zur Verfügbarkeit der AcroSensE-Mäuse können an den korrespondierenden Autor gerichtet werden.
1. Samenentnahme und -wäsche
<ol><li>Entnahme von Cauda-Nebenhodenspermien (weitere Details zu diesem Verfahren finden Sie inAbschnitt 11) von AcroSensE-Mäusen. 15 Minuten in einer 3,5 cm großen Gewebekulturschale mit 0,5 ml modifiziertem Whitten-Medium (MW) bei 37 °C einschwimmen lassen. Die Schale sollte abgedeckt werden, um die Verdunstung des MW zu reduzieren, und so gekippt werden, dass das Medium genügend Tiefe hat, um die Cauda-Nebenhoden zu bedecken. ANMERKUNG: Modifiziertes Whitten-Medium (MW) enthält 22 mM HEPES, 1,2 mM MgCl2, 100 mM NaCl, 4,7 mM KCl, 1 mM Brenztraubensäure, 4,8 mM Milchsäure-Hemi-Ca2+ -Salz, pH 7,35. Glucose (5,5 mM), NaHCO3 (10 mM) und 2-Hydroxypropyl--cyclodextrin (CD; 3 mM) werden nach Bedarf für die Induktion der Kapazität ergänzt (siehe Materialtabelle), und die Konzentrationen können für spezifische Experimente modifiziert werden. Darüber hinaus könnten anstelle von CD alternative Sterolakzeptoren verwendet werden (z. B. Rinderserumalbumin oder Lipoproteine hoher Dichte).</li>
	<li>Entfernen Sie mit einer feinen Pinzette jegliches Nebenhodengewebe aus der Auffangschale. Das Medium, das das Sperma enthält, wird in ein konisches 15-ml-Röhrchen überführt und die Suspension bei 100 x g für 1 Minute in einem schwingenden Rotor bei Raumtemperatur zentrifugiert. Entfernen Sie mit einer Plastikpipette den MW-Überstand, der das Sperma enthält, aus allen groben Gewebetrümmern, die bei diesem Schritt pelletiert wurden.</li>
	<li>Bringen Sie den MW-Überstand, der die Spermien enthält, durch Zugabe von MW bei 37 °C auf ein Gesamtvolumen von 3 ml. Bei 400 x g für 8 min (bei Raumtemperatur) in einem Röhrchen mit rundem Boden zentrifugieren. Entfernen Sie langsam den MW-Überstand aus dem lose pelletierten Sperma.</li>
	<li>Wenn es lebensfähig ist, sollte das Sperma als "flauschiges" aussehendes Kügelchen erscheinen. Resuspendieren Sie die Spermien vorsichtig durch Reiben mit einer Transferpipette mit großer Bohrung oder durch sanftes manuelles Klopfen auf den Eileiter ("Fingerschnippen"). Sobald sie gleichmäßig wieder aufgehängt sind, geben Sie sie in ein neues Rundbodenröhrchen. Verwenden Sie 10-20 μl der Spermiensuspension, um die Beweglichkeit zu zählen und zu beurteilen. Verdünnen Sie das Sperma für die Verwendung in MW. HINWEIS: Für die meisten Experimente, bei denen die Spermienkapazität von Mäusen verwendet wird, wird eine Endkonzentration von 5-10 Millionen Spermien/ml MW verwendet. Das hier beschriebene Bildgebungsprotokoll erfordert keine Kapazitation von Spermien, obwohl es notwendig ist, dass die Spermien die Fähigkeit erwerben, eine physiologisch relevante Akrosomen-Exozytose zu durchlaufen. Man könnte pathologische Exozytose oder Exozytose untersuchen, die durch Reagenzien wie einen Kalziumionophor induziert wird, ohne die Spermien zu kapazitivieren. Darüber hinaus könnte man mögliche Veränderungen des akrosomalen Kalziums in nicht-kapazitierten Zellen als Reaktion auf verschiedene Stimuli untersuchen.</li>
	<li>Verwenden Sie das Sperma innerhalb von 3-5 Stunden nach der Entnahme und halten Sie die Zeit so kurz wie möglich und konsistent zwischen den experimentellen Versuchen.</li>
