تم دعم العمل من قبل صندوق البحث العلمي للمواهب رفيعة المستوى ، جامعة جنوب الصين.

1. إعداد البلازميدات
<ol><li>اعزل البلازميدات من 4 مل من المزارع البكتيرية الليلية باستخدام مجموعة البلازميد المصغرة. Elute مع 40 ميكرولتر من المخزن المؤقت للشفط. ملاحظة: ليس من الضروري عزل البلازميدات باستخدام مجموعة تحضير البلازميد ميدي. يمكن لمجموعة miniprep البلازميد أن تلبي تماما المتطلبات التجريبية للحقن المجهري للجنين. في هذا البروتوكول ، تحتوي بلازميدات UAS-cDNA / ORF المحضرة على عشر نسخ من UAS ، ومحفز Hsp70 الأدنى ، وموقع attB ، وجين أبيض صغير ، وجين مهم.</li>
	<li>تحديد تركيز الحمض النووي للبلازميد باستخدام مقياس الطيف الضوئي وتخزينه في الفريزر -80 درجة مئوية. ملاحظة: تركيز البلازميد ليس حاسما لنجاح الحقن المجهري للجنين، حيث أن تركيزات البلازميد التي تتراوح من 20 نانوغرام/ميكرولتر إلى 1683 نانوغرام/ميكرولتر تعمل بشكل جيد للجينات المحورة في ذبابة الفاكهة (الجدول التكميلي 1).</li>
	<li>قبل الحقن المجهري مباشرة ، قم بإذابة البلازميدات وأجهزة الطرد المركزي عند 13000 × جم لمدة 5 دقائق.</li>
	<li>نقل 10 ميكرولتر من كل بلازميد من الطبقة العليا من السائل إلى أنبوب جديد سعة 1.5 مل.</li>
</ol>2. سحب الإبر
<ol><li>قم بتشغيل مجتذب الإبرة بالإعدادات المحددة (الحرارة: 500 ، السحب: 50 ، Vel: 60 ، التأخير: 90 ، الضغط: 200 ، اختبار المنحدر: 510).</li>
	<li>أدخل شعرية زجاجية من البورسليكات (القطر الخارجي 1.0 مم ، القطر الداخلي 0.75 مم ، الطول 10 سم) في مجتذب الإبرة وأغلق الغطاء.</li>
	<li>اضغط على زر السحب . كل شعرية زجاجية تصنع إبرتين.</li>
</ol>3. إبر الطحن (الشكل 1)
<ol><li>استخدم مطحنة إبرة مثبتة بلوحة كاشطة مناسبة (لأحجام طرف 0.7-2.0 ميكرومتر) لمطحنة الإبرة.</li>
	<li>بلل قطعة القماش (سلك مرجعي) بمحلول طحن (100 مل من الماء المقطر مع 0.9 جم من كلوريد الصوديوم ، 1 مل من عامل الترطيب) وثبت قطعة القماش.</li>
	<li>قم بتشغيل مطحنة الإبرة وحافظ على دوران لوحة الطحن.</li>
	<li>قم بتوصيل إبرة بمضخة هواء القدم بمقياس ضغط عبر أنبوب شعري من السيليكون ، ثم قم بتركيب الإبرة على حامل إبرة لمطحنة الإبرة. اضبط زاوية الإبرة بالنسبة للوحة الطحن إلى 35 درجة (الشكل 1 أ ، ب).</li>
	<li>اضبط موضع طرف الإبرة فوق سطح لوحة الطحن مباشرة باستخدام مقبض تحكم خشن تحت المجهر (الشكل 1C). ملاحظة: تحتوي الإبر المسحوبة التي تم الحصول عليها في القسم 2 على تفتق 6-8 مم وطرف أقل من 1 ميكرومتر (الشكل 1 د) ، كما هو موضح في دليل المستخدم الخاص بالساحب.</li>
	<li>حافظ على الضغط الداخلي للإبرة عند 40 رطل / بوصة مربعة باستخدام مضخة هواء القدم. اضبط موضع طرف الإبرة باستخدام مقبض تحكم دقيق تحت المجهر ، واجعل طرف الإبرة يلمس لوحة الطحن.</li>
	<li>طحن لمدة 3-5 ثوان. عندما تخرج فقاعات هواء صغيرة من طرف الإبرة ، قم بتفريغ الإبرة (الشكل 1E). ملاحظة: في عملية الطحن ، يمنع استخدام مضخة الهواء محلول الطحن من السحب.</li>
