تم تمويل هذا المشروع جزئيا بأموال فيدرالية من المعهد الوطني للسرطان ، المعاهد الوطنية للصحة ، تحت رقم المشروع ZIA BC 010329.

ملاحظة: يتم إجراء هذا الفحص في خلايا 293FT. خط ظهاري مميز جيدا وقابل للنقل بسهولة مشتق من خلايا الكلى الجنينية البشرية. عادة ما يوفر طبق استزراع واحد متلاقى بطول 10 سم لهذه الخلايا خلايا كافية لبذر 20 بئرا من ألواح زراعة الأنسجة المكونة من 6 آبار. يجب تنفيذ الخطوات 1-3 باستخدام تقنية معقمة في خزانة السلامة البيولوجية.
1. بذر الخلايا (اليوم الأول)
ملاحظة: في هذه الخطوة ، يتم فصل الخلايا عن طبق (أطباق) زراعة الأنسجة ، وعدها ، وزرعها في ألواح زراعة الأنسجة المكونة من 6 آبار لنقلها في الخطوة 2 (الشكل 2).
<ol><li>نضح الوسائط من الخلايا في طبق 10 سم. اغسل الخلايا ب 5 مل من محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) وانضحه.</li>
	<li>أضف 1 مل من حمض التربسين والإيثيلين ديامينيترايتيك (EDTA) واحتضانها لمدة 3-5 دقائق عند 37 درجة مئوية لفصل الخلايا عن الطبق.</li>
	<li>أضف 9 مل من وسط النسر المعدل الكامل من Dulbecco (DMEM) إلى الخلايا لتحييد التربسين والماصة لأعلى ولأسفل بشكل متكرر لتوليد تعليق متجانس لخلية واحدة.</li>
	<li>انقل على الفور 20 ميكرولتر من الخلايا إلى أنبوب سعة 1.7 مل واخلطها مع 20 ميكرولتر من صبغة تريبان الزرقاء. عد الخلايا باستخدام عداد الخلايا الآلي (جدول المواد) أو مقياس الدم.</li>
	<li>خفف الخلايا إلى 2 × 105 خلايا / مل في وسائط DMEM كاملة وأضف 2 مل إلى كل بئر من صفيحة زراعة الأنسجة المكونة من 6 آبار (4 × 105 خلايا / بئر). احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية و 10٪ CO2 بين عشية وضحاها. ملاحظة: يوصى باستخدام خلايا 293FT التي تم تمريرها أقل من 20x. لقد وجدنا سابقا أن استخدام الخلايا ذات أرقام مرور أكبر يمكن أن يؤدي إلى انخفاض نسب BRET وزيادة تباين الإشارة من بئر إلى بئر.</li>
</ol>2. نقل الخلايا (اليوم الثاني)
ملاحظة: هنا ، يتم نقل الخلايا باستخدام تركيبات تعبير pCMV5-NanoLuc-CRAF و pCMV5-14-3-3ζ-Halo ، جنبا إلى جنب مع المتجه الفارغ pCDNA3.1 (الشكل 2).
<ol><li>قبل النقل ، قم بتخفيف بلازميدات N-BRET إلى 5 نانوغرام / ميكرولتر و pCDNA3.1 إلى 100 نانوغرام / ميكرولتر ، وقم بترقيم مجموعة من الأنابيب المعقمة سعة 1.7 مل.</li>
	<li>أضف 100 ميكرولتر من وسائط النقل (انظر جدول المواد للحصول على التفاصيل) إلى كل أنبوب ، جنبا إلى جنب مع 5 نانوغرام من pCMV5-NanoLuc-CRAF ، و 10 نانوغرام من pCMV5-14-3-3ζ و 200 نانوغرام من PCDNA3.1.</li>
	<li>أضف 2 ميكرولتر من كاشف النقل (انظر جدول المواد للحصول على التفاصيل) ودوامة برفق للخلط. قم بتدوير الأنابيب لفترة وجيزة في جهاز طرد مركزي دقيق لضمان جمع كل السوائل في قاع الأنابيب ثم احتضانها عند حوالي 25 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.</li>
	<li>أضف معقدات النقل بالتنقيط إلى الخلايا واحتضانها عند 37 درجة مئوية / 10٪ CO2 لمدة 16-20 ساعة للسماح بالتعبير عن البروتينات الموسومة بالهالة والنانو. ملاحظة: تعد إضافة الحمض النووي الحامل الفارغ (pCDNA3.1) أمرا ضروريا لتحقيق كفاءة نقل عالية لتركيبات تعبير N-BRET. يؤدي الفشل في إضافة ناقلات فارغة إلى انخفاض مستويات التعبير لبروتينات 14-3-3ζ-Halo و Nano-CRAF ، وبالتالي يؤدي إلى نسب BRET ضعيفة وغير متسقة ، كما تمت مناقشته سابقا22.</li>
</ol>3. إعادة طلاء الخلية (اليوم الثالث)
ملاحظة: في هذه الخطوة ، يتم نقل الخلايا إلى لوحة 384 بئرا وإما Halo 618 ligand (+ ligand ؛ جدول المواد) أو تمت إضافة DMSO (+ مركبة) لقراءة انبعاثات BRET في الخطوة 4. يتم نقل الخلايا المتبقية إلى ألواح استزراع جديدة من 6 آبار لتحليل اللطخة الغربية في الخطوة 5 (الشكل 2).
<ol><li>اجمع المواد التالية وقم بإعداد منطقة العمل كما هو موضح أدناه.<ol><li>باستخدام حمام مائي بدرجة حرارة 37 درجة مئوية ، قم بتسخين التربسين-EDTA مسبقا ، جنبا إلى جنب مع كل من وسائط الفحص الخالية من المصل ووسائط الفحص المكملة ب 10٪ من FBS (انظر جدول المواد للحصول على التفاصيل).</li>
		<li>بناء على عدد العينات المراد قياسها ، قم قبل تسمية ثلاث مجموعات من الأنابيب المعقمة سعة 1.7 مل (المجموعة 1-3) ، ومجموعة واحدة من الأنابيب السفلية المخروطية المعقمة سعة 15 مل. جهز جهاز طرد مركزي دلو متأرجح بإدخالات أنبوب سعة 15 مل وقم بالتبريد المسبق إلى 4 درجات مئوية.</li>
		<li>ضع العناصر التالية في غطاء زراعة الأنسجة: خزانات الكواشف ، وألواح زراعة الأنسجة المكونة من 384 بئرا ، وألواح زراعة الأنسجة المكونة من 6 آبار ، وماصة ونصائح متعددة القنوات ، وشرائح / غرف عد الخلايا ، وصبغة تريبان الزرقاء (جدول المواد) ، جنبا إلى جنب مع مجموعات أنابيب 1.7 مل 1-3.</li>
	</ol></li>
	<li>حصاد الخلايا وعدها كما هو موضح أدناه.<ol><li>نضح الوسائط من ألواح 6 آبار وأضف 250 ميكرولتر من التربسين-EDTA إلى الخلايا. احتضان الألواح المكونة من 6 آبار عند 37 درجة مئوية حتى تبدأ الخلايا في الانفصال (3-5 دقائق).</li>
		<li>أضف 1 مل من وسائط الفحص المكملة ب FBS بنسبة 10٪ إلى كل بئر لتحييد التربسين والماصة لأعلى ولأسفل بقوة لتوليد تعليق أحادي الخلية.</li>
		<li>انقل 1 مل من معلق الخلية إلى أنابيب 15 مل المحددة مسبقا. أضف 1 مل أخرى من وسائط الفحص المكملة ب FBS بنسبة 10٪ إلى كل أنبوب من أنابيب 15 مل.</li>
		<li>اقلب الأنابيب 5x لخلطها وانقل على الفور 20 ميكرولتر من تعليق الخلية إلى الأنبوب 1.</li>
		<li>أجهزة الطرد المركزي في جهاز الطرد المركزي دلو التأرجح المبرد مسبقا لمدة 5 دقائق عند ~ 250 × جم. أثناء خطوة الطرد المركزي ، امزج 20 ميكرولتر من صبغة الخلايا الزرقاء المثقبية مع الخلايا الموجودة في مجموعة الأنبوب 1 ثم عد الخلايا باستخدام إما عداد الخلايا الآلي أو مقياس الدم. العائد من 6-8 × 105 خلايا / مل نموذجي.</li>