	<li>Führen Sie alle Schritte des Sammelns und Waschens bei 37 °C unter Verwendung von MW-Medium durch und verwenden Sie Methoden zur Minimierung von Membranschäden. Dazu gehört die Verwendung von Kunststoff-Transferpipetten mit großem Durchmesser oder Pipettenspitzen mit großer Öffnung, die für den Einsatz in allen Phasen des Verfahrens empfohlen werden.</li>
</ol>2. Poly-D-Lysin-Beschichtung von Deckglasschalen für die Bildgebung
HINWEIS: Poly-D-Lysin (PDL)-Gerichte sollten vor jedem Experiment frisch zubereitet werden.
<ol><li>Geben Sie einen 0,5-μl-Tropfen PDL (0,5 mg/ml, siehe Materialtabelle) in die Mitte einer Deckglasschale.</li>
	<li>Schmieren Sie den PDL-Tropfen mit einer 10-μl-Messspitze über das Deckglas (kreuz und quer, wie in Abbildung 1B gezeigt).</li>
	<li>10 Min. bei 37 °C trocknen lassen. PDL-beschichtetes Geschirr bis zur Verwendung abgedeckt bei 37 °C aufbewahren.</li>
</ol>3. Kapillarziehen, Laden zum Puffen
<ol><li>Ziehen Sie die Kapillaren aus Borosilikatglas (Außendurchmesser, 2 mm, Innendurchmesser, 1,56 mm, siehe Materialtabelle) mit den folgenden Einstellungen: Wärme: 330, Zug: 250, Geschwindigkeit: 250 und Zeit: 70. Dieser Schritt sollte für den jeweiligen verwendeten Abzieher optimiert werden.</li>
	<li>Beladen Sie vor jedem Experiment eine einzelne Kapillare mit der stimulierenden Lösung, die die 3-5-fache Konzentration des Stimulans enthält (um die schnelle Diffusion der Lösung beim Aufblasen zu berücksichtigen). Vor dem Befüllen mit einer feinen Pinzette die Kapillarspitze ca. 1-2 mm vom Ende entfernt aufbrechen. Dadurch sollte ein Öffnungsdurchmesser von ∼5 μm entstehen. Ein Hitzepolieren ist nicht erforderlich.</li>
	<li>Injizieren Sie die stimulierende Lösung mit einer dünnen Kunststoff-Transferpipette langsam in die Kapillare, bis drei Viertel ihrer Länge voll sind.</li>
	<li>Entfernen Sie alle Luftblasen, die sich beim Befüllen gebildet haben, indem Sie die Kapillare vorsichtig anschnippen.</li>
	<li>Montieren Sie die gefüllte Kapillare auf dem Mikromanipulator (siehe Materialtabelle).</li>
</ol>4. Vorbereitung der Verabreichung der Stimulation zum Puffen
HINWEIS: Um das Verletzungsrisiko des Benutzers zu minimieren, sollte während des Vorgangs eine Schutzbrille getragen werden.
<ol><li>Richten Sie die Einstellungen des Einzelzellen-Verabreichungssystems so ein, dass ein 10-Sekunden-Impuls bei 5 psi bereitgestellt wird.</li>
	<li>Verbinden Sie die Borosilikatkapillare mit dem Pipettenhalter des Einzelzell-Verabreichungssystems. Stellen Sie sicher, dass die Dichtungen fest sind.</li>
	<li>Während Sie die Kapillarspitze beobachten, wenden Sie einen kurzen Zug von 2 s bei 20 psi an, um sicherzustellen, dass die Lösung tatsächlich durch das Ende der Spitze abgegeben wird (ein kleiner Tropfen sollte am Ende der Spitze sichtbar sein).</li>
</ol>5. Mikroskopie und Bildaufnahme
HINWEIS: Mikroskope verschiedener Marken sind erhältlich und können verwendet werden. Eine Mindestbildrate von 3 Bildern/s ist jedoch wünschenswert. Bei der Temperatur- und Umgebungskontrolle ist zu beachten, dass die tatsächliche Temperatur des Mediums in der Schale z.B. mit einem berührungslosen Infrarot-Thermometer bestätigt werden sollte.
<ol><li>Geben Sie 80 μl verdünntes Sperma in die Mitte einer mit Poly-D-Lysin beschichteten 35-mm-Deckglasschale. Für die meisten Experimente, bei denen die Spermienkapazität von Mäusen verwendet wird, wird eine Endkonzentration von 5-10 Millionen Spermien/ml verwendet.</li>