	<li>ضع الإبر الأرضية في علبة تخزين. ملاحظة: استخدم الإبر المطحونة حديثا قدر الإمكان ، على الرغم من أنه يمكن الاحتفاظ بالإبر المطحونة في علبة تخزين لبضعة أسابيع على الأقل قبل الحقن المجهري.</li>
</ol>4. تحضير الماصات لتحميل البلازميدات
<ol><li>قم بتسخين ماصة سعة 200 ميكرولتر مع اللهب الخارجي لموقد الكحول.</li>
	<li>بمجرد أن يبدأ في الذوبان ، قم بتمديد الماصة.</li>
	<li>اقطع الطرف المختوم للماصة الممتدة بالمقص ، ثم تكون الماصة الممتدة جاهزة لتحميل الحمض النووي في إبرة أرضية. ملاحظة: بدلا من ذلك ، تتوفر نصائح طويلة ودقيقة للغاية لملء الإبر المطحونة تجاريا.</li>
	<li>ضع هذه الماصات في صندوق بلاستيكي معقم.</li>
</ol>5. جمع الأجنة
<ol><li>اجمع الذباب (vas-phiC31 ؛ + ؛ attP2) الذي يعبر عن phiC31 integrase ويحمل موقع الالتحام attP2 بعد 3 أيام من فقسه من 50 قارورة ونقله إلى قفص (φ 90 مم × 150 مم). أضف القليل من معجون الخميرة الطازج إلى وسط كل طبق أجار عنب18.</li>
	<li>إعداد 2-4 أقفاص من الذباب. احتفظ بالأقفاص والأطباق عند 25 درجة مئوية وقم بتغيير الأطباق كل يوم لمدة 2-4 أيام. ملاحظة: جمعت هذه الدراسة بين جين الأسهر phiC31 (Stock # 36313 ، مركز بلومنجتون ذبابة الفاكهة ) على الكروموسوم الأول وجين التحوير attP2 (Stock # 36313 ، مركز بلومنجتون ذبابة الفاكهة ) على الكروموسوم الثالث. يتم استخدام المخزون الناتج (vas-phiC31 ؛ + ؛ attP2) في هذا البروتوكول. يجب تحضير معجون الخميرة يوميا ، ويجب إطعام معجون الخميرة الطازج للذباب. يجب تنظيف الأقفاص المستبدلة وتجفيفها للتخلص من الأجنة المتبقية في الأقفاص.</li>
	<li>في يوم الحقن المجهري ، قم بتغيير الأقفاص والأطباق في الصباح. ثم قم بتغيير اللوحات كل 30 دقيقة واجمع الأجنة من هذه اللوحات. قم بتغيير جميع الأقفاص والأطباق في درجة حرارة الغرفة (RT) وبعد ذلك احتفظ بالأقفاص والأطباق عند 25 درجة مئوية. ملاحظة: تفضل بعض البروتوكولات احتضان الأقفاص والأطباق عند 18 درجة مئوية لوضع البيض. يعتمد ذلك على عدد الأجنة التي يحتاجها المرء للحقن المجهري.</li>
</ol>6. إزالة الأجنة
<ol><li>تحضير 30٪ مبيض عن طريق خلط 60 مل من المبيض (يحتوي على محتوى الكلور النشط من 34-46 جم / لتر) و 140 مل من الماء المقطر المزدوج.</li>
	<li>قم بإزالة الذباب المتبقي على ألواح أجار عصير العنب بفرشاة أو ملقط ، وشطف الأجنة في مصفاة خلية بالماء المقطر المزدوج.</li>
	<li>جفف مصفاة الخلية التي تحتوي على الأجنة بالمناديل الورقية.</li>
	<li>ضعه في طبق بتري يحتوي على 30٪ مبيض ، وقم بتدوير مصفاة الخلية باليد أو رج أفقي لمدة 1.5 دقيقة عند 60 دورة في الدقيقة. ملاحظة: الشطف هو خطوة حاسمة. إذا لم يكن وقت الشطف طويلا بما فيه الكفاية ، فلن تنفجر قشرة الجنين تماما. إذا كان وقت الشطف طويلا جدا ، فسوف يتسبب ذلك في أن يصبح الجنين طريا وينكسر بسهولة. يجب غمر مصفاة الخلية بالكامل في المبيض بنسبة 30٪. ارتد زوجا من القفازات المطاطية ومعطف المختبر لتجنب الإصابات الناجمة عن التبييض.</li>
	<li>شطف الأجنة لمدة 2 دقيقة بالماء المقطر المزدوج المخزن في زجاجة غسيل بلاستيكية في المختبر لإزالة المبيض المتبقي. اختر الأجنة العائمة للتشكيلة.</li>
