Bezproblemowe podejście do klonowania konstrukcji wektora ekspresji wirusa zespołu rozrodczo-oddechowego świń

Protokół ten demonstruje budowę długiego i skomplikowanego wektora ekspresji genów. W przypadku gdy pełnowymiarowego fragmentu nie można uzyskać metodą pojedynczego PCR z cDNA lub nie można uzyskać pełnowymiarowego wektora ekspresji genu w drodze wielokrotnej rekombinacji homologicznej in vitro, stosuje się tę metodę. Obecnie klonowanie z wieloma wstawkami stosuje się w celu uzyskania pełnowymiarowego fragmentu DNA do sklonowania do odpowiedniego wektora.

Metoda ta może osiągnąć delecję lub mutację docelowych genów i skutecznie połączyć dużą liczbę fragmentów DNA z wektorem ekspresyjnym. Aby rozpocząć, otwórz oprogramowanie i wybierz opcję utworzenia nowego pliku DNA. Przygotuj sekwencję genu PRRSV z NCBI i kliknij przycisk OK, aby wygenerować pliki sekwencji.

Przeanalizuj sekwencję i zaznacz połączenia fragmentów. Zidentyfikuj wszystkie skrzyżowania przed zaprojektowaniem konkretnych starterów sekwencji dla fragmentów. Następnie kliknij Podkłady i wybierz Dodaj podkład.

Wklej określoną sekwencję i dodaj nakładające się sekwencje wektora do pierwszych pięciu pierwszych nukleotydów startera. Nazwij podkład do przodu i kliknij Dodaj podkład do szablonu, aby włączyć zaprojektowany podkład do szablonu. Następnie zaznacz połączenia fragmentów i zaprojektuj starter fragmentów o odwrotnej sekwencji specyficznej.

Ponownie przejdź do Podkłady i wybierz Dodaj podkład. Wprowadź określoną sekwencję. Dodaj miejsce restrykcyjne do pierwszych pięciu pierwszych nukleotydów.

Uwzględnij również od 20 do 40 par zasad sekwencji zwisu wektora do pierwszych pięciu głównych nukleotydów miejsca restrykcji. Nazwij odwrotny podkład i wybierz pozycję Dodaj podkład do szablonu. Następnie ustaw sześć indywidualnych reakcji PCR przy użyciu sześciu fragmentów i zaprojektowanych par starterów.

Uruchom PCR zgodnie z trzyetapowym protokołem, jak pokazano tutaj. Po zakończeniu PCR odpipetować 1 mikrolitr 6x buforu ładującego DNA z 5 mikrolitrami produktu PCR. Wymieszaj i krótko odwiruj.

Analizować próbki za pomocą elektroforezy w 1% żelu agarozowym. Aby skonstruować gen o pełnej długości, fragmenty insercji PRRSV amplifikowano za pomocą sześciu reakcji PCR. Rozmiary fragmentów potwierdzono za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym.

Zacznij od linearyzacji wektora. Przygotować mieszaninę reakcyjną zawierającą specyficzne enzymy restrykcyjne w temperaturze pokojowej. Użyj zestawu do ekstrakcji żelu, aby oczyścić zlinearyzowane wektory, a następnie inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 60 minut.

Następnie złóż reakcję bezszwowego klonowania i składania ExonArt w celu subklonowania genu PRRSV. Dostosuj całkowitą objętość reakcji do 10 mikrolitrów za pomocą wysterylizowanej wody dejonizowanej. Następnie dokładnie wymieszaj.

Inkubować mieszaninę w termocyklerze przez 15 do 60 minut w temperaturze 50 stopni Celsjusza. Następnie należy przechowywać próbki na lodzie. Po przekształceniu wektora w kompetentne komórki, wybierz 8 kolonii do 20 mikrolitrów pożywki LB zawierającej kanamycynę.

Skonfiguruj reakcję PCR kolonii, aby przeanalizować transformanty. Pełnowymiarowy PRRSV nad wektorem ekspresji uzyskano poprzez wprowadzenie fragmentu PRRSV 1 do wektora pVAX1, tworząc pVAX1-F1. Kolejne rundy rekombinacji z użyciem specyficznych enzymów restrykcyjnych skutkowały włączeniem fragmentów od 2 do 5, co uwidoczniło się wzrostem rozmiaru plazmidu.