	<li>Dem Sperma langsam 3 ml warmes (37 °C) MW-Basismedium mit 10 mM CaCl2 hinzufügen. ANMERKUNG: Man könnte Experimente bei Raumtemperatur durchführen, um zelluläre Prozesse zu verlangsamen, aber es ist wichtig zu beachten, dass man bedenken muss, dass physiologisch relevante Kapazitation und Akrosomen-Exozytose temperaturabhängige Prozesse sind, da die Kapazität durch den Lipidaustausch und die Fluidität von Mikro- und Makrodomänen vermittelt wird.</li>
	<li>Montieren Sie die Schale mit dem Sperma auf das Mikroskop (vorgeheizt auf 37 °C).</li>
	<li>Der GCaMP3 wird mit einer 488-nm-Laserlinie angeregt und mit einem 505-550-nm-Bandpassfilter (BP) betrachtet. Stimulieren Sie die mCherry mit einer 555-nm-Laserlinie an und betrachten Sie sie mit einem 575-615-nm-BP-Filter.</li>
	<li>Mit einem Mikromanipulator (es wird empfohlen, den Manipulator an dem Lufttisch zu befestigen, auf dem das Mikroskop aufgestellt wurde) positionieren Sie die Spitze der Kapillare etwa 100 μm seitlich und 5-10 μm über der Ebene der interessierenden Zelle. HINWEIS: Die stimulierenden Lösungen werden mit dem 3-5-fachen der normalen Konzentration hergestellt, um die schnelle Diffusion im Volumen zwischen der Kapillare und der Zelle auszugleichen.</li>
	<li>Starten Sie die Bildgebungssequenz auf dem Mikroskop.</li>
	<li>Bilden Sie Samenzellen mit einer hohen Bildrate ab, vorzugsweise >10 Bilder/s. Hier wurde ein Resonanzscanner verwendet, der eine Bildgebung mit 33 ms/Bild ermöglicht.</li>
	<li>Zehn Sekunden nach Beginn der Bildaufnahme am Mikroskop aktivieren Sie das Einzelzell-Abgabesystem, um den 10-Sekunden-Stimulansstoß einzuleiten.</li>
	<li>Bildzellen für eine Dauer von 10-15 Minuten.</li>
	<li>Mit dem Einzelzellen-Verabreichungssystem können Sie mehrere Zellen aus einer einzigen Schale gemäß den in Abbildung 1B angegebenen Positionen abbilden. HINWEIS: Unbehandelte/nicht stimulierte Spermien sollten unter dem Mikroskop überwiegend rot erscheinen, mit einer geringen Intensität des grünen Signals. Die Spermienköpfe sollten am Deckglas befestigt werden, und lebende Spermien können an ihren sich bewegenden Schwänzen identifiziert werden. Bei Spermien, die AE durchlaufen, nimmt das grüne Signal von GCaMP3 zunächst zu, und sowohl das rote mCherry-Signal als auch das grüne Signal von GCaMP3 verschwinden, wenn die AE abgeschlossen ist, wie in Abbildung 2 dargestellt. Die Reduktion der mCherry-Fluoreszenz liefert einen spezifischeren Indikator für den Zeitpunkt, zu dem die AE beginnt, da Änderungen der Ca2+ -Konzentrationen kontinuierlich zu Änderungen der GCaMP3-Fluoreszenzintensität führen.</li>
</ol>6. Bild- und Datenanalyse
HINWEIS: Die Offline-Bildanalyse wird mit ImageJ durchgeführt (siehe Materialtabelle). Zuvor wurden mehrere Zwischenschritte im Prozess beschrieben, die zu AE führen, einschließlich des akrosomalen Kalziumanstiegs (ACR) und der vollständigen Membranfusion. Letzteres führt zum Verlust der mCherry-Fluoreszenz und stellt somit eine vollständige AE dar. In einigen Zellen werden Signale beobachtet, die den Pre-Spike Foot Events (PSF) ähneln, wenn amperometrische Ansätze in Studien zur Exozytose verwendet werden (weitere Details finden Sie unter2). Für die Analyse der AcroSensE-Rohdaten stehen mehrere optionale Methoden zur Verfügung, um ACR, AE und ihre Zwischenschritte zu quantifizieren. Im Folgenden werden einige der grundlegenden Analysemethoden beschrieben.
