Diese Arbeit wurde durch die finanzielle Unterstützung der Promotionsanbahnungsmittel unterstützt, die von der China West Normal University (Nr. 20E059) zur Verfügung gestellt wurden.

1. Vorbereitung des Templates des PRRSV-Gens
<ol><li>Tauen Sie den Virusbestand in 1 ml RNA-Extraktionsreagenz auf (siehe Materialtabelle).</li>
	<li>0,2 mL Chloroform zugeben und gründlich mischen. 3 Min. inkubieren.</li>
	<li>Die Mischung 15 min bei 12.000 × g bei 4 °C zentrifugieren. HINWEIS: Das Gemisch ist in drei Phasen unterteilt, nämlich eine farblose wässrige Phase, eine Interphase und eine rote Phenol-Chloroform-Phase.</li>
	<li>Pipettieren Sie die farblose wässrige Phase heraus und übertragen Sie sie in ein neues Röhrchen.</li>
	<li>Die wässrige Phase gründlich mit 0,5 mL Isopropanol mischen und 10 min bei 4 °C inkubieren.</li>
	<li>10 min bei 12.000 × g bei 4 °C zentrifugieren. HINWEIS: Am Boden des Röhrchens befindet sich ein weißer RNA-Niederschlag.</li>
	<li>Verwenden Sie eine Mikropipette, um den Überstand des Röhrchens zu entsorgen.</li>
	<li>Fügen Sie 1 mL 75%iges Ethanol hinzu, um das Pellet zu resuspendieren und kurz zu wirbeln.</li>
	<li>5 min bei 7.500 × g bei 4 °C zentrifugieren. Verwenden Sie eine Mikropipette, um den Überstand des Röhrchens zu entsorgen.</li>
	<li>Trocknen Sie die RNA 5 Minuten lang, fügen Sie 20-50 μl RNase-freies Wasser hinzu, um die RNA zu resuspendieren, und mischen Sie sie gründlich.</li>
	<li>Fahren Sie mit der Durchführung der reversen Transkription fort. Richten Sie die Reaktionen ein, um eine reverse Transkription durchzuführen, wie in Tabelle 1 gezeigt. HINWEIS: Um eine erfolgreiche reverse Transkription zu gewährleisten, verwenden Sie hochwertige RNA-Vorlagen.</li>
	<li>Verwenden Sie die resultierende cDNA für die PCR oder lagern Sie sie bei -20 °C.</li>
</ol>2. Design des PCR-Primers
<ol><li>Entwerfen der vorderen Grundierung<ol><li>Öffnen Sie die Software und wählen Sie Neue DNA-Datei.</li>
		<li>Fügen Sie die PRRSV-Gensequenz (GenBank: FJ548852.1) aus NCBI in die Software ein. Klicken Sie auf OK , um die Sequenzdateien zu generieren.</li>
		<li>Analysieren Sie die Sequenz, und markieren Sie die Fragmentknoten. Entwerfen Sie den vorwärtsspezifischen Sequenzprimer der Fragmente. In den meisten Fällen liegt die bevorzugte Schmelztemperatur (Tm) zwischen 55 °C und 62 °C, und der GC-Gehalt liegt bei 40-60 %.</li>
		<li>Klicken Sie auf Primer und wählen Sie Add Primer.</li>
		<li>Fügen Sie die spezifische Sequenz ein und fügen Sie Überlappungssequenzen des Vektors zu den ersten 5'-Nukleotiden des spezifischen Sequenzprimers hinzu. Wählen Sie in der Nähe jedes Knotens 20-40 bp aus, um als Überlappungsbereich zwischen den beiden benachbarten Fragmenten zu dienen.</li>
		<li>Benennen Sie den vorderen Primer, der die Überhänge und die spezifische Sequenz enthält (siehe Ergänzende Abbildung S1).</li>
		<li>Klicken Sie auf Primer zur Vorlage hinzufügen.</li>
	</ol></li>
	<li>Gestaltung der Rückseitengrundierung<ol><li>Analysieren Sie die Sequenz und markieren Sie die Fragmentverbindungen in der Software. Entwerfen Sie den umgekehrten spezifischen Sequenzprimer der Fragmente.</li>
		<li>Klicken Sie auf Primer und wählen Sie Add Primer.</li>
		<li>Fügen Sie die spezifische Sequenz ein und fügen Sie die Restriktionsstelle zum ersten 5'-Nukleotid des spezifischen Sequenzprimers hinzu. HINWEIS: Die hinzugefügten Einschränkungsstellen dürfen im Einfügefragment und im Vektor nicht vorhanden sein, mit Ausnahme der mehreren Klonierungsstellen.</li>
		<li>Fügen Sie 20-40 bp Überhangsequenzen von Vektoren zum ersten 5'-Nukleotid der Restriktionsstelle hinzu.</li>
		<li>Benennen Sie den umgekehrten Primer, der die Überhänge und die spezifische Sequenz enthält (siehe Ergänzende Abbildung S1).</li>
		<li>Klicken Sie auf Primer zur Vorlage hinzufügen.</li>
	</ol></li>
</ol>3. PCR zur Amplifikation von Fragmenten
