Bu çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüleri hibeleri R01-HD093827 ve R03-HD090304 (AJT) tarafından desteklenmiştir.

Tüm hayvan prosedürleri yönergelere göre gerçekleştirildi ve Cornell Üniversitesi'ndeki Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylandı (#2002-0095). Bu çalışma için 8-10 haftalık AcroSensE fareleri2 kullanıldı. AcroSensE farelerin kullanılabilirliği hakkında bilgi talepleri ilgili yazara gönderilebilir.
1. Sperm toplama ve yıkama
<ol><li>AcroSensE farelerinden kauda epididimal spermi toplayın (bu prosedürle ilgili daha fazla ayrıntı11'de verilmiştir). 37 ° C'de 0,5 mL Modifiye Whitten ortamı (MW) içeren 3,5 cm'lik bir doku kültürü kabında 15 dakikalık yüzme prosedürüne izin verin. MW'nin buharlaşmasını azaltmak için çanak örtülmeli ve ortam kauda epididimitlerini örtmek için yeterli derinliğe sahip olacak şekilde eğilmelidir. NOT: Modifiye Whitten'in ortamı (MW), 22 mM HEPES, 1.2 mM MgCl2, 100 mM NaCl, 4.7 mM KCl, 1 mM pirüvik asit, 4.8 mM laktik asit hemi-Ca2+ tuzu, pH 7.35 içerir. Glikoz (5.5 mM), NaHCO3 (10 mM) ve 2-hidroksipropil - siklodekstrin (CD; 3 mM), kapasitasyon indüksiyonu için gerektiği gibi desteklenir (Malzeme Tablosuna bakınız) ve konsantrasyonlar spesifik deneyler için değiştirilebilir. Ek olarak, CD yerine alternatif sterol alıcıları kullanılabilir (ör., sığır serum albümini veya yüksek yoğunluklu lipoproteinler).</li>
	<li>İnce forseps kullanarak, yüzme toplama kabından herhangi bir epididimal dokuyu çıkarın. Sperm içeren ortamı 15 mL'lik konik bir tüpe aktarın ve süspansiyonu oda sıcaklığında sallanan bir kova rotorunda 1 dakika boyunca 100 x g'da santrifüjleyin. Plastik bir pipet kullanarak, spermi içeren MW süpernatanı, bu adımda peletlenecek herhangi bir brüt doku kalıntısından çıkarın.</li>
	<li>Spermi içeren MW süpernatanı 37 ° C'de MW ekleyerek toplam 3 mL hacme getirin. Yuvarlak tabanlı bir tüpte 400 x g'da 8 dakika (oda sıcaklığında) santrifüjleyin. MW'nin süpernatantını gevşek peletlenmiş spermden yavaşça çıkarın.</li>
	<li>Canlıysa, sperm "kabarık" görünümlü bir topak olarak görünmelidir. Spermi, büyük delikli bir transfer pipeti ile öğütme yoluyla veya tüpe hafif manuel dokunuşlarla ("parmak hareketi") nazikçe yeniden süspanse edin. Eşit şekilde yeniden süspanse edildikten sonra, bunları yeni bir yuvarlak tabanlı tüpe aktarın. Hareketliliği saymak ve değerlendirmek için 10-20 μL sperm süspansiyonu kullanın. Kullanım için spermi MW cinsinden seyreltin. NOT: Fare sperm kapasitasyonunu içeren çoğu deney için, 5-10 milyon sperm / mL MW'lık bir nihai konsantrasyon kullanılır. Burada tarif edilen görüntüleme protokolü, spermin fizyolojik olarak ilgili akrozom ekzositozuna girme yeteneğini kazanması gerekmesine rağmen, spermin kapasitasyonunu gerektirmez. Spermi kapasitif hale getirmeden kalsiyum iyonofor gibi reaktifler yoluyla indüklenen patolojik ekzositoz veya ekzositoz incelenebilir. Ek olarak, çeşitli uyaranlara yanıt olarak kapasitif olmayan hücrelerde akrozomal kalsiyumdaki potansiyel değişiklikler araştırılabilir.</li>