		<li>قم بإزالة أنابيب 15 مل من جهاز الطرد المركزي وشفط الوسائط من كريات الخلية. أعد تعليق كريات الخلية إلى 2 × 105 خلايا / مل في وسائط فحص خالية من المصل وماصة بقوة لتوليد تعليق خلية واحدة. ملاحظة: يتم استخدام وسائط الفحص الخالية من المصل لتهدئة مسارات إشارات الخلايا الطبيعية.</li>
	</ol></li>
	<li>إعادة طلاء الخلايا في لوحات 384 بئر و 6 آبار كما هو موضح أدناه.<ol><li>اقلب أنابيب 15 مل عدة مرات لضمان تعليق خلية متجانسة ونقل أنابيب 500 ميكرولتر إلى 1.7 مل مجموعة 2 ومجموعة 3.</li>
		<li>أضف 0.5 ميكرولتر من DMSO (+ مركبة) للضبط 2 و 0.5 ميكرولتر من Halo 618 ligand (+ ligand) إلى مجموعة الأنبوب 3 والماصة للخلط.</li>
		<li>نقل معلقات خلايا + مركبة و + ليجند إلى آبار منفصلة لخزانات الكاشف. باستخدام الماصة متعددة القنوات (جدول المواد) ، انقل 40 ميكرولتر من تعليق خلية + مركبة من خزانات الكاشف إلى الآبار المكررة أربع مرات للوحة الاستزراع المكونة من 384 بئرا. كرر هذه الخطوة لمعلقات خلايا الرباط +.</li>
		<li>نقل الخلايا المتبقية إلى لوحات ثقافة جديدة من 6 آبار. احتضان الألواح المكونة من 384 بئرا و 6 آبار طوال الليل عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2.</li>
	</ol></li>
</ol>4. قراءة انبعاثات BRET (اليوم 4)
ملاحظة: في هذه الخطوة ، تتم إضافة ركيزة nanoluciferase (انظر جدول المواد للحصول على التفاصيل) إلى الخلايا الموجودة في لوحة الاستزراع المكونة من 384 بئرا ويتم قراءة انبعاثات متقبل N-BRET (618 نانومتر) والمانحة (460 نانومتر) (الشكل 2). ثم يتم حساب نسب BRET المصححة.
<ol><li>قم بتسخين وسائط الفحص الخالية من المصل مسبقا في حمام مائي بدرجة حرارة 37 درجة مئوية وقم بإذابة ركيزة nanoluciferase عند 25 درجة مئوية. تمييع الركيزة نانولوسيفيراز 1: 100 في وسائط فحص خالية من المصل ونقلها إلى خزان الكاشف. قم بإعداد ما يكفي من هذا الخليط لإضافة 10 ميكرولتر إلى كل بئر من لوحة 384 بئرا ، بالإضافة إلى 10٪ -15٪ حجم إضافي.</li>
	<li>باستخدام ماصة متعددة القنوات (جدول المواد) ، انقل 10 ميكرولتر من خليط الركيزة إلى كل بئر من الآبار التي تحتوي على خلايا في لوحة الاستزراع المكونة من 384 بئرا. قم بتدوير اللوحة برفق لمدة 1 دقيقة ، إما يدويا أو باستخدام شاكر مداري.</li>
	<li>أدخل لوحة 384 بئرا في قارئ الألواح متعدد الأوضاع وسجل انبعاثات 460 نانومتر و 618 نانومتر لجميع الآبار التي تحتوي على خلايا. ملاحظة: بالنسبة لقارئ الألواح متعدد الأوضاع المستخدم في هذه الخطوة (انظر جدول المواد للحصول على التفاصيل)، تم استخدام ارتفاع قراءة يبلغ 6.5 مم، مع قياس وقت قراءة 0.1 ثانية، ومع ذلك قد تكون هناك حاجة إلى مزيد من التحسين في حالة استخدام قارئات لوحات أخرى.</li>
	<li>احسب نسب BRET الأولية ل + مركبة و + ligand بوحدات milliBRET (mBU) بشكل فردي ، باستخدام المعادلة التالية: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/66436/66436eq01.jpg" style="margin: auto;"></li>
	<li>احسب نسبة BRET المصححة بطرح نسبة + BRET للمركبة من نسبة + Ligand (الجدول التكميلي 1). ملاحظة: عند مقارنة نتائج تجارب متعددة ، يمكن تجميع نسب BRET المصححة وتسويتها إلى متوسط زوج Wildtype (WT) N-BRET ، الذي يتكون منNano-CRAF WT و 14-3-3ζWT-Halo (الجدول التكميلي 1).</li>
</ol>5. تأكيد مستويات التعبير عن البروتين (الأيام 4 و 5)
ملاحظة: في هذه الخطوة ، يتم تحليل الخلايا الموجودة في الصفائح المكونة من 6 آبار ويتم تحديد مستويات التعبير البروتيني لبروتينات Nano-CRAF و 14-3-3ζ-Halo عن طريق تحليل اللطخة الغربية باستخدام الأجسام المضادة الخاصة بعلامات Halo و Nano. (الشكل 2).
<ol><li>أضف مثبطات الأنزيم البروتيني والفوسفاتيز إلى محلول تحلل NP40 (جدول المواد) ، مما يسمح ب 200 ميكرولتر من محلول التحلل لكل عينة.</li>
	<li>نضح الوسائط من 6 لوحات جيدة تحتوي على خلايا. اغسل الخلايا مرة واحدة مع 1 مل من برنامج تلفزيوني بارد ونضح.</li>
	<li>أضف 125 ميكرولتر من محلول تحلل NP40 إلى كل بئر واحتضان 6 ألواح بئر عند 4 درجات مئوية على منصة هزازة لمدة 15 دقيقة لتحلل الخلايا.</li>
	<li>نقل المحللات إلى أنابيب سعة 1.7 مل على الثلج وأجهزة الطرد المركزي عند 20000 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية. ضع المحللة التي تم تطهيرها مرة أخرى على الثلج وحدد تركيز البروتين باستخدام المقايسات المتاحة تجاريا ، مثل مقايسات حمض برادفورد أو حمض بيكينشونيك (BCA).</li>
	<li>تطبيع تركيز البروتين عبر جميع العينات عن طريق نقل حجم مناسب من محلول المحللة ومحلول تحلل NP40 إلى أنابيب جديدة سعة 1.7 مل إلى حجم إجمالي قدره 100 ميكرولتر.</li>
	<li>قم بغلي 5x من محلول عينة البروتين (جدول المواد) لمدة 1 دقيقة وأضف 25 ميكرولتر لكل عينة. قم بغلي العينات لمدة 5-6 دقائق ثم قم بنبض أجهزة الطرد المركزي للأنابيب لفترة وجيزة لضمان تجمع كل العينة في قاعدة الأنبوب.</li>
	<li>قم بتحميل 25 ميكرولتر من العينة في كل بئر من المواد الهلامية البروتينية المكررة (الجل 1 والجل 2) ثم انقل البروتينات إلى أغشية النيتروسليلوز أو PVDF باستخدام إجراءات النشاف الغربية القياسية ، كما هو موضح سابقا22.</li>
	<li>قم بسد الأغشية في 3٪ BSA-PBS عند 25 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة ثم احتضان الأغشية طوال الليل باستخدام الأجسام المضادة Halo (1: 1000 تخفيف ؛ جل 1) وإما نانولوسيفيراز أو جسم مضاد CRAF (تخفيف 1: 500 ؛ جل 2) في محلول ملحي مخزن تريس ، مكمل ب 0.2٪ توين -20 (TBST ؛ جدول المواد).</li>
	<li>اغسل الأغشية 1x لمدة 5 دقائق في 10 مل من TBST ثم احتضانها في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة باستخدام الجسم المضاد الثانوي HRP المضاد للفأر ، المخفف 1: 10000 في TBST.</li>
	<li>اغسل الأغشية 3 مرات على منصة هزازة في 10 مل من TBST عند 25 درجة مئوية لمدة 5 دقائق لكل منها. قم بإزالة TBST وتصور نطاقات البروتين باستخدام كواشف ECL وإما معالج فيلم الأشعة السينية أو أي نظام تصوير مناسب آخر.</li>
</ol>

