تم دعم هذا العمل من خلال الدعم المالي لصناديق بدء أبحاث الدكتوراه المقدمة من جامعة غرب الصين للمعلمين (رقم 20E059).

1. إعداد قالب الجين PRRSV
<ol><li>قم بإذابة مخزون الفيروس في 1 مل من كاشف استخراج الحمض النووي الريبي (انظر جدول المواد).</li>
	<li>أضف 0.2 مل من الكلوروفورم واخلطه جيدا. احتضان لمدة 3 دقائق.</li>
	<li>يطرد الخليط لمدة 15 دقيقة عند 12000 × جم عند 4 درجات مئوية. ملاحظة: ينقسم الخليط إلى ثلاث مراحل ، وهي مرحلة مائية عديمة اللون ، وطور بيني ، ومرحلة الفينول كلوروفورم الحمراء.</li>
	<li>ماصة التخلص التدريجي المائي عديم اللون ونقله إلى أنبوب جديد.</li>
	<li>امزج الطور المائي جيدا مع 0.5 مل من الأيزوبروبانول واحتضانه لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية.</li>
	<li>جهاز طرد مركزي لمدة 10 دقائق عند 12000 × جم عند 4 درجات مئوية. ملاحظة: يحتوي الجزء السفلي من الأنبوب على راسب RNA أبيض.</li>
	<li>استخدم ماصة صغيرة للتخلص من طاف الأنبوب.</li>
	<li>أضف 1 مل من الإيثانول بنسبة 75٪ لإعادة تعليق الحبيبات والدوامة لفترة وجيزة.</li>
	<li>جهاز طرد مركزي لمدة 5 دقائق عند 7500 × جم عند 4 درجات مئوية. استخدم ماصة صغيرة للتخلص من طاف الأنبوب.</li>
	<li>جفف الحمض النووي الريبي لمدة 5 دقائق ، وأضف 20-50 ميكرولتر من الماء الخالي من RNase لإعادة تعليق الحمض النووي الريبي ، واخلطه جيدا.</li>
	<li>المضي قدما في إجراء النسخ العكسي ؛ قم بإعداد التفاعلات لإجراء النسخ العكسي كما هو موضح في الجدول 1. ملاحظة: لضمان النسخ العكسي الناجح ، استخدم قوالب RNA عالية الجودة.</li>
	<li>استخدم cDNA الناتج لتفاعل البوليميراز المتسلسل أو قم بتخزينه في -20 درجة مئوية.</li>
</ol>2. تصميم التمهيدي PCR
<ol><li>تصميم التمهيدي الأمامي<ol><li>افتح البرنامج واختر ملف DNA جديد.</li>
		<li>الصق تسلسل الجينات PRRSV (GenBank: FJ548852.1) من NCBI في البرنامج. انقر فوق موافق لإنشاء ملفات التسلسل.</li>
		<li>تحليل التسلسل ووضع علامة على تقاطعات الشظية. تصميم التمهيدي تسلسل محدد إلى الأمام من الأجزاء. في معظم الحالات ، تتراوح درجة حرارة الانصهار المفضلة (Tm) بين 55 درجة مئوية و 62 درجة مئوية ، ومحتوى GC هو 40-60٪.</li>
		<li>انقر فوق التمهيدي واختر إضافة التمهيدي.</li>
		<li>الصق التسلسل المحدد وأضف تسلسلات متداخلة من المتجه إلى أول 5 نيوكليوتيدات من التمهيدي للتسلسل المحدد. بالقرب من كل تقاطع ، اختر 20-40 نقطة أساس لتكون بمثابة منطقة تداخل بين الشظيتين المتجاورتين.</li>
		<li>قم بتسمية التمهيدي الأمامي الذي يحتوي على الأجزاء المتدلية والتسلسل المحدد (انظر الشكل التكميلي S1).</li>
		<li>انقر فوق إضافة التمهيدي إلى القالب.</li>
	</ol></li>
	<li>تصميم التمهيدي العكسي<ol><li>تحليل التسلسل ووضع علامة على تقاطعات الأجزاء في البرنامج. تصميم التمهيدي تسلسل محدد عكسي للشظايا.</li>
		<li>انقر فوق التمهيدي واختر إضافة التمهيدي.</li>
		<li>الصق التسلسل المحدد وأضف موقع التقييد إلى أول 5 نوكليوتيدات من التمهيدي للتسلسل المحدد. ملاحظة: يجب أن تكون مواقع التقييد المضافة غائبة عن جزء الإدراج والمتجه باستثناء مواقع الاستنساخ المتعددة.</li>
		<li>أضف 20-40 bp تسلسلات متدلية من المتجهات إلى أول 5 'نيوكليوتيد من موقع التقييد.</li>
		<li>قم بتسمية التمهيدي العكسي الذي يحتوي على الأجزاء المتدلية والتسلسل المحدد (انظر الشكل التكميلي S1).</li>
		<li>انقر فوق إضافة التمهيدي إلى القالب.</li>
	</ol></li>
</ol>3. PCR لتضخيم الشظايا
<ol><li>إعداد ستة تفاعلات تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل الفردية (الجدول 2): بالنسبة للجزء 1 ، استخدم البادئات P1 و P2 (انظر الشكل التكميلي S2) ؛ بالنسبة للجزء 2 ، استخدم البادئات P3 و P4 (انظر الشكل التكميلي S2) ؛ بالنسبة للجزء 3 ، استخدم البادئات P5 و P6 (انظر الشكل التكميلي S2) ؛ بالنسبة للجزء 4 ، استخدم البادئات P7 و P8 (انظر الشكل التكميلي S2) ؛ بالنسبة للجزء 5 ، استخدم الاشعال P9 و P10 ؛ واستخدم البادئات P11 و P12 لتضخيم الجزء 6 (انظر الشكل التكميلي S2). ملاحظة: قم بإذابة كل مكون وخلطه وجهاز طرد مركزي لفترة وجيزة قبل الاستخدام.</li>
	<li>قم بتشغيل PCR باستخدام بروتوكول الخطوات الثلاث في الجدول 2.</li>
	<li>أضف 1 ميكرولتر من المخزن المؤقت لتحميل الحمض النووي 6x إلى 5 ميكرولتر من منتج PCR ، وامزج المحتويات وطردها مركزيا لفترة وجيزة.</li>
	<li>تحليل العينات باستخدام 1 ٪ هلام الاغاروز الكهربائي.</li>
</ol>4. تنقية شظايا PCR
ملاحظة: يعد تنقية منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل من هلام باستخدام مجموعة استخراج الهلام (انظر جدول المواد) أمرا مهما لبناء النواقل.
<ol><li>أضف 9 ميكرولتر من المخزن المؤقت لتحميل الحمض النووي 6x إلى 45 ميكرولتر من منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل ، وامزج المحتويات وطردها لفترة وجيزة.</li>
	<li>أداء 1 ٪ هلام الأغاروز / goldview الكهربائي لفصل شظايا الحمض النووي. ملاحظة: لا تقم بإعادة استخدام المخزن المؤقت لتشغيل TAE لأن قيمة الأس الهيدروجيني الخاصة به ستؤثر على استعادة جزء الحمض النووي.</li>
	<li>عند الفصل الكافي للعصابات ، استخدم مشرطا حادا لاستئصال أشرطة الحمض النووي بعناية. ملاحظة: قلل من حجم شريحة الجل عن طريق تقليم الأغاروز الزائد.</li>
	<li>قم بوزن شريحة الهلام في أنبوب طرد مركزي دقيق نظيف سعة 1.5 مل ، وأضف حجما متساويا من المخزن المؤقت للربط إلى شريحة الهلام (على سبيل المثال ، 0.3 مل إلى شريحة 0.3 جم) ، واحتضانها عند 60 درجة مئوية لمدة 7 دقائق.</li>
	<li>أدخل عمودا صغيرا في أنبوب تجميع سعة 2 مل. أضف 700 ميكرولتر من محلول الحمض النووي / الأغاروز من الخطوة 4.4 إلى العمود المصغر.</li>