<ol><li>Richten Sie sechs einzelne PCR-Reaktionen ein (Tabelle 2): Für Fragment 1 verwenden Sie die Primer P1 und P2 (siehe Ergänzende Abbildung S2); für Fragment 2 sind die Primer P3 und P4 zu verwenden (siehe Ergänzende Abbildung S2); für Fragment 3 sind die Primer P5 und P6 zu verwenden (siehe Ergänzende Abbildung S2); für Fragment 4 sind die Primer P7 und P8 zu verwenden (siehe Ergänzende Abbildung S2); für Fragment 5 die Primer P9 und P10 verwenden; und verwenden Sie die Primer P11 und P12, um Fragment 6 zu amplifizieren (siehe Ergänzende Abbildung S2). HINWEIS: Tauen Sie jede Komponente vor der Verwendung auf, mischen Sie sie und zentrifugieren Sie sie kurz.</li>
	<li>Führen Sie die PCR mit dem dreistufigen Protokoll in Tabelle 2 durch.</li>
	<li>1 μl 6x DNA-Ladepuffer zu 5 μl PCR-Produkt geben, mischen und den Inhalt kurz zentrifugieren.</li>
	<li>Analysieren Sie die Proben mit 1 % Agarose-Gelelektrophorese.</li>
</ol>4. Aufreinigung der PCR-Fragmente
HINWEIS: Die Aufreinigung der PCR-Produkte aus einem Gel mit einem Gel-Extraktionskit (siehe Materialtabelle) ist wichtig für die Vektorkonstruktion.
<ol><li>9 μl 6x DNA-Ladepuffer zu 45 μl PCR-Produkten geben, mischen und den Inhalt kurz zentrifugieren.</li>
	<li>Führen Sie eine 1%ige Agarose-Gel/Goldview-Elektrophorese durch, um die DNA-Fragmente zu trennen. HINWEIS: Verwenden Sie TAE-Laufpuffer nicht wieder, da sein pH-Wert die Rückgewinnung von DNA-Fragmenten beeinflusst.</li>
	<li>Verwenden Sie nach ausreichender Trennung der Banden ein scharfes Skalpell, um die DNA-Banden vorsichtig zu entfernen. HINWEIS: Minimieren Sie die Größe der Gelscheibe, indem Sie überschüssige Agarose abschneiden.</li>
	<li>Wiegen Sie die Gelscheibe in einem sauberen 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen, geben Sie ein gleiches Volumen an Bindungspuffer in die Gelscheibe (z. B. 0,3 mL auf eine 0,3-g-Scheibe) und inkubieren Sie sie 7 Minuten lang bei 60 °C.</li>
	<li>Setzen Sie eine Minisäule in ein 2-ml-Entnahmeröhrchen ein. 700 μl DNA/Agarose-Lösung aus Schritt 4.4 in die Mini-Säule geben.</li>
	<li>Bei 10.000 × g 1 min bei Raumtemperatur zentrifugieren. Entsorgen Sie das Filtrat und verwenden Sie das Auffangröhrchen wieder.</li>
	<li>300 μl Bindungspuffer zugeben und bei 13.000 × g 1 min bei Raumtemperatur zentrifugieren. Entsorgen Sie das Filtrat und verwenden Sie das Auffangröhrchen wieder.</li>
	<li>700 μl Waschpuffer zugeben und bei 13.000 × g 1 min bei Raumtemperatur zentrifugieren. Entsorgen Sie das Filtrat und verwenden Sie das Auffangröhrchen wieder.</li>
	<li>Drehen Sie die leere Mini-Säule 2 Minuten lang mit maximaler Geschwindigkeit, um die Säulenmatrix zu trocknen. Legen Sie die Minisäule in ein sauberes 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen.</li>
	<li>Geben Sie 20 μl deionisiertes Wasser direkt in die Mitte der Säulenmembran und lassen Sie es 2 Minuten bei Raumtemperatur stehen. Bei 13.000 × g Geschwindigkeit 1 min zentrifugieren.</li>
	<li>Lagern Sie die DNA bei -20 °C.</li>
</ol>5. Vorbereitung eines linearisierten Vektors
HINWEIS: Nach der Vorbereitung des Plasmids können die ausgewählten Enzyme zum Schneiden verwendet werden. Ein langer Verdau oder Dual-Enzym-Verdau ist entscheidend, um die Verdauung der gesamten DNA zu gewährleisten. Dadurch wird die Anzahl der falsch positiven Klone in nachfolgenden Experimenten reduziert.
<ol><li>pVAX1-Linearisierung
	<ol><li>Das Reaktionsgemisch wird bei Raumtemperatur in der angegebenen Reihenfolge hergestellt (Tabelle 3). HINWEIS: Das Volumen Wasser sollte hinzugefügt werden, um das angegebene Gesamtreaktionsvolumen beizubehalten. Hier wurde 1 μg des Plasmids mit Enzymen im Reaktionsgemisch verdaut. Abhängig von der Plasmidkonzentration kann das Volumen des Plasmids im Reaktionsgemisch eingestellt werden.</li>
		<li>Vorsichtig mischen; dann nach unten drehen. Bei 37 °C in einem Heizblock oder Wasserthermostat 60 min inkubieren.</li>