تحليل التفاعل CRAF-14-3-3 في الخلايا الحية باستخدام نهج قائم على BRET

<ol>
	<li>Blasco, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=c-Raf,+but+not+B-Raf,+is+essential+for+development+of+K-Ras+oncogene-driven+non-small+cell+lung+carcinoma.">c-Raf, but not B-Raf, is essential for development of K-Ras oncogene-driven non-small cell lung carcinoma.</a> Cancer Cell. 19, 652-663 (2011).</li><li>Blasco, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complete+regression+of+advanced+pancreatic+ductal+adenocarcinomas+upon+combined+inhibition+of+EGFR+and+C-RAF.">Complete regression of advanced pancreatic ductal adenocarcinomas upon combined inhibition of EGFR and C-RAF.</a> Cancer Cell. 35, 573-587 (2019).</li><li>Karreth, F. A., Frese, K. K., DeNicola, G. M., Baccarini, M., Tuveson, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C-Raf+is+required+for+the+initiation+of+lung+cancer+by+K-Ras(G12D).">C-Raf is required for the initiation of lung cancer by K-Ras(G12D).</a> Cancer Discov. 1, 128-136 (2011).</li><li>Lito, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+CRAF-mediated+MEK+activation+is+required+for+effective+MEK+inhibition+in+KRAS+mutant+tumors.">Disruption of CRAF-mediated MEK activation is required for effective MEK inhibition in KRAS mutant tumors.</a> Cancer Cell. 25, 697-710 (2014).</li><li>Sanclemente, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=c-RAF+ablation+induces+regression+of+advanced+Kras/Trp53+mutant+lung+adenocarcinomas+by+a+mechanism+independent+of+MAPK+signaling.">c-RAF ablation induces regression of advanced Kras/Trp53 mutant lung adenocarcinomas by a mechanism independent of MAPK signaling.</a> Cancer Cell. 33, 217-228 (2018).</li><li>Razzaque, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germline+gain-of-function+mutations+in+RAF1+cause+Noonan+syndrome.">Germline gain-of-function mutations in RAF1 cause Noonan syndrome.</a> Nat Genet. 39, 1013-1017 (2007).</li><li>Pandit, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gain-of-function+RAF1+mutations+cause+Noonan+and+LEOPARD+syndromes+with+hypertrophic+cardiomyopathy.">Gain-of-function RAF1 mutations cause Noonan and LEOPARD syndromes with hypertrophic cardiomyopathy.</a> Nat Genet. 39, 1007-1012 (2007).</li><li>Terrell, E. M., Morrison, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ras-mediated+activation+of+the+Raf+family+kinases.">Ras-mediated activation of the Raf family kinases.</a> Cold Spring Harb Perspect Med. 9 (1), 033746 (2019).</li><li>Kondo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-EM+structure+of+a+dimeric+B-Raf:14-3-3+complex+reveals+asymmetry+in+the+active+sites+of+B-Raf+kinases.">Cryo-EM structure of a dimeric B-Raf:14-3-3 complex reveals asymmetry in the active sites of B-Raf kinases.</a> Science. 366, 109-115 (2019).</li><li>Park, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Architecture+of+autoinhibited+and+active+BRAF-MEK1-14-3-3+complexes.">Architecture of autoinhibited and active BRAF-MEK1-14-3-3 complexes.</a> Nature. 575 (7783), 545-550 (2019).</li><li>Tzivion, G., Luo, Z., Avruch, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+dimeric+14-3-3+protein+is+an+essential+cofactor+for+Raf+kinase+activity.">A dimeric 14-3-3 protein is an essential cofactor for Raf kinase activity.</a> Nature. 394, 88-92 (1998).</li><li>Spencer-Smith, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RASopathy+mutations+provide+functional+insight+into+the+BRAF+cysteine-rich+domain+and+reveal+the+importance+of+autoinhibition+in+BRAF+regulation.">RASopathy mutations provide functional insight into the BRAF cysteine-rich domain and reveal the importance of autoinhibition in BRAF regulation.</a> Mol Cell. 82, 4262-4276 (2022).</li><li>Martinez Fiesco, J. A., Durrant, D. E., Morrison, D. K., Zhang, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+insights+into+the+BRAF+monomer-to-dimer+transition+mediated+by+RAS+binding.">Structural insights into the BRAF monomer-to-dimer transition mediated by RAS binding.</a> Nat Commun. 13, 486 (2022).</li><li>Freeman, A. K., Ritt, D. A., Morrison, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+importance+of+Raf+dimerization+in+cell+signaling.">The importance of Raf dimerization in cell signaling.</a> Small GTPases. 4, 180-185 (2013).</li><li>Freeman, A. K., Ritt, D. A., Morrison, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+Raf+dimerization+and+its+inhibition+on+normal+and+disease-associated+Raf+signaling.">Effects of Raf dimerization and its inhibition on normal and disease-associated Raf signaling.</a> Mol Cell. 49, 751-758 (2013).</li><li>Rushworth, L. K., Hindley, A. D., O'Neill, E., Kolch, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+and+role+of+Raf-1/B-Raf+heterodimerization.">Regulation and role of Raf-1/B-Raf heterodimerization.</a> Mol Cell Biol. 26, 2262-2272 (2006).</li><li>Garnett, M. J., Rana, S., Paterson, H., Barford, D., Marais, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wild-type+and+mutant+B-RAF+activate+C-RAF+through+distinct+mechanisms+involving+heterodimerization.">Wild-type and mutant B-RAF activate C-RAF through distinct mechanisms involving heterodimerization.</a> Mol Cell. 20, 963-969 (2005).</li><li>Tran, N. H., Wu, X., Frost, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B-Raf+and+Raf-1+are+regulated+by+distinct+autoregulatory+mechanisms.">B-Raf and Raf-1 are regulated by distinct autoregulatory mechanisms.</a> J Biol Chem. 280, 16244-16253 (2005).</li><li>Chong, H., Guan, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+Raf+through+phosphorylation+and+N+terminus-C+terminus+interaction.">Regulation of Raf through phosphorylation and N terminus-C terminus interaction.</a> J Biol Chem. 278, 36269-36276 (2003).</li><li>Cutler, R. E., Stephens, R. M., Saracino, M. R., Morrison, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autoregulation+of+the+Raf-1+serine/threonine+kinase.">Autoregulation of the Raf-1 serine/threonine kinase.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 95, 9214-9219 (1998).</li><li>Park, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-EM+structure+of+a+RAS/RAF+recruitment+complex.">Cryo-EM structure of a RAS/RAF recruitment complex.</a> Nat Commun. 14, 4580 (2023).</li><li>Spencer-Smith, R., Morrison, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocol+for+measuring+BRAF+autoinhibition+in+live+cells+using+a+proximity-based+NanoBRET+assay.">Protocol for measuring BRAF autoinhibition in live cells using a proximity-based NanoBRET assay.</a> STAR Protoc. 4, 102461 (2023).</li><li>Clark, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=14-3-3+zeta+negatively+regulates+raf-1+activity+by+interactions+with+the+Raf-1+cysteine-rich+domain.">14-3-3 zeta negatively regulates raf-1 activity by interactions with the Raf-1 cysteine-rich domain.</a> J Biol Chem. 272, 20990-20993 (1997).</li><li>Machleidt, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NanoBRET--A+novel+BRET+platform+for+the+analysis+of+protein-protein+interactions.">NanoBRET--A novel BRET platform for the analysis of protein-protein interactions.</a> ACS Chem Biol. 10, 1797-1804 (2015).</li><li>Hekman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+changes+in+C-Raf+phosphorylation+and+14-3-3+protein+binding+in+response+to+growth+factor+stimulation:+differential+roles+of+14-3-3+protein+binding+sites.">Dynamic changes in C-Raf phosphorylation and 14-3-3 protein binding in response to growth factor stimulation: differential roles of 14-3-3 protein binding sites.</a> J Biol Chem. 279, 14074-14086 (2004).</li><li>Hatzivassiliou, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RAF+inhibitors+prime+wild-type+RAF+to+activate+the+MAPK+pathway+and+enhance+growth.">RAF inhibitors prime wild-type RAF to activate the MAPK pathway and enhance growth.</a> Nature. 464, 431-435 (2010).</li><li>Bondzi, C., Grant, S., Krystal, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+assay+for+the+measurement+of+Raf-1+kinase+activity.">A novel assay for the measurement of Raf-1 kinase activity.</a> Oncogene. 19, 5030-5033 (2000).</li><li>Spencer-Smith, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+RAS+function+through+targeting+an+allosteric+regulatory+site.">Inhibition of RAS function through targeting an allosteric regulatory site.</a> Nat Chem Biol. 13 (1), 62-68 (2016).</li><li>Roy, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=14-3-3+facilitates+Ras-dependent+Raf-1+activation+in+vitro+and+in+vivo.">14-3-3 facilitates Ras-dependent Raf-1 activation in vitro and in vivo.</a> Mol Cell Biol. 18, 3947-3955 (1998).</li><li>Durrant, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+high-throughput+NanoBRET+screening+platform+to+identify+modulators+of+the+RAS/RAF+interaction.">Development of a high-throughput NanoBRET screening platform to identify modulators of the RAS/RAF interaction.</a> Mol Cancer Ther. 20, 1743-1754 (2021).</li></ol>

لا شيء للكشف عنه.

أظهرت الدراسات السابقة أن بروتينات 14-3-3 تلعب أدوارا حاسمة في كل من تنشيط وتثبيط كينازات RAF. إن فهم كيفية تنظيم هذه الأحداث الملزمة وتأثيرات تعديل هذه التفاعلات على إشارات سلاح الجو الملكي البريطاني وتكوين الأورام المدفوع بسلاح الجو الملكي البريطاني قد يكشف عن نقاط ضعف علاجية جديدة تستهدف ...