	<li>Spermi toplandıktan sonra 3-5 saat içinde kullanın, süreyi mümkün olduğunca kısa tutun ve deneysel denemeler arasında tutarlı olun.</li>
	<li>Membran hasarını en aza indirecek yöntemler kullanarak MW ortamı kullanarak tüm toplama ve yıkama adımlarını 37 °C'de gerçekleştirin. Bu, prosedürün tüm aşamalarında kullanılması önerilen büyük delikli plastik transfer pipetlerinin veya büyük delikli pipet uçlarının kullanımını içerir.</li>
</ol>2. Görüntüleme için lamel tabakların poli-D-lizin kaplaması
NOT: Poli-D-lizin (PDL) kapları her deneyden önce taze olarak hazırlanmalıdır.
<ol><li>Bir lamel kabının ortasına 0,5 μL'lik bir PDL damlası (0,5 mg/mL, Malzeme Tablosuna bakınız) dağıtın.</li>
	<li>10 μL dereceli bir uç kullanarak, PDL damlacığını lamel boyunca sürün ( Şekil 1B'de gösterildiği gibi çapraz desen).</li>
	<li>37 °C'de 10 dakika kurumaya bırakın. PDL kaplı tabakları kullanana kadar kapalı ve 37 °C'de tutun.</li>
</ol>3. Kılcal çekme, şişirme için yükleme
<ol><li>Borosilikat cam kılcal damarları (OD, 2 mm, ID, 1.56 mm, Malzeme Tablosuna bakın) aşağıdaki ayarları kullanarak çekin: Isı: 330, Çekme: 250, Hız: 250 ve Zaman: 70. Bu adım, kullanımdaki belirli çektirme için optimize edilmelidir.</li>
	<li>Her deneyden önce, uyarıcının konsantrasyonunun 3-5 katını içeren uyarıcı çözelti ile tek bir kılcal damar yükleyin (çözeltinin şişirildikten sonra hızlı difüzyonunu hesaba katmak için). Doldurmadan önce, kılcal ucu uçtan yaklaşık 1-2 mm uzakta kırmak için ince cımbız kullanın. Bu, ∼5 μm'lik bir açıklık çapı üretmelidir. Isı parlatma gerekli değildir.</li>
	<li>İnce bir plastik transfer pipeti kullanarak, uyarıcı çözeltiyi, uzunluğunun dörtte üçü dolana kadar kılcal damara yavaşça enjekte edin.</li>
	<li>Doldurma sırasında oluşan hava kabarcıklarını kılcal damarı hafifçe vurarak çıkarın.</li>
	<li>Doldurulmuş kılcal damarı mikromanipülatöre monte edin (Malzeme Tablosuna bakın).</li>
</ol>4. Şişirme için stimülasyon verilmesinin hazırlanması
NOT: Kullanıcının yaralanma riskini en aza indirmek için, şişirme prosedürünün çalışması sırasında koruyucu gözlük takılmalıdır.
<ol><li>Tek hücreli dağıtım sistemi ayarlarını 10 psi'de 5 s'lik bir darbe sağlayacak şekilde ayarlayın.</li>
	<li>Borosilikat kılcalını tek hücreli dağıtım sistemi pipet tutucusuna bağlayın. Contaların sıkı olduğundan emin olun.</li>
	<li>Kılcal ucu gözlemlerken, çözeltinin gerçekten ucun ucundan dağıtıldığından emin olmak için 2 psi'de 20 s'lik kısa bir nefes uygulayın (ucun ucunda küçük bir damla belirgin olmalıdır).</li>
</ol>5. Mikroskopi ve görüntü elde etme
NOT: Birden fazla mikroskop markası mevcuttur ve kullanılabilir; Bununla birlikte, minimum 3 kare/sn kare hızı arzu edilir. Sıcaklık ve çevre kontrolü ile ilgili olarak, çanaktaki ortamın gerçek sıcaklığının, örneğin temassız bir kızılötesi termometre kullanılarak doğrulanması gerektiğini lütfen unutmayın.
<ol><li>Poli-D-lizin kaplı 35 mm'lik bir lamel kabının ortasına 80 μL seyreltilmiş sperm ekleyin. Fare sperm kapasitasyonunu içeren çoğu deney için, 5-10 milyon sperm / mL'lik bir nihai konsantrasyon kullanılır.</li>