	<li>أجهزة الطرد المركزي في 10000 × غرام لمدة 1 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. تخلص من المرشح وأعد استخدام أنبوب التجميع.</li>
	<li>أضف 300 ميكرولتر من عازلة الربط وأجهزة الطرد المركزي عند 13000 × جم لمدة 1 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. تخلص من المرشح وأعد استخدام أنبوب التجميع.</li>
	<li>أضف 700 ميكرولتر من المخزن المؤقت للغسيل وأجهزة الطرد المركزي عند 13000 × جم لمدة 1 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. تخلص من المرشح وأعد استخدام أنبوب التجميع.</li>
	<li>أدر العمود الصغير الفارغ لمدة 2 دقيقة بأقصى سرعة لتجفيف مصفوفة العمود. ضع العمود الصغير في أنبوب طرد مركزي صغير نظيف سعة 1.5 مل.</li>
	<li>أضف 20 ميكرولتر من الماء منزوع الأيونات مباشرة إلى مركز غشاء العمود واتركه في درجة حرارة الغرفة لمدة دقيقتين. أجهزة الطرد المركزي بسرعة 13000 × غرام لمدة 1 دقيقة.</li>
	<li>قم بتخزين الحمض النووي في -20 درجة مئوية.</li>
</ol>5. إعداد ناقل خطي
ملاحظة: بعد تحضير البلازميد ، يمكن استخدام الإنزيمات المختارة لقطعه. الهضم الطويل أو هضم الإنزيم المزدوج أمر بالغ الأهمية لضمان هضم جميع الحمض النووي. سيؤدي ذلك إلى تقليل عدد المستنسخة الإيجابية الكاذبة في التجارب اللاحقة.
<ol><li>pVAX1 الخطي
	<ol><li>تحضير خليط التفاعل في درجة حرارة الغرفة بالترتيب الموضح (الجدول 3). ملاحظة: يجب إضافة حجم الماء للحفاظ على حجم التفاعل الكلي المشار إليه. هنا ، تم هضم 1 ميكروغرام من البلازميد مع الإنزيمات في خليط التفاعل. اعتمادا على تركيز البلازميد ، يمكن ضبط حجم البلازميد في خليط التفاعل.</li>
		<li>تخلط بلطف. ثم تدور لأسفل. احتضان في 37 درجة مئوية في كتلة حرارة أو ترموستات الماء لمدة 60 دقيقة.</li>
		<li>قم بإجراء تنقية الجل على غرار تنقية شظايا تفاعل البوليميراز المتسلسل في القسم 4 باستخدام مجموعة استخراج الجل (انظر جدول المواد).</li>
	</ol></li>
	<li>pVAX1-F1 الخطي ملاحظة: pVAX1-F1 هو المتجه الذي تم الحصول عليه من الجولة الأولى من pVAX1 (NdeI و HindIII) وإعادة تركيب الجزء 1. pVAX1-F2 هو المتجه الذي تم الحصول عليه من جولة pVAX1-F1 (NdeI) وإعادة تركيب الجزء 2. pVAX1-F3 هو المتجه الذي تم الحصول عليه من جولة pVAX1-F2 (NdeI) وإعادة تركيب الجزء 3. pVAX1-F4 هو المتجه الذي تم الحصول عليه من جولة pVAX1-F3 (NdeI) وإعادة تركيب الجزء 4. pVAX1-F5 هو المتجه الذي تم الحصول عليه من جولة pVAX1-F4 (EcoRV و NtoI) وإعادة تركيب الجزء 5.<ol><li>لكل متجه ، تحضير خليط التفاعل بشكل منفصل في درجة حرارة الغرفة بالترتيب الموضح (الجدول 3).</li>
		<li>تخلط بلطف. ثم تدور لأسفل. احتضان في 37 درجة مئوية في كتلة حرارة أو ترموستات الماء لمدة 60 دقيقة.</li>
		<li>قم بإجراء تنقية الجل على غرار تنقية شظايا تفاعل البوليميراز المتسلسل في القسم 4 باستخدام مجموعة استخراج الجل (انظر جدول المواد).</li>
	</ol></li>
</ol>6. الاستنساخ الفرعي إلى متجه جديد
ملاحظة: يمكن تحقيق كفاءة استنساخ جيدة عند استخدام 50-200 نانوغرام من المتجهات والإدخالات.
<ol><li>قم بإعداد تفاعل الاستنساخ والتجميع السلس ل ExonArt (الجدول 4). اضبط حجم التفاعل الكلي على 10 ميكرولتر باستخدام H2O منزوع الأيونات المعقم واخلطه.</li>
	<li>احتضان التفاعل في دورة حرارية لمدة 15-60 دقيقة عند 50 درجة مئوية. تخزين العينات على الجليد. ملاحظة: قد يؤدي تمديد الحضانة حتى 60 دقيقة إلى تحسين كفاءة التجميع.</li>
	<li>ذوبان DH5α الخلايا المختصة كيميائيا على الجليد.</li>
	<li>إضافة 10 ميكرولتر من منتج التجميع إلى الخلايا المختصة ؛ ثم اخلطي برفق عن طريق السحب لأعلى ولأسفل.</li>
	<li>ضع الخليط على الثلج لمدة 30 دقيقة.</li>
	<li>صدمة حرارية عند 45 درجة مئوية لمدة 45 ثانية ونقل الأنابيب على الجليد لمدة 3 دقائق.</li>
	<li>أضف 900 ميكرولتر من وسيط SOC إلى الأنبوب.</li>
	<li>هز الأنبوب عند 225 دورة في الدقيقة لمدة 1 ساعة في حاضنة اهتزاز 37 درجة مئوية.</li>
	<li>الطرد المركزي رد فعل التحول في 6000 × غرام لمدة 2 دقيقة. تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق الخلايا في 100 ميكرولتر من وسط SOC الطازج.</li>
	<li>انشر معلق الخلية المحولة على لوحة LB منفصلة مع 50 ميكروغرام / مل كاناميسين.</li>
	<li>احتضان جميع الأطباق طوال الليل على درجة حرارة 37 درجة مئوية. اختر مستعمرات فردية معزولة من كل لوحة تجريبية.</li>
</ol>7. تحليل المحولات
<ol><li>اختر ثماني مستعمرات في 20 ميكرولتر من وسط LB يحتوي على 50 ميكروغرام / مل كاناميسين.</li>
	<li>قم بإعداد تفاعل PCR للمستعمرة وقم بتشغيل PCR (الجدول 5). ملاحظة: بالنسبة لتفاعل تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل للمستعمرة للجزء 1 ، استخدم البادئات P1 و P2 (انظر الملف التكميلي 1) ؛ بالنسبة للجزء 2 ، استخدم البادئين P3 و P4 (انظر الملف التكميلي 1) ؛ بالنسبة للجزء 3 ، استخدم البادئين P5 و P6 (انظر الملف التكميلي 1) ؛ بالنسبة للجزء 4 ، استخدم البادئات P7 و P8 (انظر الشكل التكميلي S2) ؛ بالنسبة للجزء 5 ، استخدم الاشعال P9 و P10 ؛ واستخدم البادئات P11 و P12 للكشف عن الجزء 6 (انظر الشكل التكميلي S2).</li>
	<li>أضف 1 ميكرولتر من المخزن المؤقت لتحميل الحمض النووي 6x إلى 5 ميكرولتر من منتج PCR ، وامزج المحتويات وطردها لفترة وجيزة.</li>
	<li>تحليل النتائج باستخدام 1 ٪ هلام الاغاروز الكهربائي.</li>
	<li>اختر مستعمرة موجبة واحدة في 5 مل من وسط LB يحتوي على 50 ميكروغرام / مل كاناميسين وتنمو بين عشية وضحاها عند 37 درجة مئوية.</li>
	<li>احصل على البلازميد باستخدام مجموعة مصغرة من الحمض النووي البلازميد (انظر جدول المواد) وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.</li>
	<li>تصور النتائج باستخدام 1 ٪ هلام الأغاروز الكهربائي.</li>
</ol>