<ol><li>Abhängig von der jeweiligen Dateierweiterung des Mikroskopsystems können Sie mit dem Split-Channel-Tool (Image > Colors > Split Channels) individuelle Fenster für die GCaMP3- und mCherry-Kanäle generieren.</li>
	<li>Synchronisieren Sie die einzelnen Fenster mit dem Tool "Fenster synchronisieren" (Analyze > Tools > Synchronize Windows).</li>
	<li>Wählen Sie eine Region of Interest (ROI) um den Spermienkopf im roten Kanal aus, um die Akrosomregion einzubeziehen (Abbildung 3A,B). Mit dem Synchronize-Tool kann die gleiche Bereichsauswahl automatisch auf den grünen Kanal angewendet werden, in dem die Spermien noch zu dunkel sind, um sichtbar zu sein.</li>
	<li>Wählen Sie das Plugin "Z Profiler" (Plugins > Stacks > Z Profiler) oder "Time Series Analyzer" (Plug-ins > Stacks > Time Series Analyzer), um die Änderung der Fluoreszenzintensität als Funktion von Frames/Zeit für jeden der beiden Kanäle darzustellen.</li>
	<li>Kopieren Sie Daten in eine Tabellenkalkulationssoftware (z. B. Microsoft Excel), um sie zu zeichnen und weiter zu analysieren. HINWEIS: Nachdem die Daten in eine Tabelle kopiert wurden, können mehrere Parameter für die Analyse extrahiert werden, einschließlich der folgenden, wie in Abbildung 4 dargestellt.<ol><li>Startzeit der Fusionspore (FP): Messen Sie die Zeit vom Zeitpunkt 0 bis zu dem Zeitpunkt, an dem das GCaMP3-Signal zu steigen beginnt. Dieser Parameter gibt die Verzögerung zwischen der Stimulation und der ACR-Antwort der Spermien an.</li>
		<li>AE-Startzeit: Messen Sie die Zeit vom Zeitpunkt 0 bis zu dem Zeitpunkt, an dem das mCherry-Signal abzuklingen beginnt. Dieser Parameter gibt die Verzögerung zwischen der Stimulation und der AE-Reaktion der Spermien an. Dieser Parameter könnte auch verwendet werden, um die Verzögerung zwischen FP-Bildung und AE-Antwort zu berechnen.</li>
		<li>Peak-FP-Amplitude: Messen Sie das Fluoreszenzsignal von der Basis bis zum Peak des GCaMP3-Signalanstiegs. Dieser Parameter gibt den Gesamtanstieg der ACR-Antwort an.</li>
		<li>Verlustrate von mCherry: Bestimmen Sie diesen Parameter durch eine lineare oder exponentielle Anpassung an den Abschnitt des mCherry-Signalverlusts (wie in Abbildung 4B durch "Steigung" angegeben). HINWEIS: Alternativ können Sie die Abklingrate mit der Restsignalmethode (R) zu verschiedenen Zeitpunkten bestimmen (z. B. R60: Dauer in Sekunden bis zu einem Restsignal von 60 % von der Basislinie des mCherry-Signals). Dieser Parameter kann verwendet werden, um die Rate zu quantifizieren, mit der der akrosomale Inhalt bei AE dispergiert wird.</li>
		<li>Signalabnahme für mCherry-Verlust: Bestimmen Sie die Amplitudendifferenz zwischen der mCherry-Fluoreszenzintensität und dem Signal nach AE. Dieser Parameter gibt die Gesamtmenge des akrosomalen Inhalts an, der bei AE dispergiert ist.</li>
		<li>Zeichnen Sie die Änderungen der Fluoreszenz (F) sowohl für den roten als auch für den grünen Kanal als Rohdaten auf oder normalisieren Sie sie durch die anfängliche Fluoreszenz (F0) und drücken Sie sie als ΔF/F0 aus. Letzteres ermöglicht eine bessere Visualisierung der Änderungen von Rot und Grün in einem einzigen Diagramm (siehe z. B. Abbildung 3D und Abbildung 3H). HINWEIS: Schließlich können die verschiedenen gemessenen Parameter zwischen verschiedenen Bedingungen verglichen werden, um die Beziehung zwischen Änderungen der akrosomalen Kalziumkonzentration und AE zu bestimmen. Beispiele für verschiedene experimentelle Zustandsvergleiche finden Sie in Referenz2.</li>
	</ol></li>
</ol>