	<li>Sperme, 10 mM CaCl2 ile desteklenmiş 3 mL ılık (37 ° C) MW baz ortamını yavaşça ekleyin. NOT: Hücresel süreçleri yavaşlatmak için oda sıcaklığında deneyler yapılabilir, ancak kapasitasyona lipid değişimleri ve mikro ve makro alanların akışkanlığı aracılık ettiğinden, fizyolojik olarak ilgili kapasitasyon ve akrozom ekzositozunun sıcaklığa bağlı süreçler olduğu akılda tutulmalıdır.</li>
	<li>Çanağı sperm ile mikroskoba monte edin (önceden 37 ° C'ye ısıtılmış).</li>
	<li>GCaMP3'ü 488 nm lazer çizgisi kullanarak heyecanlandırın ve 505-550 nm bant geçiren (BP) filtreyle görüntüleyin. 555 nm lazer çizgisi kullanarak mCherry'yi heyecanlandırın ve 575-615 nm BP filtresiyle görüntüleyin.</li>
	<li>Bir mikromanipülatör kullanarak (manipülatörün mikroskobun kurulduğu hava tablasına takılması önerilir.), kılcal damarın ucunu yaklaşık 100 μm yana ve ilgilenilen hücrenin düzleminin 5-10 μm yukarısına yerleştirin. NOT: Uyarıcı çözeltiler, kılcal damar ve hücre arasındaki hacimde meydana gelen hızlı difüzyonu telafi etmek için normal konsantrasyonun 3-5 katında yapılır.</li>
	<li>Mikroskopta görüntüleme dizisini başlatın.</li>
	<li>Sperm hücrelerini yüksek kare hızında, tercihen >10 kare/sn'de görüntüleyin. Burada, 33 ms/karede görüntülemeyi sağlayan bir rezonans tarayıcı kullanıldı.</li>
	<li>Mikroskopta görüntü alımını başlattıktan on saniye sonra, 10 saniyelik uyarıcı nefesini başlatmak için tek hücreli dağıtım sistemini etkinleştirin.</li>
	<li>10-15 dakikalık bir süre için görüntü hücreleri.</li>
	<li>Tek hücreli dağıtım sistemini kullanarak, Şekil 1B'de verilen konumlara göre tek bir tabaktan birden fazla hücreyi görüntüleyin. NOT: Mikroskop altında tedavi edilmemiş/uyarılmamış spermler, yeşil sinyalin düşük yoğunluğu ile çoğunlukla kırmızı görünmelidir. Sperm başları lamel üzerine tutturulmalıdır ve canlı spermler hareketli kuyrukları ile tanımlanabilir. AE geçiren spermlerde, GCaMP3 yeşil sinyali başlangıçta artacak ve Şekil 2'de gösterildiği gibi AE tamamlandığında hem mCherry kırmızı sinyali hem de GCaMP3 yeşil sinyali kaybolacaktır. mCherry floresansının azaltılması, AE'nin başladığı zamanın daha spesifik bir göstergesini sağlar, çünkü Ca2+ konsantrasyonlarındaki değişiklikler sürekli olarak GCaMP3 floresan yoğunluğunda değişikliklere neden olacaktır.</li>
</ol>6. Görüntü ve veri analizi
NOT: Çevrimdışı görüntü analizi ImageJ kullanılarak gerçekleştirilir (bkz. Daha önce, AE'ye yol açan süreçte akrozomal kalsiyum artışı (ACR) ve tam membran füzyonu dahil olmak üzere birkaç ara adım bildirilmişti. İkincisi, mCherry floresan kaybına yol açar ve bu nedenle tam AE'yi temsil eder. Bazı hücrelerde, ekzositoz çalışmalarında amperometrik yaklaşımlar kullanılırken başak öncesi ayak olaylarına (PSF) benzer sinyaller gözlenir (daha fazla ayrıntı için lütfenbkz. 2). ACR, AE ve ara adımlarını ölçmek için AcroSensE ham verilerini analiz etmek için çeşitli isteğe bağlı yöntemler mevcuttur. Aşağıda bazı temel analitik yöntemler açıklanmaktadır.