استنساخ جين PRRSV كامل الطول في متجه التعبير pVAX1

<ol>
	<li>Lessard, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+cloning.">Molecular cloning.</a> Methods Enzymol. 529, 85-98 (2013).</li><li>Shetty, R. P., Endy, D., Knight, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+BioBrick+vectors+from+BioBrick+parts.">Engineering BioBrick vectors from BioBrick parts.</a> J. Biol. Eng. 2, 5 (2008).</li><li>Horton, R. M., Cai, Z. L., Ho, S. N., Pease, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+splicing+by+overlap+extension:+tailor-made+genes+using+the+polymerase+chain+reaction.">Gene splicing by overlap extension: tailor-made genes using the polymerase chain reaction.</a> Biotechniques. 54 (3), 129-133 (2013).</li><li>Horton, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PCR-mediated+recombination+and+mutagenesis.+SOEing+together+tailor-made+genes.">PCR-mediated recombination and mutagenesis. SOEing together tailor-made genes.</a> Mol Biotechnol. 3 (2), 93-99 (1995).</li><li>Bang, D., Church, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+synthesis+by+circular+assembly+amplification.">Gene synthesis by circular assembly amplification.</a> Nat. Methods. 5 (1), 37-39 (2008).</li><li>Geu-Flores, F., Nour-Eldin, H. H., Nielsen, M. T., Halkier, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=USER+fusion:+a+rapid+and+efficient+method+for+simultaneous+fusion+and+cloning+of+multiple+PCR+products.">USER fusion: a rapid and efficient method for simultaneous fusion and cloning of multiple PCR products.</a> Nucleic Acids Res. 35 (7), e55 (2007).</li><li>Gibson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+assembly+of+overlapping+DNA+fragments.">Enzymatic assembly of overlapping DNA fragments.</a> Methods Enzymol. 498, 349-361 (2011).</li><li>Gibson, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+assembly+of+DNA+molecules+up+to+several+hundred+kilobases.">Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases.</a> Nat Methods. 6 (5), 343-345 (2009).</li><li>Cho, J. G., Dee, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Porcine+reproductive+and+respiratory+syndrome+virus.">Porcine reproductive and respiratory syndrome virus.</a> Theriogenology. 66 (3), 655-662 (2006).</li><li>Holtkamp, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+the+economic+impact+of+porcine+reproductive+and+respiratory+syndrome+virus+on+United+States+pork+producers.">Assessment of the economic impact of porcine reproductive and respiratory syndrome virus on United States pork producers.</a> J. Swine Health Prod. 21, 72-84 (2013).</li><li>Thomann, B., Rushton, J., Schuepbach-Regula, G., Nathues, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+economic+effects+of+vaccination+against+porcine+reproductive+and+respiratory+syndrome:+Impact+of+vaccination+effectiveness,+vaccine+price,+and+vaccination+coverage.">Modeling economic effects of vaccination against porcine reproductive and respiratory syndrome: Impact of vaccination effectiveness, vaccine price, and vaccination coverage.</a> Front Vet Sci. 7, 500 (2020).</li><li>Dwivedi, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+immune+responses+to+porcine+reproductive+and+respiratory+syndrome+virus+in+pigs+during+early+stage+of+infection+under+farm+conditions.">Evaluation of immune responses to porcine reproductive and respiratory syndrome virus in pigs during early stage of infection under farm conditions.</a> Virol J. 9, 45 (2012).</li><li>Mengeling, W. L., Lager, K. M., Vorwald, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+consequences+of+exposing+pregnant+gilts+to+strains+of+porcine+reproductive+and+respiratory+syndrome+(PRRS)+virus+isolated+from+field+cases+of+&amp;#34;atypical&amp;#34+PRRS.">Clinical consequences of exposing pregnant gilts to strains of porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS) virus isolated from field cases of &amp;#34;atypical&amp;#34 PRRS.</a> Am. J. Vet. Res. 59 (12), 1540-1544 (1998).</li><li>Dee, S. A., Joo, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevention+of+the+spread+of+porcine+reproductive+and+respiratory+syndrome+virus+in+endemically+infected+pig+herds+by+nursery+depopulation.">Prevention of the spread of porcine reproductive and respiratory syndrome virus in endemically infected pig herds by nursery depopulation.</a> Vet Rec. 135 (1), 6-9 (1994).</li><li>Dee, S. A., Joo, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategies+to+control+PRRS:+a+summary+of+field+and+research+experiences.">Strategies to control PRRS: a summary of field and research experiences.</a> Vet Microbiol. 55 (1-4), 347-343 (1997).</li><li>Renukaradhya, G. J., Meng, X. J., Calvert, J. G., Roof, M., Lager, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+porcine+reproductive+and+respiratory+syndrome+virus+vaccines:+Current+status+and+future+direction.">Live porcine reproductive and respiratory syndrome virus vaccines: Current status and future direction.</a> Vaccine. 33 (33), 4069-4080 (2015).</li><li>Conzelmann, K. K., Visser, N., Woensel, P. V., Thiel, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+characterization+of+porcine+reproductive+and+respiratory+syndrome+virus,+a+member+of+the+arterivirus+group.">Molecular characterization of porcine reproductive and respiratory syndrome virus, a member of the arterivirus group.</a> Virology. 193 (1), 329-339 (1993).</li><li>Han, M. Y., Yoo, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+the+PRRS+virus+genome:+Updates+and+perspectives.">Engineering the PRRS virus genome: Updates and perspectives.</a> Vet Microbiol. 174 (3), 279-295 (2014).</li><li>Bryksin, A. V., Matsumura, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overlap+extension+PCR+cloning:+a+simple+and+reliable+way+to+create+recombinant+plasmids.">Overlap extension PCR cloning: a simple and reliable way to create recombinant plasmids.</a> Biotechniques. 48 (6), 463-465 (2010).</li><li>Wang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Restriction-based+multiple-fragment+assembly+strategy+to+avoid+random+mutation+during+long+cDNA+cloning.">Restriction-based multiple-fragment assembly strategy to avoid random mutation during long cDNA cloning.</a> J Cancer. 6 (7), 632-635 (2015).</li><li>Zhang, Z. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+economic+impact+of+porcine+reproductive+and+respiratory+syndrome+outbreak+in+four+Chinese+farms:+Based+on+cost+and+revenue+analysis.">The economic impact of porcine reproductive and respiratory syndrome outbreak in four Chinese farms: Based on cost and revenue analysis.</a> Front Vet Sci. 9, 1024720 (2022).</li><li>Chen, N. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+genetic+diversity+of+Chinese+porcine+reproductive+and+respiratory+syndrome+viruses+from+2016+to+2019.">High genetic diversity of Chinese porcine reproductive and respiratory syndrome viruses from 2016 to 2019.</a> Res Vet Sci. 131, 38-42 (2020).</li><li>Wang, X. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salidroside,+a+phenyl+ethanol+glycoside+from+Rhodiola+crenulata,+orchestrates+hypoxic+mitochondrial+dynamics+homeostasis+by+stimulating+Sirt1/p53/Drp1+signaling.">Salidroside, a phenyl ethanol glycoside from Rhodiola crenulata, orchestrates hypoxic mitochondrial dynamics homeostasis by stimulating Sirt1/p53/Drp1 signaling.</a> J Ethnopharmacol. 293, 115278 (2022).</li><li>Hou, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salidroside+intensifies+mitochondrial+function+of+CoCl2-damaged+HT22+cells+by+stimulating+PI3K-AKT-MAPK+signaling+pathway.">Salidroside intensifies mitochondrial function of CoCl2-damaged HT22 cells by stimulating PI3K-AKT-MAPK signaling pathway.</a> Phytomedicine. 109, 154568 (2023).</li><li>Zhang, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+an+infectious+clone+of+HuN4-F112,+an+attenuated+live+vaccine+strain+of+porcine+reproductive+and+respiratory+syndrome+virus+high+copy+plasmid.">Generation of an infectious clone of HuN4-F112, an attenuated live vaccine strain of porcine reproductive and respiratory syndrome virus high copy plasmid.</a> Virol J. 8, 410 (2011).</li><li>Ni, Y. Y., Huang, Y. W., Cao, D. J., Opriessnig, T., Meng, X. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+a+DNA-launched+infectious+clone+for+a+highly+pneumovirulent+strain+of+type+2+porcine+reproductive+and+respiratory+syndrome+virus:+identification+and+in+vitro+and+in+vivo+characterization+of+a+large+spontaneous+deletion+in+the+nsp2+region.">Establishment of a DNA-launched infectious clone for a highly pneumovirulent strain of type 2 porcine reproductive and respiratory syndrome virus: identification and in vitro and in vivo characterization of a large spontaneous deletion in the nsp2 region.</a> Virus Res. 160 (1-2), 264-273 (2011).</li></ol>

يعلن أصحاب البلاغ عدم وجود تضارب في المصالح.