Kombination von Bildgebung mit einem Stimulanzien-Verabreichungssystem zur Untersuchung lebender Mausspermien

<ol>
	<li>Austin, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Observations+on+the+penetration+of+the+sperm+in+the+mammalian+egg.">Observations on the penetration of the sperm in the mammalian egg.</a> Aust J Sci Res B. 4 (4), 581-596 (1951).</li><li>Cohen, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetically+targeted+sensor+reveals+spatial+and+temporal+dynamics+of+acrosomal+calcium+and+sperm+acrosome+exocytosis.">A genetically targeted sensor reveals spatial and temporal dynamics of acrosomal calcium and sperm acrosome exocytosis.</a> J Biol Chem. 298 (5), 101868 (2022).</li><li>Cohen, R., Mukai, C., Travis, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+regulation+of+acrosome+exocytosis.">Lipid regulation of acrosome exocytosis.</a> Adv Anat Embryol Cell Biol. 220, 107-127 (2016).</li><li>Harper, C. V., Cummerson, J. A., White, M. R., Publicover, S. J., Johnson, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+resolution+of+acrosomal+exocytosis+in+human+sperm.">Dynamic resolution of acrosomal exocytosis in human sperm.</a> J Cell Sci. 121, 2130-2135 (2008).</li><li>Sosa, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetics+of+human+sperm+acrosomal+exocytosis).">Kinetics of human sperm acrosomal exocytosis).</a> Mol Hum Reprod. 21 (3), 244-254 (2015).</li><li>Balestrini, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seeing+is+believing:+Current+methods+to+observe+sperm+acrosomal+exocytosis+in+real+time.">Seeing is believing: Current methods to observe sperm acrosomal exocytosis in real time.</a> Mol Reprod Dev. 87 (12), 1188-1198 (2020).</li><li>Nakanishi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+observation+of+acrosomal+dispersal+from+mouse+sperm+using+GFP+as+a+marker+protein.">Real-time observation of acrosomal dispersal from mouse sperm using GFP as a marker protein.</a> FEBS Lett. 449 (2-3), 277-283 (1999).</li><li>Kim, K. S., Gerton, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+release+of+soluble+and+matrix+components:+evidence+for+intermediate+states+of+secretion+during+spontaneous+acrosomal+exocytosis+in+mouse+sperm.">Differential release of soluble and matrix components: evidence for intermediate states of secretion during spontaneous acrosomal exocytosis in mouse sperm.</a> Dev Biol. 264 (1), 141-152 (2003).</li><li>Hasuwa, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+mouse+sperm+that+have+green+acrosome+and+red+mitochondria+allow+visualization+of+sperm+and+their+acrosome+reaction+in+vivo.">Transgenic mouse sperm that have green acrosome and red mitochondria allow visualization of sperm and their acrosome reaction in vivo.</a> Experimental animals / Japanese Association for Laboratory Animal Science. 59 (1), 105-107 (2010).</li><li>Henderson, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Low-Affinity+GCaMP3+Variant+(GCaMPer)+for+imaging+the+endoplasmic+reticulum+calcium+store.">A Low-Affinity GCaMP3 Variant (GCaMPer) for imaging the endoplasmic reticulum calcium store.</a> PloS one. 10 (10), 0139273 (2015).</li><li>Travis, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+relationships+between+capacitation-dependent+cell+signaling+and+compartmentalized+metabolic+pathways+in+murine+spermatozoa.">Functional relationships between capacitation-dependent cell signaling and compartmentalized metabolic pathways in murine spermatozoa.</a> J Biol Chem. 276 (10), 7630-7636 (2001).</li><li>Cohen, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+modulation+of+calcium+flux+through+CaV2.3+regulates+acrosome+exocytosis+and+fertilization.">Lipid modulation of calcium flux through CaV2.3 regulates acrosome exocytosis and fertilization.</a> Dev Cell. 28 (3), 310-321 (2014).</li><li>Sanchez-Cardenas, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acrosome+reaction+and+Ca(2)(+)+imaging+in+single+human+spermatozoa:+new+regulatory+roles+of+[Ca(2)(+)]i.">Acrosome reaction and Ca(2)(+) imaging in single human spermatozoa: new regulatory roles of [Ca(2)(+)]i.</a> Biol Reprod. 91 (2), 67 (2014).</li></ol>