كينازات سلاح الجو الملكي البريطاني (ARAF و BRAF و CRAF) هي المستجيبات المباشرة ل RAS GTPases والأعضاء البادئين في سلسلة كيناز RAF-MEK-ERK المؤيدة للتكاثر / المؤيدة للبقاء. أظهرت الدراسات الحديثة أن تعبير CRAF يلعب دورا رئيسيا في تكوين الأورام للعديد من السرطانات التي تحركها KRAS ، بما في ذلك سرطان الرئة ذو الخلايا غير الصغيرة وسرطان الغدة القنوية البنكرياسية1،2،3،4،5. علاوة على ذلك ، تسبب طفرات CRAF الجرثومية شكلا حادا بشكل خاص من اعتلال RASopathy ، متلازمة نونان 6,7. يعد فهم تنظيم CRAF أمرا بالغ الأهمية لتطوير مناهج علاجية ناجحة تستهدف وظيفتها في الخلايا.
يمكن تقسيم جميع كينازات RAF إلى مجالين وظيفيين ، مجال تحفيزي C-terminal (CAT) ومجال تنظيمي N-terminal (REG) ، يتحكم في نشاطه (الشكل 1A)8. يشمل مجال REG مجال ربط RAS (RBD) ، والمجال الغني بالسيستين (CRD) ، ومنطقة غنية بالسيرين / ثريونين (S / T-rich). والجدير بالذكر أن المنطقة الغنية ب S / T تحتوي على موقع N ، الذي يرتبط ب 14-3-3 بطريقة تعتمد على الفسفرة (S259 في CRAF ؛ الشكل 1 أ) 8. يشمل مجال CAT مجال كيناز ، إلى جانب موقع إرساء ثان عالي التقارب 14-3-3 ، يشار إليه باسم موقع C (S621 في CRAF ؛ الشكل 1 أ) 8. يلعب الارتباط التفاضلي للبروتينات 14-3-3 dimeric بمواقع N 'و C ، جنبا إلى جنب مع CRD ، أدوارا حاسمة في كل من تنشيط وتثبيط RAF9،10،11،12،13. في ظل ظروف الإشارات العادية ، يبدأ تنشيط RAF من خلال تجنيده في غشاء البلازما بواسطة RAS ، مما يسمح له بتكوين دايمرات نشطة ، والتي يكون مغاير BRAF-CRAF هو الشكل النشط السائد14,15. تشير المقايسات الكيميائية الحيوية باستخدام BRAF و CRAF ، جنبا إلى جنب مع هياكل المجهر الإلكتروني المبرد (Cryo-EM) ل dimeric BRAF ، إلى أن dimer 14-3-3 يعمل على استقرار ثنائيات RAF النشطة عن طريق الارتباط في وقت واحد بموقع C 'لكل من بروتومرات RAF (الشكل 1B) 9،13،16،17. على العكس من ذلك ، أظهرت الدراسات أنه في ظل ظروف هادئة ، يتبنى RAF تأكيدا خلويا ومثبطا ذاتيا ، حيث يرتبط مجال REG بمجال CAT ويمنع نشاطه12،18،19،20. يتم تثبيت هذه الحالة المغلقة بواسطة dimer 14-3-3 المرتبط بموقع CRD و N 'في مجال REG وموقع C في مجال CAT (الشكل 1B) 10،13،21. في BRAF ، يتم دعم هذا النموذج من خلال هياكل Cryo-EM الحديثة لمونومرات BRAF ذاتية التثبيط ودراساتنا الكيميائية الحيويةالسابقة 10،12،13،21،22. ومع ذلك، ففي حين تبين أن المادة 14-3-3 تؤدي دورا مثبطا في المادة23 من النظام الأساسي لاتفاقية الإبلاغ الموحد، فإن حالة التثبيط الذاتي الشبيهة ب BRAF قد تؤدي دورا أقل في المادة12 من النظام الأساسي للنموذج الموحد؛ لذلك هناك حاجة إلى مزيد من الدراسات لتوضيح الآليات التي تنظم بها البروتينات 14-3-3 نشاط CRAF. يتطلب التنظيم بوساطة 14-3-3 لكينازات RAF عددا كبيرا من أحداث فسفرة RAF وإزالة الفسفرة ، والارتباط بالبروتينات التنظيمية المختلفة ، والتفاعلات مع غشاء البلازما8. لذلك ، من الأهمية بمكان أن يتم قياس تفاعلات 14-3-3-RAF في ظل ظروف ذات صلة من الناحية الفسيولوجية وفي وجود طبقة ثنائية دهنية سليمة.
لمعالجة هذه المشكلة ، تم استخدام تقنية NanoBRET (من هنا فصاعدا المشار إليها باسم N-BRET ؛ انظر جدول المواد للحصول على تفاصيل المجموعة) لتطوير مقايسة قائمة على القرب لقياس تفاعلات CRAF مع 14-3-3 بروتينات في الخلايا الحية (الشكل 1C). يقيس هذا النظام القائم على BRET تفاعلات اثنين من البروتينات ذات الأهمية (POI) ، حيث يتم تمييز أحد البروتينات بمتبرع نانولوسيفيراز (نانو) والآخر بعلامة Halo ، لوضع العلامات باستخدام متقبل الطاقة Halo618 ligand22,24. يؤدي تفاعل البروتينات ذات الأهمية إلى نقل الطاقة من مانح إلى متلقي ، والذي بدوره يولد إشارة BRET (الشكل 1C). يوفر البروتين المانح النانوي شديد السطوع (الانبعاث (em) 460 نانومتر) و Halo618 ligand (em 618 nm) فصلا طيفيا وحساسية أكبر على BRET التقليدي ، مما يجعله منصة مثالية لدراسة التفاعلات الأضعف واكتشاف التغييرات الطفيفة في الربط24. في الواقع ، قمنا سابقا بتطوير اختبار قائم على N-BRET لقياس تفاعلات التثبيط الذاتي لمجالات RAF REG و CAT ، والتي كانت ضرورية لتوصيف لوحة من طفرات RASopathy في BRAF CRD وأظهرنا الأهمية الحاسمة لهذا المجال للحفاظ على التثبيط الذاتي ومنع تنشيط BRAF التأسيسي12.
يقيس الفحص الموصوف هنا تفاعلات CRAF ، المنصهرة في علامة نانو N-terminal (Nano-CRAF) ، وشكل زيتا المتماثل ل 14-3-3 المنصهر في علامة الهالة الطرفية C (14-3-3ζ-Halo; الشكل 1 ج). لقد أظهرنا أن تفاعلات Nano-CRAF مع 14-3-3ζ-Halo تولد إشارة BRET قوية ، والتي بدورها يمكن أن تتعطل بسبب الطفرات التي تمنع ارتباط 14-3-3 بموقع N (S259A) و / أو موقع C (S621A). يوفر البروتوكول التالي خطوات مفصلة لإجراء هذا الفحص وتحسينه واستكشاف الأخطاء وإصلاحه.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Antibodies&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HaloTag&#174; mouse monoclonal antibody</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G9211&#160;</td>
			<td>Antibody for detecting HaloTag tagged&#160; proteins by immunoblot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoLuc&#174; mouse monoclonal antibody</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>MAB10026</td>
			<td>Antibody for detecting Nano-tagged proteins by immunoblot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CRAF mouse monoclonal antibody (E10)&#160;</td>