<ol><li>Belirli mikroskop sistemi dosya uzantısına bağlı olarak, GCaMP3 > mCherry kanalları için ayrı pencereler oluşturmak üzere bölünmüş kanal aracını (Görüntü > Renkler ve Bölünmüş Kanallar) kullanın.</li>
	<li>"Pencereyi Senkronize Et" aracını kullanarak tek tek pencereleri senkronize edin (Pencereleri Senkronize Et > > Araçlarını Analiz Et).</li>
	<li>Akrozom bölgesini dahil etmek için kırmızı kanaldaki sperm başının etrafında bir ilgi alanı (ROI) seçin (Şekil 3A,B). Senkronizasyon aracı, aynı alan seçiminin, spermin hala görülemeyecek kadar loş olduğu yeşil kanala otomatik olarak uygulanmasını sağlar.</li>
	<li>Floresan yoğunluğundaki değişimi iki kanalın her biri için karelerin/zamanın bir fonksiyonu olarak çizmek için "Z Profiler" eklentisini (Eklentiler > Yığınları > Z Profiler) veya "Zaman Serisi Çözümleyicisi" (Zaman Serisi Çözümleyicisi > Yığınları > Eklentileri) seçin.</li>
	<li>Çizim ve daha fazla analiz için verileri bir elektronik tablo yazılımına (örneğin, Microsoft Excel) kopyalayın. NOT: Veriler bir elektronik tabloya kopyalandıktan sonra, Şekil 4'te gösterildiği gibi aşağıdakiler de dahil olmak üzere analiz için birden fazla parametre çıkarılabilir.<ol><li>Fusion Pore (FP) başlangıç zamanı: 0 zaman noktasından GCaMP3 sinyalinin yükselmeye başladığı zaman noktasına kadar geçen süreyi ölçün. Bu parametre, stimülasyon ile sperm ACR yanıtı arasındaki gecikmeyi gösterir.</li>
		<li>AE başlangıç zamanı: 0 zaman noktasından mCherry sinyalinin bozulmaya başladığı zaman noktasına kadar geçen süreyi ölçün. Bu parametre, stimülasyon ile sperm AE yanıtı arasındaki gecikmeyi gösterir. Bu parametre, FP oluşumu ile AE yanıtı arasındaki gecikmeyi hesaplamak için de kullanılabilir.</li>
		<li>Tepe FP genliği: floresan sinyalini tabandan GCaMP3 sinyal artışının zirvesine kadar ölçün. Bu parametre, ACR yanıtındaki toplam artışı gösterir.</li>
		<li>mCherry kayıp oranı: bu parametreyi mCherry sinyal kaybının kesitine doğrusal veya üstel bir uyumla belirleyin ( Şekil 4B'de "eğim" ile gösterildiği gibi). NOT: Alternatif olarak, çeşitli zaman noktalarında artık (R) sinyal yöntemiyle bozunma oranını belirleyin (örneğin, R60: mCherry sinyalinin taban çizgisinden% 60'lık bir artık sinyale saniye cinsinden süre). Bu parametre, akrozomal içeriğin AE üzerine dağılma hızını ölçmek için kullanılabilir.</li>
		<li>mCherry kaybı için sinyal azalması: temel mCherry floresan yoğunluğu ile AE'yi takip eden sinyal arasındaki genlik farkını belirleyin. Bu parametre, AE üzerine dağılmış toplam akrozomal içerik miktarını gösterir.</li>
		<li>Hem kırmızı hem de yeşil kanallar için floresanstaki (F) değişiklikleri ham veri olarak çizin veya bunları ilk floresan (F0) ile normalleştirin ve ΔF/F0 olarak ifade edin. İkincisi, tek bir grafikte hem kırmızı hem de yeşil renkteki değişikliklerin daha iyi görselleştirilmesini sağlar (örneğin, bkz. Şekil 3D ve Şekil 3H). NOT: Son olarak, akrozomal kalsiyum konsantrasyonundaki değişiklikler ile AE arasındaki ilişkiyi belirlemek için ölçülen farklı parametreler farklı koşullar arasında karşılaştırılabilir. Çeşitli deneysel koşul karşılaştırmalarının örnekleri için referans2'ye bakın.</li>
	</ol></li>
</ol>