		<li>Führen Sie eine Gelaufreinigung durch, die der Aufreinigung der PCR-Fragmente in Abschnitt 4 mit dem Gelextraktionskit ähnelt (siehe Materialtabelle).</li>
	</ol></li>
	<li>pVAX1-F1 Linearisierung HINWEIS: pVAX1-F1 ist der Vektor, der aus der ersten Runde der Rekombination von pVAX1 (NdeI und HindIII) und Fragment 1 erhalten wurde. pVAX1-F2 ist der Vektor, der aus der Rekombination von pVAX1-F1 (NdeI) und Fragment 2 erhalten wird. pVAX1-F3 ist der Vektor, der aus der Rekombination von pVAX1-F2 (NdeI) und Fragment 3 erhalten wird. pVAX1-F4 ist der Vektor, der aus der Rekombination von pVAX1-F3 (NdeI) und Fragment 4 erhalten wird. pVAX1-F5 ist der Vektor, der aus der Rekombination von pVAX1-F4 (EcoRV und NtoI) und Fragment 5 erhalten wurde.<ol><li>Für jeden Vektor wird das Reaktionsgemisch separat bei Raumtemperatur in der angegebenen Reihenfolge hergestellt (Tabelle 3).</li>
		<li>Vorsichtig mischen; dann nach unten drehen. Bei 37 °C in einem Heizblock oder Wasserthermostat 60 min inkubieren.</li>
		<li>Führen Sie eine Gelaufreinigung durch, die der Aufreinigung der PCR-Fragmente in Abschnitt 4 mit dem Gelextraktionskit ähnelt (siehe Materialtabelle).</li>
	</ol></li>
</ol>6. Subklonierung auf einen neuen Vektor
HINWEIS: Eine gute Klonierungseffizienz kann erreicht werden, wenn 50-200 ng Vektor und Inserts verwendet werden.
<ol><li>Richten Sie die nahtlose Klonierungs- und Assemblierungsreaktion von ExonArt ein (Tabelle 4). Das Gesamtreaktionsvolumen wird mit sterilisiertem deionisiertem H2O auf 10 μl eingestellt und gemischt.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Reaktion in einem Thermocycler für 15-60 min bei 50 °C. Lagern Sie die Proben auf Eis. HINWEIS: Eine Verlängerung der Inkubation auf bis zu 60 Minuten kann die Montageeffizienz verbessern.</li>
	<li>Tauen Sie DH5α chemisch kompetente Zellen auf Eis auf.</li>
	<li>10 μl des Assemblierungsprodukts werden in die zuständigen Zellen gegeben; Mischen Sie dann vorsichtig, indem Sie auf und ab pipettieren.</li>
	<li>Die Mischung für 30 min auf Eis legen.</li>
	<li>Hitzeschock bei 45 °C für 45 s und die Schläuche für 3 min auf Eis übertragen.</li>
	<li>Geben Sie 900 μl SOC-Medium in das Röhrchen.</li>
	<li>Schütteln Sie das Röhrchen bei 225 U/min für 1 h in einem 37 °C Schüttelinkubator.</li>
	<li>Die Umwandlungsreaktion bei 6.000 × g für 2 min zentrifugieren. Den Überstand verwerfen und die Zellen in 100 μl frischem SOC-Medium resuspendieren.</li>
	<li>Verteilen Sie die transformierte Zellsuspension auf einer separaten LB-Platte mit 50 μg/ml Kanamycin.</li>
	<li>Alle Platten über Nacht bei 37 °C inkubieren. Wählen Sie einzelne isolierte Kolonien aus jeder Versuchsplatte aus.</li>
</ol>7. Analyse der Transformatoren
<ol><li>Entnehmen Sie acht Kolonien in 20 μl LB-Medium mit 50 μg/ml Kanamycin.</li>
	<li>Richten Sie die Kolonie-PCR-Reaktion ein und führen Sie die PCR durch (Tabelle 5). HINWEIS: Für die Kolonie-PCR-Reaktion für Fragment 1 sind die Primer P1 und P2 zu verwenden (siehe Ergänzende Datei 1); für Fragment 2 sind die Primer P3 und P4 zu verwenden (siehe Zusatzdatei 1); für Fragment 3 sind die Primer P5 und P6 zu verwenden (siehe Zusatzdatei 1); für Fragment 4 sind die Primer P7 und P8 zu verwenden (siehe Ergänzende Abbildung S2); für Fragment 5 die Primer P9 und P10 verwenden; und verwenden Sie die Primer P11 und P12, um Fragment 6 zu detektieren (siehe Ergänzende Abbildung S2).</li>
	<li>Geben Sie 1 μl 6x DNA-Ladepuffer zu 5 μl des PCR-Produkts, mischen Sie und zentrifugieren Sie den Inhalt kurz.</li>
	<li>Analysieren Sie die Ergebnisse mit 1% Agarose-Gelelektrophorese.</li>
	<li>Wählen Sie eine positive Kolonie in 5 mL LB-Medium mit 50 μg/mL Kanamycin aus und züchten Sie über Nacht bei 37 °C.</li>
	<li>Beziehen Sie das Plasmid mit einem Plasmid-DNA-Mini-Kit (siehe Materialtabelle) gemäß den Anweisungen des Herstellers.</li>
	<li>Visualisieren Sie die Ergebnisse mit einer Elektrophorese von 1 % Agarose-Gel.</li>
</ol>