			<td>Santa Crus Biotechnology</td>
			<td>sc-7267</td>
			<td>Antibody directly detecting CRAF proteins by immunoblot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECL anti-mouse HRP secondary antibody</td>
			<td>Amersham</td>
			<td>NA931-1ML&#160;</td>
			<td>Secondary HRP conjugated mouse antibody (from sheep)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-tremeGENE&#8482; 9</td>
			<td>Roche/Sigma</td>
			<td>6365809001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoBRET&#8482; kit&#160;</td>
			<td>Promega</td>
			<td>N1661&#160;</td>
			<td>NanoBRET kit containing Halo 618 ligand and NanoGlo (nanoluciferase) substrate&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS, without Ca++ and Mg++&#160;</td>
			<td>Quality Biologicals&#160;</td>
			<td>114-057-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>25300120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM cell culture media</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11995073</td>
			<td>High glucose, L-glutamine, phenol red, sodium&#160; pyruvate; without HEPES, suppliment media with 10% FBS, 2 mM L-glutamine and 100U penicillin-streptomycin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine (200 mM)&#160;&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>25030164</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)&#160;</td>
			<td>Life Technologies&#160;&#160;</td>
			<td>15140163</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM&#8482; I reduced serum media&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31985062</td>
			<td>For cell transfection&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM reduced serum media, no phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11058021</td>
			<td>For replating cells on Day 3. Supplement with 2 mM L-glutamine and 100U penicillin-streptomycin, along with 10% FBS (where indicated).&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Invitrogen Trypan Blue Stain&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific&#160;</td>
			<td>T10282&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NP40 lysis buffer&#160;</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>20 mM Tris (pH 8.0), 137mM NaCl, 10% glycerol,&#160; NP40 alternative (Milipore, Cat# 492016). Store at 4 degrees C.. Add the following protease and phosphatase immediately prior to use: 20 &#181;M leupeptin, 0.5 mM sodium orthovanidate, 0.15 U/mL, 1mM PMSF.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5x gel sample buffer</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>240 mM Tris (pH 8.0), 9.5% SDS, 30% glycerol, 500mM DTT, 3mM bromophenol blue. Store at -20 degrees C.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell lines&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>293FT cells (human)</td>
			<td>Thermo Scientific&#160;</td>
			<td>R70007&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA vectors&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCMV5-Nano-CRAF WT and mutant&#160;</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCMV5-14-3-3&#950;-Halo&#160;&#160;</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EnVision 2104 Multimode Plate Reader</td>
			<td>PerkinElmer 2104</td>
			<td>2104-0010&#160;</td>
			<td>600LP NanoBRET &#38; M460/50 nm NanoBRET emmisions filters,&#160; Luminescence 404 mirror, 6.5 mm measurement height and 0.1 s measurement time</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Invitrogen Countess&#8482; II Automated Cell Counter&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>AMQAX1000&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ThermoFisher E1-ClipTip&#8482;&#160; Multichannel&#160; Pipettor&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific&#160;&#160;</td>
			<td>4672070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism (version 10.0.3)&#160;</td>
			<td>GraphPad&#160;</td>
			<td>www.graphpad.com</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Other&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ThermoFisher ClipTip Multichannel pipette tips&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific&#160;</td>
			<td>94410153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagent Reservoir, 25 mL Divided, Sterile&#160;</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>1228K16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perkin Elmer 384-well CulturPlate&#8482;</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>6007680</td>
			<td>White, polystyrene, tissue culture treated&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess Cell Counting Chamber Slides</td>
			<td>Thermo Scientific&#160;</td>
			<td>C10228</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