تقنية تجميع جيبسون هي طريقة استنساخ جزيئي قائمة على إعادة التركيب في المختبر لتجميع شظايا الحمض النووي8. تتيح هذه الطريقة تجميع شظايا متعددة من الحمض النووي في بلازميد دائري في تفاعل متساوي الحرارة أحادي الأنبوب. ومع ذلك ، فإن إحدى العقبات التي تحول دون تقنية Gibson Assembly هي ...

كتقنية أساسية لبناء أدوات تجريبية قائمة على الحمض النووي للتعبير في الخلايا بدائية النواة وحقيقية النواة ، يعد الاستنساخ الجزيئي مكونا مهما جدا في البيولوجيا التجريبية. يتضمن الاستنساخ الجزيئي أربع عمليات: الحصول على الحمض النووي المدرج ، وربط الإدخال في الناقل المناسب ، وتحويل الناقل المؤتلف إلى الإشريكية القولونية (E. coli) ، وتحديد المستنسخات الموجبة1. حتى الآن ، تم اعتماد طرق متعددة للانضمام إلى جزيئات الحمض النووي باستخدام إنزيمات التقييد 2,3 وإعادة التركيب بوساطة تفاعل البوليميراز المتسلسل 4,5,6. إعادة التركيب المتماثل ، والمعروفة باسم تقنية الاستنساخ غير الملحومة ، هي مجموعة من طرق الاستنساخ ، والتي تسمح بإدخال جزء أو أكثر من أجزاء الحمض النووي في ناقل مستقل عن التسلسل وبدون ندوب. تتضمن هذه التقنية الاستنساخ المستقل عن التسلسل والربط (SLIC) ، ومستخلص استنساخ الربط السلس (SLiCE) ، و In-Fusion ، و Gibson Assembly. يستخدم إكسونوكلياز لتحلل حبلا واحدا من الإدخال ومتجها لتوليد نهايات متماسكة ، وإما في إصلاح الجسم الحي أو في إعادة التركيب في المختبر لربط الإدخال تساهميا بالناقل عن طريق تكوين روابط فوسفاتية ثنائية الإستر. تعد القدرة على ربط إدراج واحد بناقل في أي تسلسل دون أي ندوب أمرا جذابا للغاية. علاوة على ذلك ، تتمتع التكنولوجيا بالقدرة على ربط 5-10 أجزاء بترتيب محدد مسبقا دون قيود على التسلسل.
باعتبارها واحدة من العديد من تقنيات الحمض النووي المؤتلف ، فإن تقنية Gibson Assembly ، وهي حاليا أكثر طرق الاستنساخ فعالية 7,8 ، هي طريقة قوية وأنيقة قائمة على exonuclease لتجميع جزء واحد أو عدة أجزاء من الحمض النووي الخطي بسلاسة. يتم إجراء تفاعل Gibson Assembly تحت ظروف متساوية الحرارة باستخدام خليط من ثلاثة إنزيمات ، وهي 5 'exonuclease ، و polymerase عالي الدقة ، و ligase DNA قابل للحرارة. تساهم الأجزاء المتدلية أحادية الخيط 3 بوصات التي تم إنشاؤها بواسطة exonuclease 5'-3 في تلدين الأجزاء التي تشترك في التكامل في أحد طرفيها. يملأ إنزيم البوليميراز عالي الدقة الفجوات في المناطق أحادية الشريط الملدنة بشكل فعال عن طريق إضافة dNTPs ، ويقوم إنزيم ربط الحمض النووي القابل للحرارة بإغلاق الشقوق لتشكيل جزيئات الحمض النووي المشتركة8. ومن ثم ، فقد تم استخدام هذه الطريقة التقنية على نطاق واسع لبناء ناقلات التعبير الجيني.
متلازمة الخنازير التناسلية والجهاز التنفسي (PRRS) هي مرض فيروسي يؤدي إلى ضعف تناسلي وفشل تنفسي في الخنازير بسبب PRRSV في أي عمر9. تتجلى المتلازمة في الحمى وفقدان الشهية والالتهاب الرئوي والخمول والاكتئاب وضيق التنفس. علاوة على ذلك ، لوحظت علامات سريرية ، بما في ذلك تغير لون الأذنين باللون الأحمر / الأزرق ، في بعض الأوبئة. كعضو في عائلة فيروس الشرايين ، ينتقل PRRSV على نطاق واسع إلى البلدان المنتجة لحم الخنزير عن طريق الاتصال المباشر وتبادل السوائل ، بما في ذلك البول واللبأ واللعاب. بسبب انتشار PRRSV في الولايات المتحدة ، قدرت الخسائر الاقتصادية الإجمالية لصناعة لحم الخنزير بحوالي 664 مليون دولار سنويا ، بناء على حجم تكاثر 5.8 مليون بذر و 110 مليون خنزير10,11. يظهر تقرير خدمة فحص صحة الحيوان والنبات أن 49.8٪ من الخنازير غير المحصنة تظهر وجود PRRSV في المصل12 وأن المستويات المنخفضة من PRRSV في الخنازير المصابة تفرز من خلال اللعاب وإفرازات الأنف والبول والبراز13. تم تنفيذ استراتيجيات متعددة للسيطرة على انتشار PRRSV14،15،16. بالإضافة إلى إجراءات التخلص من السكان غير الراضين تماما عن الفيروس أو تحسين السلامة البيولوجية وإدارتها ، فإن إعطاء اللقاحات هو وسيلة فعالة للسيطرة على PRRS.
PRRSV هو فيروس RNA مغلف ، مفرد تقطعت به السبل ، ذو إحساس إيجابي يبلغ طوله حوالي 15 كيلو قاعدة (kb). يتكون جينوم PRRSV من 10 إطارات قراءة مفتوحة على الأقل (ORFs) ، ومنطقة قصيرة غير مترجمة 5 بوصات (5 'UTR) ، وذيل بولي (A) عند النهاية 3 '(الشكل 1A) 17. جينوم فيروس الحمض النووي الريبي السلبي الذي تقطعت به السبل غير معدي في حين أن الجينوم من فيروسات الحمض النووي الريبي الموجبة التي تقطعت بها السبل معدي. هناك استراتيجيتان رئيسيتان لنقل الحمض النووي الريبي والحمض النووي لتوليد ذرية الفيروس18. ومع ذلك ، فإن استنساخ الجزء الكامل الطول المقابل لجينوم الحمض النووي الريبي أمر بالغ الأهمية لبناء المستنسخة المعدية. نظرا للطبيعة الطويلة والمعقدة لجينوم PRRSV ، لا يمكن الحصول على الجينوم الكامل الطول بسهولة من خلال تفاعل البوليميراز المتسلسل مرة واحدة. بالإضافة إلى ذلك ، على الرغم من أن التوليف الاصطناعي لجينات PRRSV هو حل فعال ، إلا أن تخليق الشظايا الطويلة غالبا ما يكون مكلفا. ومن ثم ، للحصول على متجه التعبير الكامل PRRSV ، حاولنا إنشائه بواسطة طريقة إعادة التركيب المتماثل للإدخالات المتعددة19,20. لسوء الحظ ، لم نتمكن من الحصول على ناقل التعبير الجيني كامل الطول. لذلك ، في هذه الدراسة ، أضفنا مواقع تقييد مناسبة إلى التمهيدي العكسي وحصلنا بنجاح على متجه التعبير pVAX1-PRRSV من خلال عدة جولات من تفاعلات إعادة التركيب المتماثلة. علاوة على ذلك ، يمكن لهذه الطريقة أيضا تحقيق حذف أو طفرة في الجينات المستهدفة وربط عدد كبير من شظايا الحمض النووي بكفاءة بناقل التعبير.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 kb plus DNA Ladder</td>