Keine Autoren haben Interessenkonflikte im Zusammenhang mit dieser Arbeit zu melden.

Hier wird eine mikroskopiebasierte Methode beschrieben, um das neu generierte AcroSensE-Mausmodell für die Echtzeit-Einzelzellüberwachung und -analyse des Zusammenspiels zwischen akrosomaler Kalziumdynamik und Zwischenschritten, die zu AE führen, zu nutzen. Zusammen mit leicht verfügbaren genetischen Ansätzen, wie z. B. der Kreuzung mit anderen genetischen Modellen der Maus oder der Geneditierung, bieten dieses Modell und diese Methode ein leistungsfähiges System, um die Rolle verschiedener Komponenten und Signalwe...

Spermien erwerben die Fähigkeit zur Befruchtung während eines Prozesses, der als Kapazitation1 bezeichnet wird. Ein Endpunkt dieses Prozesses ist, dass die Spermien die Fähigkeit erwerben, AE zu durchlaufen. Daten aus mehr als zwei Jahrzehnten belegen das Vorhandensein eines komplexen, mehrstufigen Modells der AE in Säugetierspermien (zusammengefasst in 2,3). Die Untersuchung von AE in lebenden Spermien ist jedoch eine Herausforderung, und die derzeit verfügbaren Methoden zur Überwachung dieses Prozesses mit ausreichender Auflösung sind umständlich und erfordern mehrere Präparationsschritte4, beschränken sich auf den Nachweis des letzten Schritts der AE (z. B. unter Verwendung von PNA5), beschränken sich auf Messungen von Veränderungen des zytosolischen Kalziums (im Gegensatz zur akrosomalen Kalziumdynamik), oder beschränken sich auf Messungen der zytosolischen Kalziumdynamik oder der AE6.
Um einige der wichtigsten Einschränkungen von Echtzeit-AE-Studien unter physiologischen Bedingungen zu überwinden und die Untersuchung des Zusammenspiels zwischen Kalziumdynamik und AE zu ermöglichen, wurde ein einzigartiges Mausmodell generiert. In diesem Mausmodell wird ein Fusionsprotein, das aus dem genetisch kodierten Ca2+-Sensor (GCaMP3) und mCherry besteht, exprimiert und mit Hilfe eines Acrosin-Promotors und eines Signalpeptids2 auf das Akrosom ausgerichtet. Der gezielte duale GCaMP3-mCherry-Sensor ermöglicht die gleichzeitige Echtzeitmessung der Kalziumkonzentration und des Status des akrosomalen Inhalts in lebenden Spermien unter physiologischen Bedingungen unter Verwendung von Mikroskopie und einem Einzelzell-Stimulanzien-Verabreichungssystem (Abbildung 1). Als Bestandteil der akrosomalen Matrix würden Membranfusion und AE zum Verlust der photostabilen und pH-unempfindlichen mCherry-Fluoreszenz aus den Spermien führen, da dieses Protein aus dem Akrosomvesikel diffundiert. In dieser Hinsicht ist die Fähigkeit des Modells, den Zeitpunkt und das Auftreten von AE zu reflektieren, vergleichbar mit den Vorteilen der Akrosom-gerichteten GFP-Mauslinie 7,8,9.
Die in dieser transgenen Mauslinie verwendete GCaMP3-Variante hat eine ungefähre KD von 400 μM und einen Dynamikbereich für Ca2+ von 10-4-10-3 M10, der für dieses Vesikel geeignet ist. Wir konnten zeigen, dass diese Kombination von Eigenschaften von GCaMP3 die Bildung von Fusionsporen zwischen der Plasmamembran und der äußeren akrosomalen Membran (OAM) aufdecken kann2. Die Fusionsporendetektion ist darauf zurückzuführen, dass die Porengröße zu klein ist, um es dem AcroSensE-Protein zu ermöglichen, sich aus dem Akrosom zu dispergieren (durch Verlust des Akrosomgehalts), während gleichzeitig ein Membran-"Kanal" bereitgestellt wird, der den Einstrom von Ca2+-Ionen in das Akrosomlumen ermöglicht, was zu einer Erhöhung der Fluoreszenzintensität des GCaMP3 führt.
Das helle, monomere, nicht-kalziumempfindliche fluoreszierende Protein mCherry unterstützt die Visualisierung des Akrosoms, während das GCaMP3-Signal schwach ist (z. B. vor der Ca2+ -Bindung, Abbildung 2), und ermöglicht vor allem auch die Identifizierung von Akrosom-intakten Samenzellen, die für die Bildgebung geeignet sind.
Das folgende Protokoll beschreibt die Verwendung des einzigartigen AcroSensE-Mausmodells und der Methoden für die Mikroskopie, die experimentell verwendet werden, um die Kalziumdynamik von AE und Spermien mit hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung zu untersuchen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>100x oil objective&#160;</td>
			<td>Olympus Japan</td>
			<td>UPlanApo,</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-hydroxypropyl-b-cyclodextrin&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C0926</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm coverslip dish, 1.5 thickness</td>
			<td>MatTek Corp.&#160;</td>
			<td>P35G-1.5-20-C&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL round-bottomed tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate glass capilarries</td>
			<td>Sutter Instrument Co. CA USA</td>
			<td>B200-156-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C4901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Olympus Japan</td>
			<td>Olympus FluoView&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7528</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graduated tip&#160;</td>
			<td>TipOne, USA Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H7006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ&#160;</td>
			<td>National Institutes of Health</td>
			<td></td>
			<td>https://imagej.nih.gov/ij/plugins/index.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lactic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G5889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Live-Cell Microscope Incubation Systems&#160;</td>
			<td>TOKAI HIT Shizuoka, Japan</td>
			<td>Model STX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette Puller&#160;</td>
			<td>Sutter Instrument Co. CA USA</td>
			<td>Model P-97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S3014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S6297</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic transfer pipette&#160;</td>
			<td>FisherBrand&#160;</td>
			<td>13-711-6M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-lysine&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyruvic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>107360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single cell delivery system</td>
			<td>Parker, Hauppauge, NY</td>
			<td>Picospritzer III</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

real-time imaging of acrosomal calcium dynamics and exocytosis in live mouse sperm