bioluminescence resonance energy transfer (bret)-based assay for measuring interactions of craf with 14-3-3 proteins in live cells

CRAF هو المستجيب الأساسي ل RAS GTPases ويلعب دورا مهما في تكوين الأورام للعديد من السرطانات التي تحركها KRAS. بالإضافة إلى ذلك ، يعد CRAF نقطة ساخنة لطفرات الخط الجرثومي ، والتي ثبت أنها تسبب اعتلال RASopathy التنموي ، متلازمة نونان. تحتوي جميع كينازات RAF على مواقع ربط متعددة تعتمد على الفسفرة ل 14-3-3 بروتينات تنظيمية. يلعب الارتباط التفاضلي ل 14-3-3 لهذه المواقع أدوارا أساسية في تكوين ثنائيات RAF النشطة في غشاء البلازما في ظل ظروف الإشارات وفي الحفاظ على التثبيط الذاتي لسلاح الجو الملكي البريطاني في ظل ظروف هادئة. يعد فهم كيفية تنظيم هذه التفاعلات وكيف يمكن تعديلها أمرا بالغ الأهمية لتحديد الأساليب العلاجية الجديدة التي تستهدف وظيفة سلاح الجو الملكي البريطاني. هنا ، أصف مقايسة نقل طاقة الرنين الحيوي (BRET) لقياس تفاعلات CRAF مع 14-3-3 بروتينات في الخلايا الحية. على وجه التحديد ، يقيس هذا الفحص تفاعلات CRAF المنصهرة مع مانح نانو لوسيفيراز و 14-3-3 المنصهرة مع متقبل علامة Halo ، حيث يؤدي تفاعل RAF و 14-3-3 إلى نقل الطاقة من مانح إلى متقبل وتوليد إشارة BRET. يوضح البروتوكول كذلك أن هذه الإشارة يمكن أن تتعطل بسبب الطفرات التي تظهر لمنع ارتباط 14-3-3 بكل موقع من مواقع الإرساء عالية التقارب لسلاح الجو الملكي البريطاني. يصف هذا البروتوكول إجراءات بذر الخلايا ونقلها وإعادة طلائها ، إلى جانب تعليمات مفصلة لقراءة انبعاثات BRET ، وإجراء تحليل البيانات ، وتأكيد مستويات التعبير عن البروتين. بالإضافة إلى ذلك ، يتم توفير أمثلة على نتائج الفحص ، جنبا إلى جنب مع خطوات التحسين واستكشاف الأخطاء وإصلاحها.