			<td>Tiangen Biochemical Technology (Beijing) Co., Ltd</td>
			<td>MD113-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2x Universal Green PCR Master Mix</td>
			<td>Rong Wei Gene Biotechnology Co., Ltd</td>
			<td>A303-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.</td>
			<td>9012-36-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop Microcentrifuge</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific&#160; Co., Ltd</td>
			<td>FRESCO17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clean Bench</td>
			<td>Sujing Antai Air Technology&#160; Co., Ltd</td>
			<td>VD-650-U</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA Electrophoresis Equipment</td>
			<td>Cleaver Scientific&#160; Co., Ltd</td>
			<td>170905117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA Loading Buffer (6x)</td>
			<td>Biosharp Biotechnology Co., Ltd</td>
			<td>BL532A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. Z. N. A. Gel Extraction kit</td>
			<td>Omega Bio-Tek Co., Ltd</td>
			<td>D2500-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E.Z.N.A. Plasmid DNA Mini Kit I</td>
			<td>Omega Bio-Tek Co., Ltd</td>
			<td>D6943-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electro-heating Standing-temperature Cultivator</td>
			<td>Shanghai Hengyi Scientific Instrument Co., Ltd</td>
			<td>DHP-9082</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ExonArt Seamless Cloning and Assembly kit</td>
			<td>Rong Wei Gene Biotechnology Co., Ltd</td>
			<td>A101-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ExonScript RT SuperMix with dsDNase</td>
			<td>Rong Wei Gene Biotechnology Co., Ltd</td>
			<td>A502-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FastDigest Eco321 (EcoRV)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific&#160; Co., Ltd</td>
			<td>FD0303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FastDigest HindIII</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific&#160; Co., Ltd</td>
			<td>FD0504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FastDigest NheI</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific&#160; Co., Ltd</td>
			<td>FD0974</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FastDigest NotI</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific&#160; Co., Ltd</td>
			<td>FD0596</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel Doc XR</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories Co., Ltd</td>
			<td>721BR07925</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goldview Nucleic Acid Gel Stain</td>
			<td>Shanghai Yubo Biotechnology Co., Ltd</td>
			<td>YB10201ES03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice Maker Machine</td>
			<td>Shanghai Bilang Instrument Manufacturing Co., Ltd</td>
			<td>FMB100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Invitrogen Platinum SuperFi II DNA Polymerase</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific&#160; Co., Ltd</td>
			<td>12361010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Agar Plate (Kanamycin)</td>
			<td>Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.</td>
			<td>B530113-0010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB sterile liquid medium (Kanamycin)</td>
			<td>Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.</td>
			<td>B540113-0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipettors</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific&#160; Co., Ltd</td>
			<td>&#8212;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microwave Oven</td>
			<td>Panasonic Electric (China) Co., Ltd</td>
			<td>NN-GM333W</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital Shakers</td>
			<td>Shanghai Zhicheng Analytical Instrument Manufacturing Co., Ltd</td>
			<td>ZHWY-2102C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PRRSV virus</td>
			<td>Sichuan Agricultural University</td>
			<td>&#8212;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SnapGene</td>
			<td>GSL Biotech, LLC</td>
			<td>v5.1</td>
			<td>To design primers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T100 PCR Gradient Thermal Cycler</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories&#160; Co., Ltd</td>
			<td>T100 Thermal Cycler</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TAE buffer</td>
			<td>Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.</td>
			<td>B040123-0010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol Reagent</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific&#160; Co., Ltd</td>
			<td>15596026</td>
			<td>RNA extraction reagent</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a seamless cloning approach for porcine reproductive and respiratory syndrome virus expression vector construction