Klonierung des PRRSV-Gens in voller Länge im pVAX1-Expressionsvektor

<ol>
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Die Autoren erklären, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Die Gibson-Assemblierungstechnik ist eine auf In-vitro-Rekombination basierende molekulare Klonierungsmethode zur Assemblierung von DNA-Fragmenten8. Diese Methode ermöglicht den Zusammenbau mehrerer DNA-Fragmente zu einem zirkulären Plasmid in einer isothermen Reaktion mit einem einzigen Röhrchen. Eines der Hindernisse für die Gibson-Assemblierungstechnik ist jedoch die Gewinnung langer Fragmente aus cDNA. Die langen Fragmente sind aus vielen Gründen schwer genau zu vervielfältigen....

Als wesentliche Technik zur Konstruktion von DNA-basierten experimentellen Werkzeugen für die Expression in prokaryotischen und eukaryotischen Zellen ist die molekulare Klonierung ein sehr wichtiger Bestandteil der experimentellen Biologie. Die molekulare Klonierung umfasst vier Prozesse: die Gewinnung von Insert-DNA, die Ligation des Inserts in den entsprechenden Vektor, die Umwandlung des rekombinanten Vektors in Escherichia coli (E. coli) und die Identifizierung der positiven Klone1. Bisher wurden mehrere Methoden zur Verbindung von DNA-Molekülen unter Verwendung der Restriktionsenzyme 2,3 und der PCR-vermittelten Rekombination 4,5,6 angewendet. Die homologe Rekombination, bekannt als Seamless Cloning Technology, ist die Gruppe von Klonierungsmethoden, die das sequenzunabhängige und narbenfreie Einfügen eines oder mehrerer DNA-Fragmente in einen Vektor ermöglicht. Diese Technologie umfasst sequenz- und ligationsunabhängige Klonierung (SLIC), Seamless Ligation Cloning Extract (SLiCE), In-Fusion und Gibson Assemblierung. Es verwendet eine Exonuklease, um einen Strang des Inserts abzubauen, und einen Vektor, um kohäsive Enden zu erzeugen, und entweder in vivo-Reparatur oder in vitro-Rekombination, um das Insert durch Bildung von Phosphodiesterbindungen kovalent mit dem Vektor zu verbinden. Die Möglichkeit, einen einzelnen Insert in beliebiger Sequenz ohne Narben mit einem Vektor zu verbinden, ist sehr ansprechend. Darüber hinaus ist die Technologie in der Lage, 5-10 Fragmente in einer vorgegebenen Reihenfolge ohne Sequenzbeschränkungen zu verbinden.
Als eine von vielen rekombinanten DNA-Techniken ist die Gibson-Assemblierungstechnik, derzeit die effektivste Klonierungsmethode 7,8, eine robuste und elegante Exonuklease-basierte Methode, um ein oder mehrere linearisierte DNA-Fragmente nahtlos zusammenzusetzen. Die Gibson-Assemblierungsreaktion wird unter isothermen Bedingungen unter Verwendung einer Mischung aus drei Enzymen durchgeführt, nämlich 5'-Exonuklease, High-Fidelity-Polymerase und einer thermostabilen DNA-Ligase. Einzelstrangige 3'-Überhänge, die durch die 5'-3'-Exonuklease erzeugt werden, tragen zum Glühen von Fragmenten bei, die an einem Ende Komplementarität aufweisen. Die High-Fidelity-Polymerase füllt effektiv die Lücken in den geglühten Einzelstrangbereichen durch Zugabe von dNTPs, und die thermostabile DNA-Ligase dichtet die Kerben ab, um gemeinsame DNA-Molekülezu bilden 8. Daher ist diese technische Methode für die Konstruktion von Genexpressionsvektoren weit verbreitet.
Das porzine reproduktive und respiratorische Syndrom (PRRS) ist eine Viruserkrankung, die bei Schweinen ab einem Alter von9 Jahren zu Fortpflanzungsstörungen und Atemversagen führt, die durch PRRSV verursacht werden. Das Syndrom manifestiert sich in Form von Fieber, Magersucht, Lungenentzündung, Lethargie, Depression und Atemnot. Darüber hinaus wurden bei einigen Epidemien klinische Symptome, einschließlich roter/blauer Verfärbung der Ohren, beobachtet. Als Mitglied der Familie der Arteriviren wird PRRSV in großem Umfang durch direkten Kontakt und Austausch von Flüssigkeiten, einschließlich Urin, Kolostrum und Speichel, in die schweinefleischproduzierenden Länder übertragen. Aufgrund der Ausbreitung von PRRSV in den Vereinigten Staaten werden die wirtschaftlichen Gesamtverluste der Schweinefleischindustrie auf etwa 664 Millionen US-Dollar pro Jahr geschätzt, basierend auf dem Zuchtmaßstab von 5,8 Millionen Sauen und 110 Millionen Schweinen10,11. Der Bericht des Tier- und Pflanzengesundheitsinspektionsdienstes zeigt, dass 49,8 % der ungeimpften Schweine das Vorhandensein von PRRSV im Serum12 aufweisen und geringe PRRSV-Konzentrationen bei infizierten Schweinen über Speichel, Nasensekret, Urin und Kot ausgeschieden werden13. Es wurden mehrere Strategien implementiert, um die Ausbreitung von PRRSV zu kontrollieren 14,15,16. Neben Eliminierungsverfahren zur Schaffung vollständig virusnegativer Populationen oder zur Verbesserung der Biosicherheit und des Managements ist die Verabreichung von Impfstoffen ein wirksames Mittel zur Kontrolle von PRRS.