Die Akrosom-Exozytose (AE), bei der das einzelne exozytotische Vesikel der Spermien mit der Plasmamembran verschmilzt, ist ein komplexer, kalziumabhängiger Prozess, der für die Befruchtung unerlässlich ist. Unser Verständnis darüber, wie die Kalziumsignalisierung die AE reguliert, ist jedoch noch unvollständig. Insbesondere das Zusammenspiel zwischen intraakrosomaler Kalziumdynamik und den Zwischenschritten, die zur AE führen, ist nicht gut definiert. Hier beschreiben wir eine Methode, die räumliche und zeitliche Einblicke in die akrosomale Kalziumdynamik und deren Beziehung zur Membranfusion und anschließenden Exozytose des Akrosomvesikels liefert. Die Methode verwendet eine neuartige transgene Maus, die einen Akrosomen-gerichteten Sensor für Exozytose (AcroSensE) exprimiert. Der Sensor kombiniert einen genetisch kodierten Kalziumindikator (GCaMP), der mit mCherry fusioniert ist. Dieses Fusionsprotein wurde speziell entwickelt, um die gleichzeitige Beobachtung von akrosomaler Kalziumdynamik und Membranfusionsereignissen zu ermöglichen. Die Echtzeitüberwachung der akrosomalen Kalziumdynamik und AE in lebenden AcroSensE-Spermien wird durch eine Kombination aus Bildgebung mit hoher Bildrate und einem Stimulanzien-Verabreichungssystem erreicht, das auf einzelne Spermien abzielen kann. Dieses Protokoll enthält auch mehrere Beispiele für grundlegende Methoden zur Quantifizierung und Analyse der Rohdaten. Da das AcroSensE-Modell genetisch kodiert ist, kann seine wissenschaftliche Bedeutung durch die Verwendung leicht verfügbarer genetischer Werkzeuge wie Kreuzungen mit anderen genetischen Modellen der Maus oder auf der Genom-Editierung (CRISPR) basierende Methoden erhöht werden. Mit dieser Strategie können die Rollen zusätzlicher Signalwege bei der Spermienkapazität und -befruchtung aufgeklärt werden. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die hier beschriebene Methode ein bequemes und effektives Werkzeug darstellt, um die Kalziumdynamik in einem bestimmten subzellulären Kompartiment - dem Spermienakrosom - zu untersuchen und wie diese Dynamik die Zwischenschritte reguliert, die zur Membranfusion und Akrosomen-Exozytose führen.

Sperm acquire the ability to fertilize during a process called capacitation1. One endpoint of this process is that the sperm acquire the ability to undergo AE. Over two decades of data support the presence of a complex, multi-step model of AE in mammalian sperm (summarized in2,3). However, studying AE in live sperm is challenging, and currently available methods to monitor this process with adequate resolution are cumbersome and require multiple preparation steps4, are limited to the detection of the final step of AE (e.g., using PNA5), are limited to measurements of changes in cytosolic calcium (in contrast to acrosomal calcium dynamics), or are limited to measurements of either cytosolic calcium dynamics or AE6.
To overcome some of the key limitations of real-time AE studies under physiological conditions and to enable investigation of the interplay between calcium dynamics and AE, a unique mouse model was generated. In this mouse model, a fusion protein composed of the genetically encoded Ca2+-sensor (GCaMP3) and mCherry is expressed and targeted to the acrosome using an acrosin promoter and signaling peptide2. The targeted dual GCaMP3-mCherry sensor enables simultaneous real-time measurements of calcium concentrations and the status of the acrosomal contents in live sperm under physiological conditions using microscopy and a single-cell stimulant delivery system (Figure 1). As a component of the acrosomal matrix, membrane fusion, and AE would result in the loss of the photostable and pH-insensitive mCherry fluorescence from the sperm, as this protein diffuses out of the acrosome vesicle. In this regard, the model&#39;s ability to reflect the timing and occurrence of AE is akin to the benefits of the acrosome-targeted GFP mouse line7,8,9.
The GCaMP3 variant used in this transgenic mouse line has an approximate KD of 400 &#181;M and a dynamic range for Ca2+ of 10-4-10-3 M10, which is suitable for this vesicle. We showed that this combination of features of GCaMP3 could reveal fusion pore formation between the plasma membrane and the outer acrosomal membrane (OAM)2. The fusion pore detection is a result of the pore size being too small to allow the AcroSensE protein to disperse out of the acrosome (via loss of acrosome content) while providing a membrane &#34;channel&#34; that enables the influx of Ca2+ ions into the acrosome lumen, leading to an increase in fluorescence intensity of the GCaMP3.
The bright, monomeric, non-calcium-sensitive fluorescent protein mCherry supports visualization of the acrosome while the GCaMP3 signal is faint (e.g., prior to Ca2+ binding, Figure 2), and importantly, it also allows for the identification of acrosome-intact sperm cells suitable for imaging.
The following protocol describes the utilization of the unique AcroSensE mouse model and the methods for microscopy used experimentally to study AE and sperm calcium dynamics with high spatial and temporal resolution.