</ol>7. اصطفاف الأجنة
<ol><li>قطع أجار عصير العنب الصلب إلى شرائح طويلة باستخدام شفرة. ملاحظة: استخدم عصير العنب الأرجواني لتسهيل اصطفاف الأجنة البيضاء.</li>
	<li>نقل الأجنة على شريط طويل باستخدام فرشاة الرسم.</li>
	<li>اصطف حوالي 60 جنينا بإبرة تشريح على طول حافة شريط طويل مع مواجهة مؤخرتها للخارج من الشريط. اصطف حوالي 60 جنينا في غضون 5 دقائق. ملاحظة: الميكروبايل هو نتوء مخروطي الشكل في القطب الأمامي للجنين ، يدخل من خلاله المنوي لتخصيب البويضة (الشكل 2 أ). لذلك ، بناء على نتوء مخروطي الشكل في القطب الأمامي للجنين ، من السهل تحديد الجزء الخلفي من الجنين المنزوع الأيوان.</li>
	<li>ضع شريطا على الوجهين مقاس 18 مم بالطول على طول حافة غطاء الغطاء (18 مم × 18 مم) وقم بإزالة دعامة الورق. اضغطي برفق على غطاء الأجنة المحاذاة. تأكد من لصق الأجنة على مركز الشريط.</li>
</ol>8. تجفيف الأجنة
<ol><li>ضع غطاء الغطاء مع الأجنة المصطفة في صندوق يحتوي على مجفف. يختلف وقت التجفيف حسب درجة الحرارة والرطوبة. ملاحظة: وقت التجفيف أمر بالغ الأهمية للحقن المجهري ويحتاج إلى تحديد تجريبي. عادة ما يكون وقت التجفيف 9-10 دقائق في الصيف و 17-18 دقيقة في الشتاء.</li>
	<li>تغطية الأجنة بزيت الهالوكربون. ملاحظة: لا تسقط الكثير من الزيت على الأجنة ، لأن الزيت الزائد قد يفيض على المادة اللاصقة. نسبة حجم زيت الهالو كربون 700 وزيت الهالو كربون 27 هي 1: 3.</li>
</ol>9. حقن الأجنة المجهري
<ol><li>قم بتحميل 2 ميكرولتر من الحمض النووي في الإبرة باستخدام الماصة الممدودة. تأكد من عدم وجود فقاعات في الإبرة. ضع الإبرة في حامل الإبرة الخاص ب micromanipulator.</li>
	<li>ضع الأجنة المحاذية المغطاة بزيت الهالو كربون تحت مجهر مقلوب. تأكد من أن الأطراف الخلفية للأجنة تواجه الإبرة.</li>
	<li>استخدم المناور الدقيق لتقريب الإبرة من الأجنة. امسح الإبرة. تأكد من أن قطرة السائل الخارجة من الإبرة مرئية. بدءا من ضغط حقن 300 hPa وضغط توازن 20 hPa ، اضبط ضغط الحقن وضغط التوازن لضمان الحجم الأمثل لقطرة السائل.</li>
	<li>استخدم المناور الدقيق لإدخال الإبرة في الأطراف الخلفية للأجنة ، واستخدم التحكم في القدم المتصل بالحاقن الدقيق لحقن الحمض النووي (الشكل 2). إذا كانت هالة صغيرة مرئية ، يتم حقن الحمض النووي بنجاح في الجنين. ملاحظة: حدد الأجنة متعددة النوى للحقن واقتل الأجنة الأكبر سنا باستخدام الزر "نظيف". إذا تسربت كمية كبيرة من السيتوبلازم بعد الحقن ، فإن الأجنة تكون غير جافة. إذا تسربت كمية صغيرة فقط من السيتوبلازم أو لم تتسرب أي كمية منه بعد الحقن ، فإن الحقن تعتبر ناجحة. إذا تسرب أكثر من ثلث الأجنة من السيتوبلازم بعد الحقن ، فقم بتمديد وقت التجفيف بمقدار 1-2 دقيقة. إذا كان أكثر من ثلث الأجنة جافا بشكل مفرط ، فقم بتقصير وقت التجفيف بمقدار 1-2 دقيقة.</li>
	<li>قم بإزالة الإبرة من الجنين. حرك الإبرة إلى الطرف الخلفي للجنين التالي. كرر الخطوات المذكورة أعلاه.</li>