Canlı Fare Spermini İncelemek için Görüntülemeyi Uyarıcı Dağıtım Sistemi ile Birleştirme

<ol>
	<li>Austin, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Observations+on+the+penetration+of+the+sperm+in+the+mammalian+egg.">Observations on the penetration of the sperm in the mammalian egg.</a> Aust J Sci Res B. 4 (4), 581-596 (1951).</li><li>Cohen, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetically+targeted+sensor+reveals+spatial+and+temporal+dynamics+of+acrosomal+calcium+and+sperm+acrosome+exocytosis.">A genetically targeted sensor reveals spatial and temporal dynamics of acrosomal calcium and sperm acrosome exocytosis.</a> J Biol Chem. 298 (5), 101868 (2022).</li><li>Cohen, R., Mukai, C., Travis, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+regulation+of+acrosome+exocytosis.">Lipid regulation of acrosome exocytosis.</a> Adv Anat Embryol Cell Biol. 220, 107-127 (2016).</li><li>Harper, C. V., Cummerson, J. A., White, M. R., Publicover, S. J., Johnson, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+resolution+of+acrosomal+exocytosis+in+human+sperm.">Dynamic resolution of acrosomal exocytosis in human sperm.</a> J Cell Sci. 121, 2130-2135 (2008).</li><li>Sosa, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetics+of+human+sperm+acrosomal+exocytosis).">Kinetics of human sperm acrosomal exocytosis).</a> Mol Hum Reprod. 21 (3), 244-254 (2015).</li><li>Balestrini, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seeing+is+believing:+Current+methods+to+observe+sperm+acrosomal+exocytosis+in+real+time.">Seeing is believing: Current methods to observe sperm acrosomal exocytosis in real time.</a> Mol Reprod Dev. 87 (12), 1188-1198 (2020).</li><li>Nakanishi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+observation+of+acrosomal+dispersal+from+mouse+sperm+using+GFP+as+a+marker+protein.">Real-time observation of acrosomal dispersal from mouse sperm using GFP as a marker protein.</a> FEBS Lett. 449 (2-3), 277-283 (1999).</li><li>Kim, K. S., Gerton, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+release+of+soluble+and+matrix+components:+evidence+for+intermediate+states+of+secretion+during+spontaneous+acrosomal+exocytosis+in+mouse+sperm.">Differential release of soluble and matrix components: evidence for intermediate states of secretion during spontaneous acrosomal exocytosis in mouse sperm.</a> Dev Biol. 264 (1), 141-152 (2003).</li><li>Hasuwa, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+mouse+sperm+that+have+green+acrosome+and+red+mitochondria+allow+visualization+of+sperm+and+their+acrosome+reaction+in+vivo.">Transgenic mouse sperm that have green acrosome and red mitochondria allow visualization of sperm and their acrosome reaction in vivo.</a> Experimental animals / Japanese Association for Laboratory Animal Science. 59 (1), 105-107 (2010).</li><li>Henderson, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Low-Affinity+GCaMP3+Variant+(GCaMPer)+for+imaging+the+endoplasmic+reticulum+calcium+store.">A Low-Affinity GCaMP3 Variant (GCaMPer) for imaging the endoplasmic reticulum calcium store.</a> PloS one. 10 (10), 0139273 (2015).</li><li>Travis, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+relationships+between+capacitation-dependent+cell+signaling+and+compartmentalized+metabolic+pathways+in+murine+spermatozoa.">Functional relationships between capacitation-dependent cell signaling and compartmentalized metabolic pathways in murine spermatozoa.</a> J Biol Chem. 276 (10), 7630-7636 (2001).</li><li>Cohen, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+modulation+of+calcium+flux+through+CaV2.3+regulates+acrosome+exocytosis+and+fertilization.">Lipid modulation of calcium flux through CaV2.3 regulates acrosome exocytosis and fertilization.</a> Dev Cell. 28 (3), 310-321 (2014).</li><li>Sanchez-Cardenas, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acrosome+reaction+and+Ca(2)(+)+imaging+in+single+human+spermatozoa:+new+regulatory+roles+of+[Ca(2)(+)]i.">Acrosome reaction and Ca(2)(+) imaging in single human spermatozoa: new regulatory roles of [Ca(2)(+)]i.</a> Biol Reprod. 91 (2), 67 (2014).</li></ol>