RAF kinases (ARAF, BRAF, and CRAF) are the direct effectors of RAS GTPases and the initiating members of the pro-proliferative/pro-survival RAF-MEK-ERK kinase cascade. Recent studies have shown that CRAF expression plays a key role in the tumorigenesis of several KRAS-driven cancers, including non-small cell lung cancer and pancreatic ductal adenocarcinoma1,2,3,4,5. Moreover, germline CRAF mutations cause a particularly severe form of the RASopathy, Noonan syndrome6,7. Understanding CRAF regulation is critical for developing successful therapeutic approaches that target its function in cells.
All RAF kinases can be divided into two functional domains, a C-terminal catalytic (CAT) domain and an N-terminal regulatory (REG) domain, that controls its activity (Figure 1A)8. The REG domain encompasses the RAS binding domain (RBD), the cysteine-rich domain (CRD), and a serine/threonine-rich region (S/T-rich). Notably, the S/T-rich region contains the N&#39; site, which binds to 14-3-3 in a phosphorylation-dependent manner (S259 in CRAF; Figure 1A)8. The CAT domain encompasses the kinase domain, along with a second high-affinity 14-3-3 docking site, referred to as the C&#39; site (S621 in CRAF; Figure 1A)8. The differential binding of dimeric 14-3-3 proteins to the N&#39; and C&#39; sites, along with the CRD, plays critical roles in both RAF activation and inhibition9,10,11,12,13. Under normal signaling conditions, RAF activation is initiated by its recruitment to the plasma membrane by RAS, allowing it to form active dimers, of which the BRAF-CRAF heterodimer is the predominant active form14,15. Biochemical assays with BRAF and CRAF, along with cryogenic electron microscopy (Cryo-EM) structures of dimeric BRAF, indicate that a 14-3-3 dimer stabilizes active RAF dimers by binding simultaneously to the C&#39; site of both RAF protomers (Figure 1B)9,13,16,17. Conversely, studies have shown that under quiescent conditions, RAF adopts a cytosolic, autoinhibited confirmation, where the REG domain binds to the CAT domain and inhibits its activity12,18,19,20. This closed state is stabilized by a 14-3-3 dimer bound to the CRD and N&#39; site in the REG domain and to the C&#39; site in the CAT domain (Figure 1B)10,13,21. In BRAF, this model is supported by recent Cryo-EM structures of autoinhibited BRAF monomers and by our previous biochemical studies10,12,13,21,22. However, while 14-3-3 is shown to play an inhibitory role in CRAF regulation23, a BRAF-like autoinhibited state may play a lesser role in CRAF regulation12; therefore further studies are required to clarify the mechanisms by which 14-3-3 proteins regulate CRAF activity. The 14-3-3-mediated regulation of RAF kinases requires a plethora of RAF phosphorylation and de-phosphorylation events, the binding to various regulatory proteins, and interactions with the plasma membrane8. Therefore, it is critical that 14-3-3-RAF interactions are measured under physiologically relevant conditions and in the presence of an intact lipid bilayer.
To address this issue, NanoBRET (from here on referred to as N-BRET; see Table of Materials for kit details) technology was utilized to develop a proximity-based assay for measuring the interactions of CRAF with 14-3-3 proteins in live cells (Figure 1C). This BRET-based system measures the interactions of two proteins of interest (POI), where one protein is tagged with a nanoluciferase (Nano) donor and the other with a Halo tag, for labeling with the Halo618 energy acceptor ligand22,24. Interaction of the proteins of interest results in donor to acceptor energy transfer, which in turn generates the BRET signal (Figure 1C). The extremely bright Nano donor protein (emission (em) 460 nm) and the Halo618 ligand (em 618 nm) provide greater spectral separation and sensitivity over conventional BRET, making it an ideal platform for studying weaker interactions and detecting subtle changes in binding24. Indeed, we previously developed a N-BRET-based assay for measuring the autoinhibitory interactions of the RAF REG and CAT domains, which was essential for the characterization of a panel of RASopathy mutations in the BRAF CRD and demonstrated the critical importance of this domain for maintaining autoinhibition and preventing constitutive BRAF activation12.
The assay described here measures the interactions of CRAF, fused to an N-terminal Nano tag (Nano-CRAF), and the zeta isoform of 14-3-3 fused to C-terminal Halo tag (14-3-3&#950;-Halo; Figure 1C). We show that the interactions of Nano-CRAF with 14-3-3&#950;-Halo generates a robust BRET signal, which can in turn be disrupted by mutations which prevent 14-3-3 binding to the N&#39; site (S259A) and/or the C&#39; site (S621A). The following protocol provides detailed steps for performing, optimizing, and troubleshooting this assay.

تسليط الضوء على المؤلف: دمج المقايسات المستندة إلى BRET وتحليل الطفرات النادرة لفك تشفير تنظيم كيناز RAF في الخلايا الحية

المقايسة القائمة على نقل طاقة الرنين للتلألؤ الحيوي (BRET) لقياس تفاعلات CRAF مع 14-3-3 بروتينات في الخلايا الحية

The primary focus of our research is to uncover new vulnerabilities in the Ras-MAPK kinase pathway through the study of rare disease associated mutations within. We recently developed another BRET-based assay for measuring the auto inhibitory activities of RAF kinases in live cells. Importantly, this assay was essential for characterizing a group of rare germline mutations in the BRAF cysteine rich domain, which demonstrated the critical importance of this domain for maintaining BRAF auto inhibition and for preventing constitutive BRAF biological activity.This assay measures the interactions of 1433 proteins with the RAF kinase CRAF, and these interactions play essential roles in mediating RAF function in both development and disease. In addition, this assay combined with previously established assays for measuring RAF auto inhibition and the RAF-RAF interaction form the basis of a toolkit for dissecting the regulatory mechanisms of RAF kinases in live cells.

عند إجراء كما هو موضح في هذا البروتوكول (الشكل 2) ، يجب أن ينتج تفاعل Nano-CRAFWT و 14-3-3ζ-Halo نسب BRET مصححة من 50-60 mBU (الشكل 3A ؛ الجدول التكميلي 1). يحتوي CRAF على موقعين للرسو يعتمدان على الفسفرة 14-3-3 ، موقع N وموقع C (الشكل 1)8. لذلك...

Read this Scientific Article Protocol about Author Spotlight: Integrating BRET-Based Assays and Rare Mutation Analysis to Decipher RAF Kinase Regulation in Live Cells at JoVE.com

يصف هذا البروتوكول مقايسة قائمة على BRET لقياس تفاعلات كيناز CRAF مع 14-3-3 بروتينات في الخلايا الحية. يحدد البروتوكول خطوات لإعداد الخلايا ، وقراءة انبعاثات BRET ، وتحليل البيانات. يتم أيضا تقديم مثال على النتيجة مع تحديد عناصر التحكم المناسبة واستكشاف الأخطاء وإصلاحها لتحسين الفحص.

CRAF is a primary effector of RAS GTPases and plays a critical role in the tumorigenesis of several KRAS-driven cancers. In addition, CRAF is a hotspot ...

ينصب التركيز الأساسي لبحثنا على الكشف عن نقاط الضعف الجديدة في مسار كيناز Ras-MAPK من خلال دراسة الطفرات المرتبطة بالأمراض النادرة بداخله. لقد طورنا مؤخرا مقايسة أخرى قائمة على BRET لقياس الأنشطة المثبطة التلقائية لكينازات RAF في الخلايا الحية. الأهم من ذلك ، كان هذا الفحص ضروريا لتوصيف مجموعة من طفرات الخط الجرثومي النادرة في المجال الغني بالسيستين BRAF ، مما يدل على الأهمية الحاسمة لهذا المجال للحفاظ على تثبيط BRAF الذاتي ولمنع النشاط البيولوجي التأسيسي BRAF.يقيس هذا الفحص تفاعلات 1433 بروتينا مع RAF kinase CRAF ، وتلعب هذه التفاعلات أدوارا أساسية في التوسط في وظيفة RAF في كل من التطور والمرض. بالإضافة إلى ذلك ، فإن هذا الفحص جنبا إلى جنب مع المقايسات المحددة مسبقا لقياس تثبيط RAF التلقائي وتفاعل RAF-RAF يشكل الأساس لمجموعة أدوات لتشريح الآليات التنظيمية لكينازات RAF في الخلايا الحية.

bioluminescence-resonance-energy-transfer-bret-based-assay-for

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET)-Based Assay for Measuring Interactions of CRAF with 14-3-3 Proteins in Live Cells

649 Views.  Medical University of South Carolina. ينصب التركيز الأساسي لبحثنا على الكشف عن نقاط الضعف الجديدة في مسار كيناز Ras-MAPK من خلال دراسة الطفرات المرتبطة بالأمراض النادرة بداخله. لقد طورنا مؤخرا مقايسة أخرى قائمة على BRET لقياس الأنشطة المثبطة التلقائية لكينازات RAF في الخلايا الحية. الأهم من ذلك ، كان هذا الفحص ضروريا...