	<li>ضع الأجنة المحقونة في صفيحة أجار. ضع الطبق في غرفة على حرارة 18-20 درجة مئوية. في اليوم التالي ، نقل لوحة إلى حاضنة عند درجة حرارة 25 °Cوالرطوبة من 50 ٪ -60 ٪ ، واحتضان لمدة 1 يوم. ملاحظة: بعد الحقن ، احتفظ بالأجنة عند درجة حرارة 18-20 درجة مئوية لإبطاء نموها ، وتسهيل دمج الحمض النووي البلازميد في جينوم ذبابة الفاكهة ، وزيادة معدل بقاء الأجنة المحقونة.</li>
</ol>10. جمع اليرقات
<ol><li>استخدم إبرة تشريح لكشط وفك الطعام في قنينة. زود الطعام ببضع قطرات من الماء المقطر. ملاحظة: اترك الماء المقطر يمتص في الطعام لمنع اليرقات من الغرق.</li>
	<li>اخراج لوحات من الحاضنة.</li>
	<li>جمع اليرقات المفرغة مع فرشاة الرسم تحت المجهر ستيريو ونقلها إلى القارورة.</li>
	<li>ضع القارورة في حاضنة عند درجة حرارة 25 درجة مئويةورطوبة50٪ -60٪.</li>
</ol>11. الحصول على الذباب المعدل وراثيا
<ol><li>اجمع الذباب المفقس بعد تحضين القارورة عند 25 درجة مئويةلمدة 10 أيام.</li>
	<li>اعبر ذبابة ذكر واحدة إلى ثلاث ذباب أنثى عذراء من موازنات TM2 / TM6C Sb1 Tb1 ، واعبر ذبابة أنثى واحدة إلى ثلاثة ذباب ذكور من موازنات TM2 / TM6C Sb1 Tb1 .</li>
	<li>ضع الصلبان في حاضنة عند درجة حرارة 25 درجة مئوية ورطوبة 50٪ -60٪.</li>
	<li>فحص ذرية الذباب بعيون برتقالية. هذه هي الذباب المعدل وراثيا (الشكل 3A-C). ملاحظة: الذباب الذي يحمل نسخة من جين التحوير في موقع الالتحام attP2 له عيون برتقالية.</li>
	<li>اعبر ذبابة ذكر برتقالية العينين إلى ثلاث ذباب أنثى عذراء من موازنات TM2 / TM6C Sb1 Tb1 لإنشاء مخزون. ملاحظة: يجب إعداد أكثر من جيل واحد من الصلبان من أجل شطب جين التحوير phiC31 على الكروموسوم الأول.</li>
</ol>

phiC31 الجينات المعدلة للجنين بوساطة Integrase في ذبابة الفاكهة

<ol>
	<li>Rubin, G. M., Spradling, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+transformation+of+Drosophila+with+transposable+element+vectors.">Genetic transformation of Drosophila with transposable element vectors.</a> Science. 218 (4570), 348-353 (1982).</li><li>Venken, K. J., Bellen, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenesis+upgrades+for+Drosophila+melanogaster.">Transgenesis upgrades for Drosophila melanogaster.</a> Development. 134 (20), 3571-3584 (2007).</li><li>Groth, A. C., Fish, M., Nusse, R., Calos, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+of+transgenic+Drosophila+by+using+the+site-specific+integrase+from+phage+phic31.">Construction of transgenic Drosophila by using the site-specific integrase from phage phic31.</a> Genetics. 166 (4), 1775-1782 (2004).</li><li>Bischof, J., Maeda, R. K., Hediger, M., Karch, F., Basler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimized+transgenesis+system+for+Drosophila+using+germ-line-specific+phic31+integrases.">An optimized transgenesis system for Drosophila using germ-line-specific phic31 integrases.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (9), 3312-3317 (2007).