يعد بناء ناقلات التعبير الجيني مكونا مهما للعمل المختبري في علم الأحياء التجريبي. مع التطورات التقنية مثل Gibson Assembly ، يصبح بناء المتجهات بسيطا وفعالا نسبيا. ومع ذلك ، عندما لا يمكن تضخيم الجينوم الكامل لفيروس متلازمة الخنازير التناسلية والجهاز التنفسي (PRRSV) بسهولة عن طريق تفاعل بوليميراز متسلسل واحد (PCR) من cDNA ، أو يكون من الصعب الحصول على ناقل تعبير جيني كامل الطول عن طريق إعادة التركيب المتماثل لإدخالات متعددة في المختبر ، فإن تقنية Gibson Assembly الحالية تفشل في تحقيق هذا الهدف.
وبالتالي ، فإننا نهدف إلى تقسيم جينوم PRRSV إلى عدة أجزاء وإدخال مواقع تقييد مناسبة في التمهيدي العكسي للحصول على شظايا مضخمة من تفاعل البوليميراز المتسلسل. بعد انضمام جزء الحمض النووي السابق إلى الناقل بواسطة تقنية إعادة التركيب المتماثل ، اكتسب الناقل الجديد موقع انقسام إنزيم التقييد. ومن ثم، يمكننا تحويل المتجه خطيا باستخدام موقع انشقاق الإنزيم المضاف حديثا، وإدخال جزء الحمض النووي (DNA) التالي في اتجاه مجرى جزء الحمض النووي (DNA) في المنبع.
سيتم القضاء على موقع انقسام إنزيم التقييد الذي تم إدخاله في نهاية 3 'من جزء الحمض النووي المنبع ، وسيتم إدخال موقع انشقاق جديد في نهاية 3 'من جزء الحمض النووي في المصب. بهذه الطريقة، يمكننا ربط أجزاء الحمض النووي (DNA) بالمتجه واحدا تلو الآخر. هذه الطريقة قابلة للتطبيق لبناء متجه تعبير PRRSV بنجاح وهي طريقة فعالة لتجميع عدد كبير من الأجزاء في متجه التعبير.