Hiçbir yazarın bu çalışmayla ilgili rapor vermek için çıkar çatışması yoktur.

Burada, akrozomal kalsiyum dinamikleri ile AE'ye yol açan ara adımlar arasındaki etkileşimin gerçek zamanlı, tek hücreli izlenmesi ve analizi için yeni oluşturulan AcroSensE fare modelini kullanmak için mikroskopi tabanlı bir yöntem açıklanmaktadır. Diğer fare genetik modelleriyle melezleme veya gen düzenleme gibi hazır genetik yaklaşımlarla birlikte, bu model ve yöntem, kapasitasyon, AE ve döllenme ile ilgili sperm sinyal yollarında yer alan çeşitli bileşenlerin ve yolların rolünü incelemek ...

Sperm, kapasitasyon1 adı verilen bir işlem sırasında döllenme yeteneği kazanır. Bu sürecin bir son noktası, spermin AE'ye girme yeteneğini kazanmasıdır. Yirmi yılı aşkın veriler, memeli sperminde karmaşık, çok adımlı bir AE modelinin varlığını desteklemektedir (2,3'te özetlenmiştir). Bununla birlikte, AE'yi canlı spermde incelemek zordur ve bu süreci yeterli çözünürlükle izlemek için şu anda mevcut olan yöntemler zahmetlidir ve birden fazla hazırlık adımı gerektirir4, AE'nin son adımının tespiti ile sınırlıdır (ör., PNA5 kullanılarak), sitozolik kalsiyumdaki değişikliklerin ölçümleri ile sınırlıdır (akrozomal kalsiyum dinamiklerinin aksine), veya sitozolik kalsiyum dinamiği veya AE6 ölçümleriyle sınırlıdır.
Fizyolojik koşullar altında gerçek zamanlı AE çalışmalarının bazı temel sınırlamalarının üstesinden gelmek ve kalsiyum dinamiği ile AE arasındaki etkileşimin araştırılmasını sağlamak için benzersiz bir fare modeli oluşturuldu. Bu fare modelinde, genetik olarak kodlanmış Ca2 + sensörü (GCaMP3) ve mCherry'den oluşan bir füzyon proteini eksprese edilir ve bir akrosin promotörü ve sinyal peptidi2 kullanılarak akrozoma hedeflenir. Hedeflenen çift GCaMP3-mCherry sensörü, mikroskopi ve tek hücreli uyarıcı dağıtım sistemi kullanılarak fizyolojik koşullar altında canlı spermdeki kalsiyum konsantrasyonlarının ve akrozomal içeriğin durumunun eş zamanlı gerçek zamanlı ölçümlerini sağlar (Şekil 1). Akrozomal matrisin bir bileşeni olarak, membran füzyonu ve AE, bu protein akrozom vezikülünden dışarı yayıldığından, spermden fototable ve pH'a duyarsız mCherry floresansının kaybına neden olur. Bu bağlamda, modelin AE'nin zamanlamasını ve oluşumunu yansıtma yeteneği, akrozom hedefli GFP fare serisi 7,8,9'un faydalarına benzer.
Bu transgenik fare serisinde kullanılan GCaMP3 varyantı, yaklaşık 400 μM'lik bir KD'ye ve bu vezikül için uygun olan 10-4-10-3 M 10'luk Ca2+ için dinamik bir aralığa sahiptir. GCaMP3'ün bu özellik kombinasyonunun, plazma membranı ile dış akrozomal membran (OAM)2 arasında füzyon gözenek oluşumunu ortaya çıkarabileceğini gösterdik. Füzyon gözenek tespiti, gözenek boyutunun AcroSensE proteininin akrozomdan dağılmasına izin vermeyecek kadar küçük olmasının bir sonucudur (akrozom içeriğinin kaybı yoluyla) ve Ca2+ iyonlarının akrozom lümenine akışını sağlayan bir membran "kanalı" sağlar, GCaMP3'ün floresan yoğunluğunda bir artışa yol açar.
Parlak, monomerik, kalsiyuma duyarlı olmayan floresan protein mCherry, GCaMP3 sinyali zayıfken (örneğin, Ca2+ bağlanmadan önce, Şekil 2) akrozomun görselleştirilmesini destekler ve daha da önemlisi, görüntüleme için uygun akrozom-bozulmamış sperm hücrelerinin tanımlanmasına da izin verir.
Aşağıdaki protokol, benzersiz AcroSensE fare modelinin kullanımını ve AE ve sperm kalsiyum dinamiklerini yüksek uzamsal ve zamansal çözünürlükle incelemek için deneysel olarak kullanılan mikroskopi yöntemlerini açıklamaktadır.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>100x oil objective&#160;</td>
			<td>Olympus Japan</td>
			<td>UPlanApo,</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-hydroxypropyl-b-cyclodextrin&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C0926</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm coverslip dish, 1.5 thickness</td>
			<td>MatTek Corp.&#160;</td>
			<td>P35G-1.5-20-C&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL round-bottomed tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate glass capilarries</td>
			<td>Sutter Instrument Co. CA USA</td>
			<td>B200-156-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C4901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Olympus Japan</td>
			<td>Olympus FluoView&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7528</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graduated tip&#160;</td>
			<td>TipOne, USA Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H7006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ&#160;</td>
			<td>National Institutes of Health</td>
			<td></td>
			<td>https://imagej.nih.gov/ij/plugins/index.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lactic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G5889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Live-Cell Microscope Incubation Systems&#160;</td>
			<td>TOKAI HIT Shizuoka, Japan</td>
			<td>Model STX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette Puller&#160;</td>
			<td>Sutter Instrument Co. CA USA</td>
			<td>Model P-97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S3014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S6297</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic transfer pipette&#160;</td>
			<td>FisherBrand&#160;</td>
			<td>13-711-6M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-lysine&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyruvic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>107360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single cell delivery system</td>
			<td>Parker, Hauppauge, NY</td>
			<td>Picospritzer III</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

real-time imaging of acrosomal calcium dynamics and exocytosis in live mouse sperm

