يسمح هذا الأسلوب لسهولة إنشاء دليل RNA التعبير plasmids للتجارب CRISPR التي يسهل. والميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أن الاستنساخ يمكن القيام به في خطوة واحدة و رنا رنا يمكن إنشاء دليل واحد باستخدام plasmids دليل واحد التعبير. لبدء هذا البروتوكول، تمييع البهاء المذاب في 1X TE العازلة إلى تركيز نهائي من 100 ميكرومولار.
Aliquot كمية متساوية من التمهيديات الأمامية وعكسية في أنابيب غطاء الشريط PCR. دوامة لخلط. المقبل, تدور أسفل دليل الحمض النووي الريبي الخلائج oligonucleotide في 100 مرة G لمدة 15 ثانية.
احتضان رد الفعل في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق قبل إعداد الربط. إضافة ما بين واحد وخمسة ميكروغرام من دليل PSB700 المحدد موجه التعبير إلى BSNB1 باستخدام ميكرولترات 0.5 BSNB1 لكل ميكروغرام واحد من ناقلات. إضافة الماء المقطر حتى حجم إجمالي 40 ميكرولتر وإجراء الهضم لمدة ساعة واحدة في 55 درجة مئوية.
تشغيل منتجات الهضم على 1.5٪ منخفضة ذوبان agarose هلام. قطع الفرقة الأساسية ناقلات هضم التي تتوافق مع جزء حوالي 9 كيلوبيس في الحجم. نقل هذه شريحة هلام إلى أنبوب microcentuge 1.5 ملليلتر.
باستخدام مجموعة تنقية هلام التجارية، واستخراج الحمض النووي من هلام agarose وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. ثم تمييع الحمض النووي إلى 10-15 ميكرولترات من عازلة TE للحصول على elute مركزة. عندما تكون جاهزة لأداء الربط إضافة 15 ميكروليتر من الماء المقطر إلى قارورة.
إضافة 1 ميكرولتر من دليل RNA oligonucleotides سابقا، ميكرولتر واحد من BSNB1 هضم هضم ناقل التعبير دليل PSB700 و 2 ميكرولترات من 10XT4 الحمض النووي تفاعل العازلة. ثم اخلط هذا الحل عن طريق الدوامة. إضافة ميكرولتر واحد من الحمض النووي ligase ودوامة مرة أخرى.
تدور أسفل الحل في 100 مرة G لمدة 15 ثانية. احتضان ردود الفعل في درجة حرارة الغرفة خلال الليل مع التأكد من أن تشمل أي رد فعل سيطرة سلبية إدراج يحتوي على ناقل BSNB1 هضم وحدها دون دليل محن RNA oligote إدراج. للبدء، إزالة الإشريكية القولونية من التخزين في ناقص 80 درجة مئوية وذوبانه على الجليد لمدة 5 إلى 10 دقائق.
إضافة 0.5 ميكرولترات من خليط رد الفعل المعدة إلى ثمانية ميكرولترات من الإشريكية القولونية المختصة. الحفاظ على الخليط على الجليد لمدة 30 دقيقة. الحرارة صدمة الخليط في 42 درجة مئوية لمدة 45 ثانية.
ثم اترك الخليط على الثلج لمدة دقيقتين. باستخدام شاكر دوار، واستعادة الثقافة في 250 ميكرولترات من وسائل الإعلام SOC باستخدام الشروط المذكورة هنا لNEB5a أو اسطبلات NEB. بعد هذا, لوحة 80 ميكرولترات من الثقافة على مناسبة مضاد حيويّ مقاومة مرق لوحة.
احتضان ليلة وضحاها في 37 درجة مئوية لNEB DH5a أو في 30 درجة مئوية لاسطبلات NEB. للبدء، استخدم بروتوكول PCR الخاص Phusion GC لإنشاء الجزء المطلوب كما هو موضح في بروتوكول النص. تشغيل هذا المنتج PCR على جل agarose 1٪ والتحقق من أن ينظر إلى شريط واحد في أزواج قاعدة تقريبا 490.
باستخدام مجموعة هلام استخراج قطع واستخراج هذا المنتج PCR. ثم aliquot على مزيج سيد 1X أعدت في أنابيب PCR. باستخدام ماصة متعددة القنوات لإضافة ميكرولتر واحد من المنتج PCR بتركيز 40 femtomoles لكل ميكرولتر.
في واحدة ميكرولتر من ناقل PSB700 إضافة تركيز 40 femtomoles لكل ميكرولتر. وتشمل أي عنصر تحكم إدراج باستخدام ميكرولتر واحد من الماء بدلا من oligonucleotides دليل RNA. استوعب المتجه وligate إدراج في رد فعل واحد باستخدام بروتوكول البوابة الذهبية الموضحة في بروتوكول النص.
بعد رد فعل البوابة الذهبية الأولية إضافة 0.5 ميكرولترات إضافية من إنزيم BSNB1 إلى كل رد فعل. مواصلة رد الفعل في 55 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة. عندما يكون رد فعل البوابة الذهبية كاملا المضي قدما في عملية التحول الإشريكية القولونية الموصوفة سابقا.
في هذه الدراسة، يتم إنشاء موجهات التعبير RNA دليل واحد بنجاح باستخدام طريقتين. في الطريقة الأولى، العمود الفقري ناقلات هو قبل هضم و ligated في سلسلة من oligonucleotides قصيرة. والطريقة الثانية تستخدم استنساخ البوابة الذهبية لهضمها في وقت واحد وligate في رد فعل واحد.
دليل RNA الاقتران التعبير عن ناقلات، كل يقودها المروج المستقلة الخاصة بها يتم إنشاؤها بنجاح عن طريق استنساخ جزء PCR مخصص. سوف ينتج عن الاستنساخ الناجح لأي من هذه الطرق ظهور المزيد من المستعمرات بشكل ملحوظ للتحولات مع الحمض النووي إدراج المناسبة بالمقارنة مع لوحة التحكم لا إدراج. أثناء محاولة هذا الإجراء من المهم أن نتذكر أن لا تتضمن عناصر تحكم إدراج في خطوة الاستنساخ الخاصة بك.
بعد هذا الإجراء، يمكن تنفيذ طرق أخرى مثل هندسة الجينوم من أجل الإجابة على أسئلة مثل ما هي الآثار التي لديها توقيعات الكروماتين على التعبير الجيني.