</li><li>Markstein, M., Pitsouli, C., Villalta, C., Celniker, S. E., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploiting+position+effects+and+the+gypsy+retrovirus+insulator+to+engineer+precisely+expressed+transgenes.">Exploiting position effects and the gypsy retrovirus insulator to engineer precisely expressed transgenes.</a> Nat Genet. 40 (4), 476-483 (2008).</li><li>Bateman, J. R., Lee, A. M., Wu, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specific+transformation+of+Drosophila+via+phic31+integrase-mediated+cassette+exchange.">Site-specific transformation of Drosophila via phic31 integrase-mediated cassette exchange.</a> Genetics. 173 (2), 769-777 (2006).</li><li>Venken, K. J., He, Y., Hoskins, R. A., Bellen, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=P[acman]:+A+BAC+transgenic+platform+for+targeted+insertion+of+large+DNA+fragments+in+D.+melanogaster.">P[acman]: A BAC transgenic platform for targeted insertion of large DNA fragments in D. melanogaster.</a> Science. 314 (5806), 1747-1751 (2006).</li><li>Szabad, J., Bellen, H. J., Venken, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+assay+to+detect+in+vivo+Y+chromosome+loss+in+Drosophila+wing+disc+cells.">An assay to detect in vivo Y chromosome loss in Drosophila wing disc cells.</a> G3. 2 (9), 1095-1102 (2012).</li><li>Ringrose, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenesis+in+Drosophila+melanogaster.">Transgenesis in Drosophila melanogaster.</a> Methods Mol Biol. 561, 3-19 (2009).</li><li>Van Der Graaf, K., Srivastav, S., Singh, P., Mcnew, J. A., Stern, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Drosophila+melanogaster+attp40+docking+site+and+derivatives+are+insertion+mutations+of+msp-300.">The Drosophila melanogaster attp40 docking site and derivatives are insertion mutations of msp-300.</a> PLoS One. 17 (12), e0278598 (2022).</li><li>Duan, Q., Estrella, R., Carson, A., Chen, Y., Volkan, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+Drosophila+attp40+background+on+the+glomerular+organization+of+or47b+olfactory+receptor+neurons.">The effect of Drosophila attp40 background on the glomerular organization of or47b olfactory receptor neurons.</a> G3. 13 (4), 022 (2023).</li><li>Dietzl, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genome-wide+transgenic+RNAi+library+for+conditional+gene+inactivation+in+Drosophila.">A genome-wide transgenic RNAi library for conditional gene inactivation in Drosophila.</a> Nature. 448 (7150), 151-156 (2007).</li><li>Pfeiffer, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tools+for+neuroanatomy+and+neurogenetics+in+Drosophila.">Tools for neuroanatomy and neurogenetics in Drosophila.