PRRSV ist ein behülltes, einzelsträngiges RNA-Virus mit positivem Sinn und einer Länge von etwa 15 Kilobasen (kb). Das PRRSV-Genom besteht aus mindestens 10 offenen Leserahmen (ORFs), einer kurzen 5'-untranslatierten Region (5' UTR) und einem Poly(A)-Schwanz am 3'-Ende (Abbildung 1A)17. Das Genom eines negativsträngigen RNA-Virus ist nicht infektiös, während das Genom von positivsträngigen RNA-Viren infektiös ist. Es gibt zwei Hauptstrategien für die RNA- und DNA-Transfektion zur Erzeugung von Virusnachkommen18. Die Klonierung des Fragments in voller Länge, das dem RNA-Genom entspricht, ist jedoch entscheidend für die Konstruktion infektiöser Klone. Aufgrund der langen und komplexen Natur des PRRSV-Genoms kann das Genom in voller Länge nicht einfach auf einmal durch PCR gewonnen werden. Obwohl die künstliche Synthese von PRRSV-Genen eine effektive Lösung ist, ist die Synthese langer Fragmente oft teuer. Um den PRRSV-Expressionsvektor in voller Länge zu erhalten, haben wir daher versucht, ihn mit der homologen Rekombinationsmethode19,20 mit mehreren Inserts zu erzeugen. Leider war es uns nicht möglich, den Genexpressionsvektor in voller Länge zu erhalten. Daher fügten wir in dieser Studie dem reversen Primer geeignete Restriktionsstellen hinzu und erhielten den pVAX1-PRRSV-Expressionsvektor erfolgreich durch mehrere Runden homologe Rekombinationsreaktionen. Darüber hinaus kann mit dieser Methode auch eine Deletion oder Mutation von Zielgenen erreicht und eine große Anzahl von DNA-Fragmenten effizient an den Expressionsvektor gebunden werden.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>1 kb plus DNA Ladder</td>
			<td>Tiangen Biochemical Technology (Beijing) Co., Ltd</td>
			<td>MD113-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2x Universal Green PCR Master Mix</td>
			<td>Rong Wei Gene Biotechnology Co., Ltd</td>
			<td>A303-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.</td>
			<td>9012-36-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop Microcentrifuge</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific&#160; Co., Ltd</td>
			<td>FRESCO17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clean Bench</td>
			<td>Sujing Antai Air Technology&#160; Co., Ltd</td>
			<td>VD-650-U</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA Electrophoresis Equipment</td>
			<td>Cleaver Scientific&#160; Co., Ltd</td>
			<td>170905117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA Loading Buffer (6x)</td>
			<td>Biosharp Biotechnology Co., Ltd</td>
			<td>BL532A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. Z. N. A. Gel Extraction kit</td>
			<td>Omega Bio-Tek Co., Ltd</td>
			<td>D2500-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E.Z.N.A. Plasmid DNA Mini Kit I</td>
			<td>Omega Bio-Tek Co., Ltd</td>
			<td>D6943-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electro-heating Standing-temperature Cultivator</td>
			<td>Shanghai Hengyi Scientific Instrument Co., Ltd</td>
			<td>DHP-9082</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ExonArt Seamless Cloning and Assembly kit</td>
			<td>Rong Wei Gene Biotechnology Co., Ltd</td>
			<td>A101-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ExonScript RT SuperMix with dsDNase</td>
			<td>Rong Wei Gene Biotechnology Co., Ltd</td>
			<td>A502-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FastDigest Eco321 (EcoRV)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific&#160; Co., Ltd</td>
			<td>FD0303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FastDigest HindIII</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific&#160; Co., Ltd</td>
			<td>FD0504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FastDigest NheI</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific&#160; Co., Ltd</td>
			<td>FD0974</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FastDigest NotI</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific&#160; Co., Ltd</td>
			<td>FD0596</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel Doc XR</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories Co., Ltd</td>
			<td>721BR07925</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goldview Nucleic Acid Gel Stain</td>
			<td>Shanghai Yubo Biotechnology Co., Ltd</td>
			<td>YB10201ES03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice Maker Machine</td>
			<td>Shanghai Bilang Instrument Manufacturing Co., Ltd</td>
			<td>FMB100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Invitrogen Platinum SuperFi II DNA Polymerase</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific&#160; Co., Ltd</td>
			<td>12361010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Agar Plate (Kanamycin)</td>
			<td>Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.</td>
			<td>B530113-0010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB sterile liquid medium (Kanamycin)</td>
			<td>Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.</td>
			<td>B540113-0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipettors</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific&#160; Co., Ltd</td>
			<td>&#8212;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microwave Oven</td>
			<td>Panasonic Electric (China) Co., Ltd</td>
			<td>NN-GM333W</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital Shakers</td>
			<td>Shanghai Zhicheng Analytical Instrument Manufacturing Co., Ltd</td>
			<td>ZHWY-2102C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PRRSV virus</td>
			<td>Sichuan Agricultural University</td>
			<td>&#8212;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SnapGene</td>
			<td>GSL Biotech, LLC</td>
			<td>v5.1</td>
			<td>To design primers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T100 PCR Gradient Thermal Cycler</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories&#160; Co., Ltd</td>
			<td>T100 Thermal Cycler</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TAE buffer</td>
			<td>Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.</td>
			<td>B040123-0010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol Reagent</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific&#160; Co., Ltd</td>
			<td>15596026</td>
			<td>RNA extraction reagent</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a seamless cloning approach for porcine reproductive and respiratory syndrome virus expression vector construction