Spermin tek ekzositik vezikülünün plazma zarı ile birleştiği akrozom ekzositozu (AE), döllenme için gerekli olan karmaşık, kalsiyuma bağımlı bir süreçtir. Bununla birlikte, kalsiyum sinyalinin AE'yi nasıl düzenlediğine dair anlayışımız hala eksiktir. Özellikle, intraakrozomal kalsiyum dinamikleri ile AE'ye giden ara adımlar arasındaki etkileşim iyi tanımlanmamıştır. Burada, akrozomal kalsiyum dinamikleri ve bunların membran füzyonu ve ardından akrozom vezikülünün ekzositozu ile ilişkisi hakkında uzamsal ve zamansal bilgiler sağlayan bir yöntemi açıklıyoruz. Yöntem, Ekzositoz için Akrozom hedefli bir Sensörü (AcroSensE) eksprese eden yeni bir transgenik fare kullanır. Sensör, mCherry ile kaynaşmış genetik olarak kodlanmış bir kalsiyum göstergesini (GCaMP) birleştirir. Bu füzyon proteini, akrozomal kalsiyum dinamiği ve membran füzyon olaylarının eşzamanlı gözlemini sağlamak için özel olarak tasarlanmıştır. Canlı AcroSensE sperminde akrozomal kalsiyum dinamiklerinin ve AE'nin gerçek zamanlı izlenmesi, yüksek kare hızlı görüntüleme ve tek spermi hedefleyebilen bir uyarıcı dağıtım sisteminin bir kombinasyonu kullanılarak elde edilir. Bu protokol ayrıca ham verileri ölçmek ve analiz etmek için birkaç temel yöntem örneği sağlar. AcroSensE modeli genetik olarak kodlandığından, diğer fare genetik modelleriyle melezleme veya gen düzenleme (CRISPR) tabanlı yöntemler gibi hazır genetik araçlar kullanılarak bilimsel önemi artırılabilir. Bu strateji ile ek sinyal yolaklarının sperm kapasitasyonu ve döllenmedeki rolleri çözülebilir. Özetle, burada açıklanan yöntem, belirli bir hücre altı bölmedeki (sperm akrozomunda) kalsiyum dinamiklerini ve bu dinamiklerin membran füzyonu ve akrozom ekzositozuna yol açan ara adımları nasıl düzenlediğini incelemek için uygun ve etkili bir araç sağlar.

Sperm acquire the ability to fertilize during a process called capacitation1. One endpoint of this process is that the sperm acquire the ability to undergo AE. Over two decades of data support the presence of a complex, multi-step model of AE in mammalian sperm (summarized in2,3). However, studying AE in live sperm is challenging, and currently available methods to monitor this process with adequate resolution are cumbersome and require multiple preparation steps4, are limited to the detection of the final step of AE (e.g., using PNA5), are limited to measurements of changes in cytosolic calcium (in contrast to acrosomal calcium dynamics), or are limited to measurements of either cytosolic calcium dynamics or AE6.
To overcome some of the key limitations of real-time AE studies under physiological conditions and to enable investigation of the interplay between calcium dynamics and AE, a unique mouse model was generated. In this mouse model, a fusion protein composed of the genetically encoded Ca2+-sensor (GCaMP3) and mCherry is expressed and targeted to the acrosome using an acrosin promoter and signaling peptide2. The targeted dual GCaMP3-mCherry sensor enables simultaneous real-time measurements of calcium concentrations and the status of the acrosomal contents in live sperm under physiological conditions using microscopy and a single-cell stimulant delivery system (Figure 1). As a component of the acrosomal matrix, membrane fusion, and AE would result in the loss of the photostable and pH-insensitive mCherry fluorescence from the sperm, as this protein diffuses out of the acrosome vesicle. In this regard, the model&#39;s ability to reflect the timing and occurrence of AE is akin to the benefits of the acrosome-targeted GFP mouse line7,8,9.
The GCaMP3 variant used in this transgenic mouse line has an approximate KD of 400 &#181;M and a dynamic range for Ca2+ of 10-4-10-3 M10, which is suitable for this vesicle. We showed that this combination of features of GCaMP3 could reveal fusion pore formation between the plasma membrane and the outer acrosomal membrane (OAM)2. The fusion pore detection is a result of the pore size being too small to allow the AcroSensE protein to disperse out of the acrosome (via loss of acrosome content) while providing a membrane &#34;channel&#34; that enables the influx of Ca2+ ions into the acrosome lumen, leading to an increase in fluorescence intensity of the GCaMP3.
The bright, monomeric, non-calcium-sensitive fluorescent protein mCherry supports visualization of the acrosome while the GCaMP3 signal is faint (e.g., prior to Ca2+ binding, Figure 2), and importantly, it also allows for the identification of acrosome-intact sperm cells suitable for imaging.
The following protocol describes the utilization of the unique AcroSensE mouse model and the methods for microscopy used experimentally to study AE and sperm calcium dynamics with high spatial and temporal resolution.