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (28), 9715-9720 (2008).</li><li>Bellen, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Drosophila+gene+disruption+project:+Progress+using+transposons+with+distinctive+site+specificities.">The Drosophila gene disruption project: Progress using transposons with distinctive site specificities.</a> Genetics. 188 (3), 731-743 (2011).</li><li>Zirin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+transgenic+drosophila+resource+collections+for+loss-+and+gain-of-function+studies.">Large-scale transgenic drosophila resource collections for loss- and gain-of-function studies.</a> Genetics. 214 (4), 755-767 (2020).</li><li>Wei, P., Xue, W., Zhao, Y., Ning, G., Wang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-based+modular+assembly+of+a+UAS-cDNA/ORF+plasmid+library+for+more+than+5500+Drosophila+genes+conserved+in+humans.">CRISPR-based modular assembly of a UAS-cDNA/ORF plasmid library for more than 5500 Drosophila genes conserved in humans.</a> Genome Res. 30 (1), 95-106 (2020).</li><li>Fish, M. P., Groth, A. C., Calos, M. P., Nusse, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Creating+transgenic+Drosophila+by+microinjecting+the+site-specific+phic31+integrase+mRNA+and+a+transgene-containing+donor+plasmid.">Creating transgenic Drosophila by microinjecting the site-specific phic31 integrase mRNA and a transgene-containing donor plasmid.</a> Nat Protoc. 2 (10), 2325-2331 (2007).</li><li>Fujioka, M., Jaynes, J. B., Bejsovec, A., Weir, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+transgenic+Drosophila.">Production of transgenic Drosophila.</a> Methods Mol Biol. 136, 353-363 (2000).</li><li>Loncar, D., Singer, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+membrane+formation+during+the+cellularization+of+the+syncytial+blastoderm+of+Drosophila.">Cell membrane formation during the cellularization of the syncytial blastoderm of Drosophila.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (6), 2199-2203 (1995).</li><li>Carmo, C., Araujo, M., Oliveira, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microinjection+techniques+in+fly+embryos+to+study+the+function+and+dynamics+of+SMC+complexes.">Microinjection techniques in fly embryos to study the function and dynamics of SMC complexes.</a> Methods Mol Biol. 2004, 251-268 (2019).</li></ol>

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

هنا ، نقدم بروتوكولا للحقن المجهري للأجنة لالجينات المحورة في ذبابة الفاكهة. بالنسبة للجينات المحورة الخاصة بالموقع بوساطة phiC31 ، قمنا بحقن 120-140 جنينا لكل بلازميد وحصلنا على خط واحد على الأقل معدل وراثيا لحوالي 85٪ من البلازميدات (الجدول التكميلي 2). في تجربتنا ، يكفي الحمض الن...