As an essential technique to construct DNA-based experimental tools for expression in prokaryotic and eukaryotic cells, molecular cloning is a very important component of experimental biology. Molecular cloning involves four processes: the acquisition of insert DNA, ligation of the insert into the appropriate vector, transformation of the recombinant vector into Escherichia coli (E. coli), and identification of the positive clones1. So far, multiple methods have been adopted for joining DNA molecules by using restriction enzymes2,3 and PCR-mediated recombination4,5,6. Homologous recombination, known as seamless cloning technology, is the group of cloning methods, which allows sequence-independent and scarless insertion of one or more fragments of DNA into a vector. This technology includes sequence- and ligation-independent cloning (SLIC), Seamless Ligation Cloning Extract (SLiCE), In-Fusion, and Gibson Assembly. It employs an exonuclease to degrade one strand of the insert and a vector to generate cohesive ends, and either in vivo repair or in vitro recombination to covalently join the insert to the vector by forming phosphodiester bonds. The ability to join a single insert to a vector at any sequence without any scars is very appealing. Furthermore, the technology has the ability to join 5-10 fragments in a predetermined order without sequence restrictions.
As one of many recombinant DNA techniques, the Gibson Assembly technique, currently the most effective cloning method7,8, is a robust and elegant exonuclease-based method to assemble one or multiple linearized DNA fragments seamlessly. The Gibson Assembly reaction is performed under isothermal conditions using a mixture of three enzymes,namely, 5&#39; exonuclease, high-fidelity polymerase, and a thermostable DNA ligase. Single-strand 3&#180; overhangs created by the 5&#39;-3&#39; exonuclease contribute to the annealing of fragments that share complementarity at one end. The high-fidelity polymerase effectively fills the gaps in the annealed single-strand regions by adding dNTPs, and the thermostable DNA ligase seals the nicks to form joint DNA molecules8. Hence, this technical method has been widely used for the construction of gene expression vectors.
Porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS) is a viral disease that leads to reproductive impairment and respiratory failure in pigs caused by PRRSV at any age9. The syndrome is manifested as fever, anorexia, pneumonia, lethargy, depression, and respiratory distress. Moreover, clinical signs, including red/blue discoloration of the ears, have been observed in some epidemics. As a member of the family arterivirus, PRRSV is widely transmitted to pork-producing countries by direct contact and exchange of fluids, including urine, colostrum, and saliva. Due to the spread of PRRSV in the United States, the total economic losses of the pork industry have been estimated to be approximately $664 million per year, based on the breeding scale of 5.8 million sows and 110 million pigs10,11. The Animal and Plant Health Inspection Service report shows that 49.8% of unvaccinated pigs show the presence of PRRSV in serum12 and low levels of PRRSV in infected pigs are excreted through saliva, nasal secretions, urine, and feces13. Multiple strategies have been implemented to control PRRSV propagation14,15,16. In addition to elimination procedures to create completely virus-negative populations or improving biosafety and management, administering vaccines is an effective means of controlling PRRS.
PRRSV is an enveloped, single-stranded, positive-sense RNA virus with a length of approximately 15 kilobases (kb). The PRRSV genome consists of at least 10 open reading frames (ORFs), a short 5&#39; untranslated region (5&#39; UTR), and a poly(A) tail at the 3&#39; terminus (Figure 1A)17. The genome of a negative-stranded RNA virus is non-infectious whereas the genome from positive-stranded RNA viruses is infectious. There are two main strategies for RNA and DNA transfection for generating virus progeny18. However, cloning the full-length fragment corresponding to the RNA genome is crucial for the construction of infectious clones. Due to the long and complex nature of the PRRSV genome, the full-length genome cannot be easily obtained through PCR at once. Additionally, although the artificial synthesis of PRRSV genes is an effective solution, the synthesis of long fragments is often expensive. Hence, to obtain the PRRSV full-length expression vector, we attempted to create it by the multiple inserts homologous recombination method19,20. Unfortunately, we were not able to obtain the full-length gene expression vector. Therefore, in this study, we added appropriate restriction sites to the reverse primer and successfully obtained the pVAX1-PRRSV expression vector by several rounds of homologous recombination reactions. Furthermore, this method can also achieve deletion or mutation of target genes and efficiently join a large number of DNA fragments to the expression vector.

تسليط الضوء على المؤلف: استكشاف تقنيات الاستنساخ لشظايا الحمض النووي كاملة الطول

نهج الاستنساخ السلس لبناء ناقل تعبير فيروس التكاثر الخنزير والجهاز التنفسي

This protocol demonstrates the construction of a lengthy and intricate gene expression vector. When a full-length DNA fragment cannot be obtained by a single PCR from cDNA, or the full-length gene expression vector cannot be obtained by multiple-insert homologous recombination in vitro, this method is applicable. Currently, multiple-insert ligation cloning is used to obtain full-length DNA fragment for cloning into a suitable vector.This method can achieve deletion or mutation of target genes and efficiently join a large number of DNA fragments to the expression vector.