Die Konstruktion von Genexpressionsvektoren ist ein wichtiger Bestandteil der Laborarbeit in der experimentellen Biologie. Mit technischen Fortschritten wie Gibson Assembly wird die Vektorkonstruktion relativ einfach und effizient. Wenn jedoch das Genom des Porcinen Reproduktiven und Respiratorischen Syndroms Virus (PRRSV) nicht einfach durch eine einzelne Polymerase-Kettenreaktion (PCR) aus cDNA amplifiziert werden kann oder es schwierig ist, einen Genexpressionsvektor in voller Länge durch homologe Rekombination mehrerer Inserts in vitro zu erhalten, kann die derzeitige Gibson-Assemblierungstechnik dieses Ziel nicht erreichen.
Daher zielten wir darauf ab, das PRRSV-Genom in mehrere Fragmente zu zerlegen und geeignete Restriktionsstellen in den reversen Primer einzuführen, um PCR-amplifizierte Fragmente zu erhalten. Nach dem Verbinden des vorherigen DNA-Fragments mit dem Vektor durch homologe Rekombinationstechnologie erhielt der neue Vektor die Spaltstelle des Restriktionsenzyms. So können wir den Vektor linearisieren, indem wir die neu hinzugefügte Enzymspaltstelle verwenden und das nächste DNA-Fragment stromabwärts des stromaufwärts gelegenen DNA-Fragments einführen.
Die eingeführte Spaltstelle des Restriktionsenzyms am 3'-Ende des stromabwärts gelegenen DNA-Fragments wird eliminiert, und eine neue Spaltstelle wird in das 3'-Ende des stromabwärts gelegenen DNA-Fragments eingeführt. Auf diese Weise können wir DNA-Fragmente nacheinander mit dem Vektor verbinden. Diese Methode ist anwendbar, um den PRRSV-Expressionsvektor erfolgreich zu konstruieren, und ist eine effektive Methode zum Assemblieren einer großen Anzahl von Fragmenten in den Expressionsvektor.