Video: تسليط الضوء على المؤلف: دمج المقايسات المستندة إلى BRET وتحليل الطفرات النادرة لفك تشفير تنظيم كيناز RAF في الخلايا الحية

CRAF is a primary effector of RAS GTPases and plays a critical role in the tumorigenesis of several KRAS-driven cancers. In addition, CRAF is a hotspot for germline mutations, which are shown to cause the developmental RASopathy, Noonan syndrome. All RAF kinases contain multiple phosphorylation-dependent binding sites for 14-3-3 regulatory proteins. The differential binding of 14-3-3 to these sites plays essential roles in the formation of active RAF dimers at the plasma membrane under signaling conditions and in maintaining RAF autoinhibition under quiescent conditions. Understanding how these interactions are regulated and how they can be modulated is critical for identifying new therapeutic approaches that target RAF function. Here, I describe a bioluminescence resonance energy transfer (BRET)-based assay for measuring the interactions of CRAF with 14-3-3 proteins in live cells. Specifically, this assay measures the interactions of CRAF fused to a Nano luciferase donor and 14-3-3 fused to a Halo tag acceptor, where the interaction of RAF and 14-3-3 results in donor-to-acceptor energy transfer and the generation of the BRET signal. The protocol further shows that this signal can be disrupted by mutations shown to prevent 14-3-3 binding to each of its high-affinity RAF docking sites. This protocol describes the procedures for seeding, transfecting, and replating the cells, along with detailed instructions for reading BRET emissions, performing data analysis, and confirming protein expression levels. In addition, example assay results, along with optimization and troubleshooting steps, are provided.

This protocol describes a BRET-based assay for measuring the interactions of the CRAF kinase with 14-3-3 proteins in live cells. The protocol outlines steps for preparing the cells, reading BRET emissions, and data analysis. An example result with identification of appropriate controls and troubleshooting for assay optimization is also presented.

Transfection of 293FT Cells with pCMV5-NanoLuc-CRAF and pCMV5-14-3-3&#950;-Halo Expression Constructs

To begin, take 293FT cells cultured in a 10 centimeter dish, and aspirate the media. Wash cells with five milliliters of PBS. Then add one milliliter of trypsin EDTA, and incubate for 3-5 minutes at 37 degrees Celsius to detach cells from the dish.After incubation, add nine milliliters of complete DMEM to the cells to neutralize the trypsin. Pipette up and down repeatedly to generate a homogenous single cell suspension, and transfer the cells to a 15 milliliter tube. Immediately transfer 20 microliters of cells to a 1.7 milliliter tube, and mix with 20 microliters of trypan blue stain.Count cells using either an automated cell counter or a hemocytometer. Transfer the appropriate volume of cells to a 50 milliliter tube, and dilute in complete DMEM. Add two milliliters of cell suspension to each well of a six-well plate.Incubate cells at 37 degrees Celsius and 10%carbon dioxide overnight. Prior to transfection, dilute nanoluciferase CRAF and 1433 zeta halo plasmids, along with a pCDNA3 empty vector in TE buffer. Label a set of sterile 1.7 milliliter tubes.Add 100 microliters of transfection media to each tube, along with the expression constructs. Now add two microliters of transfection reagent, and vortex gently to mix. Pulse spin the tubes briefly in a microcentrifuge, and then incubate the tubes at around 25 degrees Celsius for 15 minutes to allow transfection complexes to form.Afterwards, add transfection complexes to cells dropwise, and incubate at 37 degrees Celsius for 16-20 hours to express the halo and nanotagged proteins.

نقل خلايا 293FT مع pCMV5-NanoLuc-CRAF و pCMV5-14-3-3ζ-Halo

Preparing 293FT Cells Transfected with pCMV5-NanoLuc-CRAF and pCMV5-14-3-3&#950;-Halo for BRET Emission Assay

To begin, label three sets of sterile 1.7-milliliter tubes and one set of sterile 15-milliliter conical bottom tubes. Prepare a swing bucket centrifuge with 15-milliliter tube inserts and pre-cool to four degrees Celsius. Take the six-well cell culture plate with transfected 293FT cells.Aspirate the media from the wells. Add 250 microliters of trypsin-EDTA and incubate at 37 degrees until cells begin to detach. Then add one milliliter of 10%FBS supplemented assay media to each well and pipette vigorously to create a single-cell suspension.Transfer one milliliter of cell suspension to pre-labeled 15-milliliter tubes. Add one milliliter of 10%FBS supplemented assay media to each of these tubes and invert five times to mix. Then immediately transfer 20 microliters of cell suspension to tube set one.Now centrifuge the 15 milliliter tubes for five minutes at 250 g in a pre-cooled centrifuge. Mix 20 microliters of trypan blue cell stain with cells in set one and count using a cell counter or hemocytometer. After removing the 15-milliliter tubes from the centrifuge, aspirate media from cell pellets and resuspend pellets in serum-free assay media to create a single-cell suspension.To reflate cells in 384-well and six-well plates, invert the 15-milliliter tubes several times for a homogenous cell suspension and transfer 500 microliters to 1.7 milliliter tubes in set two and set three. Add 0.5 microliters of DMSO to set two and 0.5 microliters of Halo 618 ligand to tube set three and mix well. Transfer the DMSO and ligand-positive cell suspensions to separate wells of reagent reservoirs.Use a multi-channel pipette to transfer 40 microliters of each suspension to the 384-well culture plate. Transfer the remaining cells to fresh six-well culture plates for subsequent western blot analysis and incubate both 384-well and six-well plates overnight at 37 degrees Celsius and 5%carbon dioxide. Take serum-free assay media prewarmed at 37 degrees Celsius.Dilute the thawed nanoluciferase substrate 1:100 in serum-free assay media and transfer it to a reagent reservoir. Using a multi-channel pipette, transfer 10 microliters of substrate mixture to each well of the 384-well culture plate. Gently rotate the plate for one minute.Insert the 384-well plate into a multi-mode plate reader and record the 460 and 618 nanometers emissions from all wells with cells. Calculate the raw BRET ratios for vehicle-positive and ligand-positive in milliBRET units using the given equation. Calculate the corrected BRET ratio by subtracting the vehicle-positive BRET ratio from that of the ligand-positive.The nano-CRAFS259A mutant reduces the BRET signal by approximately 45%and the nano-CRAFS621A mutant by around 25%The double mutant nearly eliminates the BRET signal.