ذبابة الفاكهة Drosophila melanogaster قابلة للغاية للتلاعب الجيني والتحليل الجيني. يستخدم ذباب الفاكهة المعدل وراثيا على نطاق واسع في البحوث البيولوجية. منذ أن تم تطويره في أوائل ثمانينيات القرن العشرين ، كان التحوير بوساطة P-element transposon لا غنى عنه لأبحاث ذبابة الفاكهة 1. في بعض السيناريوهات ، تم استخدام ترانسبوزونات أخرى ، مثل piggyBac و Minos في الجينات المحورة في ذبابة الفاكهة أيضا2. يتم إدخال جينات التحوير عبر transposon بشكل عشوائي في جينوم ذبابة الفاكهة ، وقد تختلف مستويات التعبير عن الجينات المحورة في مواقع جينومية مختلفة بسبب تأثيرات الموضع وبالتالي لا يمكن مقارنتها2. تم التغلب على هذه العيوب من خلال الجينات المحورة 3 الخاصة بالموقع بوساطة phiC31. يشفر جين phiC31 البكتيري إنزيم التكامل الذي يتوسط إعادة التركيب الخاصة بالتسلسل بين موقعي attB و attP في ذبابة الفاكهة3. تم تمييز العديد من مواقع إرساء attP وهي متوفرة في مركز بلومنجتون ذبابة الفاكهة 3،4،5،6،7،8،9.
تم استخدام نظام التحوير phiC31 لذبابة الفاكهة على نطاق واسع من قبل مجتمع الذباب. من بين مواقع الالتحام attP ، عادة ما تكون attP18 على الكروموسوم X ، و attP40 على الكروموسوم الثاني ، و attP2 على الكروموسوم الثالث هي المواقع المفضلة لتكامل الجينات المحورة على كل كروموسوم لأن جينات التحوير في المواقع الثلاثة تظهر مستويات عالية من التعبير المستحث مع وجود مستويات منخفضة من التعبير القاعدي5. ومع ذلك ، وجد فان دير غراف وزملاؤه مؤخرا أن موقع attP40 ، القريب من موضع جين Msp300 ، والجينات المحورة المدمجة في attP40 تسبب تجمعا نوويا لعضلات اليرقات في ذبابة الفاكهة10. في دراسة حديثة أخرى ، وجد دوان وزملاؤه أن كروموسوم attP40 متماثل الزيجوت يعطل التنظيم الكبيبي الطبيعي لفئة الخلايا العصبية لمستقبلات حاسة الشم Or47b في ذبابة الفاكهة11. تشير هذه النتائج إلى أنه يجب تضمين ضوابط صارمة عند تصميم التجارب وتفسير البيانات.
ذبابة الفاكهة هي كائن نموذجي مثالي للاستجواب في الجسم الحي لوظيفة الجينات بسبب دورة حياتها القصيرة وتكلفتها المنخفضة وسهولة صيانتها. يعتمد الفحص الجيني على مستوى الجينوم على بناء مكتبات معدلة وراثيا على مستوى الجينوم في ذبابة الفاكهة12،13،14،15. لقد أنشأنا سابقا 5551 بنية UAS-cDNA / ORF بناء على نظام تسلسل تنشيط GAL4 / المنبع الثنائي (GAL4 / UAS) ، والذي يغطي 83٪ من جينات ذبابة الفاكهة المحفوظة في البشر في المجموعة الذهبية لمركز موارد جينوم ذبابة الفاكهة (DGRC)16. يمكن استخدام بلازميدات UAS-cDNA / ORF لإنشاء مكتبة UAS-cDNA / ORF المعدلة وراثيا في ذبابة الفاكهة. يمكن لتقنية الحقن المجهري للأجنة الفعالة تسريع إنشاء مكتبات الذباب المعدلة وراثيا.