As an essential technique to construct DNA-based experimental tools for expression in prokaryotic and eukaryotic cells, molecular cloning is a very important component of experimental biology. Molecular cloning involves four processes: the acquisition of insert DNA, ligation of the insert into the appropriate vector, transformation of the recombinant vector into Escherichia coli (E. coli), and identification of the positive clones1. So far, multiple methods have been adopted for joining DNA molecules by using restriction enzymes2,3 and PCR-mediated recombination4,5,6. Homologous recombination, known as seamless cloning technology, is the group of cloning methods, which allows sequence-independent and scarless insertion of one or more fragments of DNA into a vector. This technology includes sequence- and ligation-independent cloning (SLIC), Seamless Ligation Cloning Extract (SLiCE), In-Fusion, and Gibson Assembly. It employs an exonuclease to degrade one strand of the insert and a vector to generate cohesive ends, and either in vivo repair or in vitro recombination to covalently join the insert to the vector by forming phosphodiester bonds. The ability to join a single insert to a vector at any sequence without any scars is very appealing. Furthermore, the technology has the ability to join 5-10 fragments in a predetermined order without sequence restrictions.
As one of many recombinant DNA techniques, the Gibson Assembly technique, currently the most effective cloning method7,8, is a robust and elegant exonuclease-based method to assemble one or multiple linearized DNA fragments seamlessly. The Gibson Assembly reaction is performed under isothermal conditions using a mixture of three enzymes,namely, 5&#39; exonuclease, high-fidelity polymerase, and a thermostable DNA ligase. Single-strand 3&#180; overhangs created by the 5&#39;-3&#39; exonuclease contribute to the annealing of fragments that share complementarity at one end. The high-fidelity polymerase effectively fills the gaps in the annealed single-strand regions by adding dNTPs, and the thermostable DNA ligase seals the nicks to form joint DNA molecules8. Hence, this technical method has been widely used for the construction of gene expression vectors.
Porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS) is a viral disease that leads to reproductive impairment and respiratory failure in pigs caused by PRRSV at any age9. The syndrome is manifested as fever, anorexia, pneumonia, lethargy, depression, and respiratory distress. Moreover, clinical signs, including red/blue discoloration of the ears, have been observed in some epidemics. As a member of the family arterivirus, PRRSV is widely transmitted to pork-producing countries by direct contact and exchange of fluids, including urine, colostrum, and saliva. Due to the spread of PRRSV in the United States, the total economic losses of the pork industry have been estimated to be approximately $664 million per year, based on the breeding scale of 5.8 million sows and 110 million pigs10,11. The Animal and Plant Health Inspection Service report shows that 49.8% of unvaccinated pigs show the presence of PRRSV in serum12 and low levels of PRRSV in infected pigs are excreted through saliva, nasal secretions, urine, and feces13. Multiple strategies have been implemented to control PRRSV propagation14,15,16. In addition to elimination procedures to create completely virus-negative populations or improving biosafety and management, administering vaccines is an effective means of controlling PRRS.
PRRSV is an enveloped, single-stranded, positive-sense RNA virus with a length of approximately 15 kilobases (kb). The PRRSV genome consists of at least 10 open reading frames (ORFs), a short 5&#39; untranslated region (5&#39; UTR), and a poly(A) tail at the 3&#39; terminus (Figure 1A)17. The genome of a negative-stranded RNA virus is non-infectious whereas the genome from positive-stranded RNA viruses is infectious. There are two main strategies for RNA and DNA transfection for generating virus progeny18. However, cloning the full-length fragment corresponding to the RNA genome is crucial for the construction of infectious clones. Due to the long and complex nature of the PRRSV genome, the full-length genome cannot be easily obtained through PCR at once. Additionally, although the artificial synthesis of PRRSV genes is an effective solution, the synthesis of long fragments is often expensive. Hence, to obtain the PRRSV full-length expression vector, we attempted to create it by the multiple inserts homologous recombination method19,20. Unfortunately, we were not able to obtain the full-length gene expression vector. Therefore, in this study, we added appropriate restriction sites to the reverse primer and successfully obtained the pVAX1-PRRSV expression vector by several rounds of homologous recombination reactions. Furthermore, this method can also achieve deletion or mutation of target genes and efficiently join a large number of DNA fragments to the expression vector.