في هذه الورقة ، نقدم نظام إعادة التركيب في المختبر لتجميع وإصلاح جزيئات الحمض النووي المتداخلة باستخدام التمهيدي العكسي عبر مواقع التقييد التي يتم إدخالها باستمرار (الشكل 1 ب). هذا النظام هو إجراء بسيط وفعال يشمل إعداد المتجه الخطي وشظايا الإدراج التي تحتوي على نتوءا?...

هنا ، نقدم بروتوكولا للحصول على متجه التعبير pVAX1-PRRSV من خلال إدخال مواقع تقييد مناسبة في نهاية 3 'من الإدراجات. يمكننا كتابة المتجه خطيا وربط أجزاء الحمض النووي (DNA) بالمتجه واحدا تلو الآخر من خلال تقنية إعادة التركيب المتماثل.

The construction of gene expression vectors is an important component of laboratory work in experimental biology. With technical advancements like Gibson ...

يوضح هذا البروتوكول بناء ناقل تعبير جيني طويل ومعقد. عندما لا يمكن الحصول على جزء كامل من الحمض النووي بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل واحد من cDNA ، أو لا يمكن الحصول على ناقل التعبير الجيني كامل الطول عن طريق إعادة التركيب المتماثل متعدد الإدراج في المختبر ، فإن هذه الطريقة قابلة للتطبيق. وفي الوقت الراهن، يستخدم الاستنساخ المتعدد الوصلات للحصول على جزء كامل الطول من الحمض النووي لاستنساخه في ناقل مناسب.يمكن لهذه الطريقة تحقيق حذف أو طفرة في الجينات المستهدفة وربط عدد كبير من شظايا الحمض النووي بكفاءة بناقل التعبير.

a-seamless-cloning-approach-for-porcine-reproductive-respiratory

Research

JoVE Journal

Biology

A Seamless Cloning Approach for Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus Expression Vector Construction

348 Views.  China West Normal University. يوضح هذا البروتوكول بناء ناقل تعبير جيني طويل ومعقد. عندما لا يمكن الحصول على جزء كامل من الحمض النووي بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل واحد من cDNA ، أو لا يمكن الحصول على ناقل التعبير الجيني كامل الطول عن طريق إعادة التركيب المتماثل متعدد الإدراج في المختبر ، فإن هذه الطر?...

Video: تسليط الضوء على المؤلف: استكشاف تقنيات الاستنساخ لشظايا الحمض النووي كاملة الطول

The construction of gene expression vectors is an important component of laboratory work in experimental biology. With technical advancements like Gibson Assembly, vector construction becomes relatively simple and efficient. However, when the full-length genome of Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus (PRRSV) cannot be easily amplified by a single polymerase chain reaction (PCR) from cDNA, or it is difficult to acquire a full-length gene expression vector by homologous recombination of multiple inserts in vitro, the current Gibson Assembly technique fails to achieve this goal.
Consequently, we aimed to divide the PRRSV genome into several fragments and introduce appropriate restriction sites into the reverse primer for obtaining PCR-amplified fragments. After joining the previous DNA fragment into the vector by homologous recombination technology, the new vector acquired the restriction enzyme cleavage site. Thus, we can linearize the vector by using the newly added enzyme cleavage site and introduce the next DNA fragment downstream of the upstream DNA fragment.
The introduced restriction enzyme cleavage site at the 3&#39; end of the upstream DNA fragment will be eliminated, and a new cleavage site will be introduced into the 3&#39; end of the downstream DNA fragment. In this way, we can join DNA fragments to the vector one by one. This method is applicable to successfully construct the PRRSV expression vector and is an effective method for assembling a large number of fragments into the expression vector.

Here, we present a protocol to obtain the pVAX1-PRRSV expression vector by introducing suitable restriction sites at the 3' end of the inserts. We can linearize the vector and join DNA fragments to the vector one by one through homologous recombination technology.

PCR Primer Design for Cloning of the Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus Gene

To begin, open the software and select the option to create a new DNA file. Prepare the PRRSV gene sequence from NCBI and click Okay to generate the sequence files. Analyze the sequence and mark the fragment junctions.Identify all the junctions before designing the specific sequence primers for the fragments. Then click on Primers and choose Add Primer. Paste the specific sequence and add overlap sequences of the vector to the first five prime nucleotide of the primer.Name the forward primer and click on Add Primer to Template to incorporate the designed primer into the template. Then mark the fragment junctions and design the reverse specific sequence primer of the fragments. Again, navigate to Primers and select Add Primer.Input the specific sequence. Add the restriction site to the first five prime nucleotide. Also, include 20 to 40 base pairs of vector overhang sequences to the first five prime nucleotide of the restriction site.Name the reverse primer and select Add Primer to Template. Next, set up six individual PCR reactions using the six fragments and designed primer pairs. Run the PCR following a three-step protocol as shown here.After PCR completion, pipette one microliter of six xDNA loading buffer with five microliters of the PCR product. Mix and centrifuge briefly. Analyze the samples using 1%agarose gel electrophoresis.To construct a full length gene, insert fragments of PRRSV were amplified using six PCR reactions. The sizes of the fragments were confirmed by agarose gel electrophoresis.

تصميم PCR التمهيدي لاستنساخ جين فيروس متلازمة الخنازير التناسلية والجهاز التنفسي

Cloning of the Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus Gene into the pVAX1 Vector

Begin by linearizing the vector. Prepare the reaction mixture containing specific restriction enzymes at room temperature. Use a gel extraction kit to purify the linearized vectors, then incubate a 37 degrees Celsius for 60 minutes.Then, assemble the exon R seamless cloning and assembly reaction to sub-clone the PRRSV gene. Adjust the total reaction volume to 10 microliters with sterilized deionized water. Then, thoroughly mix.Incubate the mixture in a thermocycler for 15 to 60 minutes at 50 degrees Celsius. Afterwards, store the samples on ice. After transforming the vector into competent cells, pick eight colonies into 20 microliters of LB medium containing kanamycin.Set up a colony PCR reaction to analyze the transformants. A full length PRRSV over-expression vector was obtained by introducing PRRSV fragment one into the pVAX1 vector, creating pVAX1-F1. Successive rounds of recombination using specific restriction enzymes resulted in incorporation of fragments two through five, visualized by an increase in plasmid size.