Autor im Rampenlicht: Eine Bildgebungstechnik für lebende Zellen zur Untersuchung der Kalziumsignalgebung und der Akrosom-Exozytose in Mausspermien 

Echtzeit-Bildgebung der akrosomalen Kalziumdynamik und Exozytose in lebenden Mäusespermien

Abbildung 2 zeigt eine vereinfachte Darstellung, die die Abfolge der Fluoreszenzänderungen zeigt, die nach der erfolgreichen Stimulation der Spermien zu erwarten sind. Das obere Feld von Abbildung 2 zeigt die Änderungen der GCaMP3-Fluoreszenzintensität, bei der das Signal zunächst schwach ist (die akrosomalen Kalziumkonzentrationen sind niedriger als die GCaMP3-KD) und beim Eintritt von Kalziumionen über Fusionsporen die Helligkeit der Fluoreszenz ...

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Das hier beschriebene AcroSensE-Mausmodell und die hier beschriebenen Live-Cell-Imaging-Methoden bieten einen neuen Ansatz zur Untersuchung der Kalziumdynamik im subzellulären Kompartiment des Spermienakrosoms und wie sie Zwischenschritte regulieren, die zur Membranfusion und Akrosomen-Exozytose führen.

Acrosome exocytosis (AE), in which the sperm&#39;s single exocytotic vesicle fuses with the plasma membrane, is a complex, calcium-dependent process ...

Unser Forschungsziel ist es, die molekularen Mechanismen, die die Spermienfunktion regulieren, besser zu verstehen, einschließlich der Prozesse wie Kapazitation und Befruchtung. Insbesondere untersuchen wir, wie Membranlipide die Kalziumsignalisierung und die Akrosom-Exozytose aktivieren. Dieses Protokoll schließt die Lücke in unserem Verständnis des Zusammenspiels zwischen Kapazitation, Spermienaktivierung, Kalziumsignalisierung und Akrosomen-Exozytose.Zu den Vorteilen dieses Protokolls gehören die Bildgebung von Spermien unter physiologischen Bedingungen sowie seine Fähigkeit, sowohl die Kalziumsignalisierung als auch die Akrosom-Exozytose gleichzeitig zu überwachen, ohne dass komplizierte Vorlade- oder Stehverfahren erforderlich sind.

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Real-Time Imaging of Acrosomal Calcium Dynamics and Exocytosis in Live Mouse Sperm

706 Aufrufe.  Cornell University. Unser Forschungsziel ist es, die molekularen Mechanismen, die die Spermienfunktion regulieren, besser zu verstehen, einschließlich der Prozesse wie Kapazitation und Befruchtung. Insbesondere untersuchen wir, wie Membranlipide die Kalziumsignalisierung und die Akrosom-Exozytose aktivieren. Dieses Protokoll schließt die Lücke in unserem Verständnis des Zusammenspiels zwischen Kapazitation, Spermienaktivierung, Kalziumsignalisierung und Akrosomen-Exozytose.Zu den Vorteilen dieses Prot...

Serie: Autor im Rampenlicht: Eine Bildgebungstechnik für lebende Zellen zur Untersuchung der Kalziumsignalgebung und der Akrosom-Exozytose in Mausspermien 

Acrosome exocytosis (AE), in which the sperm&#39;s single exocytotic vesicle fuses with the plasma membrane, is a complex, calcium-dependent process essential for fertilization. However, our understanding of how calcium signaling regulates AE is still incomplete. In particular, the interplay between intra-acrosomal calcium dynamics and the intermediate steps leading to AE is not well-defined. Here, we describe a method that provides spatial and temporal insights into acrosomal calcium dynamics and their relationship to membrane fusion and subsequent exocytosis of the acrosome vesicle. The method utilizes a novel transgenic mouse expressing an Acrosome-targeted Sensor for Exocytosis (AcroSensE). The sensor combines a genetically encoded calcium indicator (GCaMP) fused with mCherry. This fusion protein was specifically designed to enable the concurrent observation of acrosomal calcium dynamics and membrane fusion events. Real-time monitoring of acrosomal calcium dynamics and AE in live AcroSensE sperm is achieved using a combination of high frame-rate imaging and a stimulant delivery system that can target single sperm. This protocol also provides several examples of basic methods to quantify and analyze the raw data. Because the AcroSensE model is genetically encoded, its scientific significance can be augmented by using readily available genetic tools, such as crossbreeding with other mouse genetic models or gene-editing (CRISPR) based methods. With this strategy, the roles of additional signaling pathways in sperm capacitation and fertilization can be resolved. In summary, the method described here provides a convenient and effective tool to study calcium dynamics in a specific subcellular compartment-the sperm acrosome-and how those dynamics regulate the intermediate steps leading to membrane fusion and acrosome exocytosis.

The AcroSensE mouse model and live cell imaging methods described here provide a new approach to studying calcium dynamics in the subcellular compartment of the sperm acrosome and how they regulate intermediate steps leading to membrane fusion and acrosome exocytosis.