Autor im Rampenlicht: Erforschung von Klonierungstechniken für DNA-Fragmente in voller Länge

Ein nahtloser Klonierungsansatz für die Konstruktion von Expressionsvektoren für das porzine reproduktive und respiratorische Syndrom

In dieser Arbeit stellen wir ein in vitro Rekombinationssystem vor, um überlappende DNA-Moleküle mit Hilfe des Reverse-Primers über kontinuierlich eingeführte Restriktionsstellen zu assemblieren und zu reparieren (Abbildung 1B). Dieses System ist ein einfaches und effizientes Verfahren, das die Präparation des linearen Vektors und der Insert-Fragmente umfasst, die durch PCR eingeführte Überhänge enthalten, wobei Primer geeignete 5'-Verlängerungssequenzen und Restriktionsste...

In dieser Arbeit stellen wir ein Protokoll vor, um den pVAX1-PRRSV-Expressionsvektor durch Einführung geeigneter Restriktionsstellen am 3'-Ende der Inserts zu erhalten. Wir können den Vektor linearisieren und DNA-Fragmente durch homologe Rekombinationstechnologie nacheinander mit dem Vektor verbinden.

The construction of gene expression vectors is an important component of laboratory work in experimental biology. With technical advancements like Gibson ...

Dieses Protokoll demonstriert die Konstruktion eines langwierigen und komplizierten Genexpressionsvektors. Wenn ein DNA-Fragment in voller Länge nicht durch eine einzige PCR aus cDNA gewonnen werden kann oder der Genexpressionsvektor in voller Länge nicht durch homologe Rekombination mit mehreren Inserts in vitro gewonnen werden kann, ist dieses Verfahren anwendbar. Derzeit wird die Multiple-Insert-Ligationsklonierung verwendet, um ein DNA-Fragment in voller Länge für die Klonierung in einen geeigneten Vektor zu erhalten.Mit dieser Methode kann die Deletion oder Mutation von Zielgenen erreicht und eine große Anzahl von DNA-Fragmenten effizient mit dem Expressionsvektor verbunden werden.

a-seamless-cloning-approach-for-porcine-reproductive-respiratory

Research

JoVE Journal

Biology

A Seamless Cloning Approach for Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus Expression Vector Construction

363 Aufrufe.  China West Normal University. Dieses Protokoll demonstriert die Konstruktion eines langwierigen und komplizierten Genexpressionsvektors. Wenn ein DNA-Fragment in voller Länge nicht durch eine einzige PCR aus cDNA gewonnen werden kann oder der Genexpressionsvektor in voller Länge nicht durch homologe Rekombination mit mehreren Inserts in vitro gewonnen werden kann, ist dieses Verfahren anwendbar. Derzeit wird die Multiple-Insert-Ligationsklonierung verwendet, um ein DNA-Fragment in voller Länge für die Klonierung in ei...

Serie: Autor im Rampenlicht: Erforschung von Klonierungstechniken für DNA-Fragmente in voller Länge

The construction of gene expression vectors is an important component of laboratory work in experimental biology. With technical advancements like Gibson Assembly, vector construction becomes relatively simple and efficient. However, when the full-length genome of Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus (PRRSV) cannot be easily amplified by a single polymerase chain reaction (PCR) from cDNA, or it is difficult to acquire a full-length gene expression vector by homologous recombination of multiple inserts in vitro, the current Gibson Assembly technique fails to achieve this goal.
Consequently, we aimed to divide the PRRSV genome into several fragments and introduce appropriate restriction sites into the reverse primer for obtaining PCR-amplified fragments. After joining the previous DNA fragment into the vector by homologous recombination technology, the new vector acquired the restriction enzyme cleavage site. Thus, we can linearize the vector by using the newly added enzyme cleavage site and introduce the next DNA fragment downstream of the upstream DNA fragment.
The introduced restriction enzyme cleavage site at the 3&#39; end of the upstream DNA fragment will be eliminated, and a new cleavage site will be introduced into the 3&#39; end of the downstream DNA fragment. In this way, we can join DNA fragments to the vector one by one. This method is applicable to successfully construct the PRRSV expression vector and is an effective method for assembling a large number of fragments into the expression vector.

Here, we present a protocol to obtain the pVAX1-PRRSV expression vector by introducing suitable restriction sites at the 3' end of the inserts. We can linearize the vector and join DNA fragments to the vector one by one through homologous recombination technology.