Yazar Spotlight: Fare Sperminde Kalsiyum Sinyalini ve Akrozom Ekzositozunu İncelemek İçin Canlı Hücre Görüntüleme Tekniği 

Canlı fare sperminde akrozomal kalsiyum dinamiği ve ekzositozun gerçek zamanlı görüntülenmesi

Our research goal is to better understand the molecular mechanisms that regulate sperm function, including the processes such as capacitation and fertilization. Specifically, we're exploring how membrane lipids activate calcium signaling and acrosome exocytosis. This protocol addresses the gap in our understanding of the interplay between capacitation, sperm activation, calcium signaling, and acrosome exocytosis.The advantages of this protocol include imaging sperm under physiological conditions, as well as its ability to simultaneously monitor both calcium signaling and acrosome exocytosis without the need for complicated preloading or standing procedures.

Şekil 2 , spermin başarılı bir şekilde uyarılmasını takiben beklenen floresan değişikliklerinin sırasını gösteren basitleştirilmiş bir resim sunmaktadır. Şekil 2'nin üst paneli, sinyalin başlangıçta loş olduğu (temel akrozomal kalsiyum konsantrasyonları GCaMP3 KD'den daha düşüktür) ve kalsiyum iyonlarının füzyon gözeneklerinden girmesi üzerine GCaMP3 floresan yoğunluğundaki değişiklikleri göstermektedir. Son olarak...

Watch this Scientific Journal Video about A Live Cell Imaging Technique to Study Calcium Signaling and Acrosome Exocytosis in Mouse Sperm at JoVE.com

Burada açıklanan AcroSensE fare modeli ve canlı hücre görüntüleme yöntemleri, sperm akrozomunun hücre altı bölmesindeki kalsiyum dinamiklerini ve bunların membran füzyonu ve akrozom ekzositozuna yol açan ara adımları nasıl düzenlediğini incelemek için yeni bir yaklaşım sağlar.

Acrosome exocytosis (AE), in which the sperm&#39;s single exocytotic vesicle fuses with the plasma membrane, is a complex, calcium-dependent process ...

Araştırma hedefimiz, kapasitasyon ve döllenme gibi süreçler de dahil olmak üzere sperm fonksiyonunu düzenleyen moleküler mekanizmaları daha iyi anlamaktır. Spesifik olarak, membran lipidlerinin kalsiyum sinyalini ve akrozom ekzositozunu nasıl aktive ettiğini araştırıyoruz. Bu protokol, kapasitasyon, sperm aktivasyonu, kalsiyum sinyali ve akrozom ekzositozu arasındaki etkileşimi anlamamızdaki boşluğu ele almaktadır.Bu protokolün avantajları arasında, spermin fizyolojik koşullar altında görüntülenmesinin yanı sıra, karmaşık ön yükleme veya ayakta durma prosedürlerine gerek kalmadan hem kalsiyum sinyalini hem de akrozom ekzositozunu aynı anda izleme yeteneği yer alır.

real-time-imaging-acrosomal-calcium-dynamics-exocytosis-live-mouse

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Real-Time Imaging of Acrosomal Calcium Dynamics and Exocytosis in Live Mouse Sperm

681 Görüntüleme.  Cornell University. Araştırma hedefimiz, kapasitasyon ve döllenme gibi süreçler de dahil olmak üzere sperm fonksiyonunu düzenleyen moleküler mekanizmaları daha iyi anlamaktır. Spesifik olarak, membran lipidlerinin kalsiyum sinyalini ve akrozom ekzositozunu nasıl aktive ettiğini araştırıyoruz. Bu protokol, kapasitasyon, sperm aktivasyonu, kalsiyum sinyali ve akrozom ekzositozu arasındaki etkileşimi anlamamızdaki boşluğu ele almaktadır.Bu protokolün avantajları arasında, spermin fizy...