بالنسبة للحقن المجهري للجنين ، عادة ما يتم كسر طرف الإبرة ضد غطاء17. وبالتالي ، غالبا ما تصبح الإبر مسدودة أو تسبب تسرب كميات كبيرة من السيتوبلازم ، وعندما تنشأ هذه المشكلات ، يجب استخدام إبر جديدة. على الرغم من أن إبر الميلا يمكن أن تعزز كفاءة الحقن المجهري ، إلا أن محلول الطحن يدخل الطرف المشطوف أثناء عملية الطحن. لا يتبخر محلول الطحن في الطرف المشطوف بسرعة بشكل طبيعي ؛ لذلك ، لا يمكن استخدام الإبر للحقن المجهري مباشرة بعد الميلات. هذه العوامل تقلل من كفاءة إجراءات الحقن المجهري للأجنة. هنا ، باستخدام الجينات المحورة الخاصة بالموقع بوساطة phiC31 في ذبابة الفاكهة كمثال ، نقدم بروتوكولا للحقن المجهري للأجنة لجين التحوير في ذبابة الفاكهة. لمنع محلول الطحن من دخول الإبرة ، نستخدم مضخة هواء لممارسة ضغط الهواء داخل الإبرة ، وبالتالي منع محلول الطحن من دخول الطرف المشطوف. الإبر المشطوفة جاهزة لتحميل العينات والحقن المجهري مباشرة بعد الميلات.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>100 &#956;m Cell Strainer</td>
			<td>NEST</td>
			<td>258367</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3M double-sided adhesive</td>
			<td>3M</td>
			<td>415</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate glass</td>
			<td>SUTTER</td>
			<td>B100-75-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diamond abrasive plate</td>
			<td>SUTTER</td>
			<td>104E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FLAMING/BROWN Micropipette Puller</td>
			<td>SUTTER</td>
			<td>P-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foot air pump with pressure gauge</td>
			<td>Shenfeng</td>
			<td>SF8705D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halocarbon oil 27</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H8773</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halocarbon oil 700</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H8898</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>ECLIPSE Ts2R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microinjection pump</td>
			<td>eppendorf</td>
			<td>FemtoJet 4i</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>eppendorf</td>
			<td>TransferMan 4r</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette Beveler</td>
			<td>SUTTER</td>
			<td>BV-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope cover glasses (18 mm x 18 mm)</td>
			<td>CITOLAS</td>
			<td>10211818C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides (25 mm x 75 mm)</td>
			<td>CITOLAS</td>
			<td>188105W</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish (90 mm x 15 mm)</td>
			<td>LAIBOER</td>
			<td>4190152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photo-Flo 200</td>
			<td>Kodak</td>
			<td>1026269</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAprep Spin Miniprep Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>27106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ745</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

embryo microinjection for transgenesis in drosophila

يعد التحوير الوراثي في ذبابة الفاكهة نهجا أساسيا لدراسة وظيفة الجينات على مستوى الكائن الحي. الحقن المجهري للأجنة هو خطوة حاسمة لبناء الذباب المعدل وراثيا. يتطلب الحقن المجهري بعض أنواع المعدات ، بما في ذلك حاقن دقيق ، ومناور دقيق ، ومجهر مقلوب ، ومجهر ستيريو. البلازميدات المعزولة بمجموعة البلازميد المصغرة مؤهلة للحقن المجهري. تخضع الأجنة في مرحلة ما قبل الأرومة أو مرحلة البلاستوديرم المخلوي ، حيث تشترك النوى في سيتوبلازم مشترك ، للحقن المجهري. مصفاة الخلية تخفف من عملية إزالة الأجنة. يجب تحديد الوقت الأمثل لنزع الأجنة وتجفيفها تجريبيا. لزيادة كفاءة الحقن المجهري للأجنة ، يجب أن تكون الإبر التي أعدها مجتذب مشطوفة بواسطة مطحنة إبرة. في عملية طحن الإبر ، نستخدم مضخة هواء القدم مع مقياس ضغط لتجنب التأثير الشعري لطرف الإبرة. نقوم بشكل روتيني بحقن 120-140 جنينا لكل بلازميد ونحصل على خط واحد على الأقل معدل وراثيا لحوالي 85٪ من البلازميدات. تأخذ هذه المقالة الجينات المحورة بوساطة phiC31 integrase في ذبابة الفاكهة كمثال وتقدم بروتوكولا مفصلا للحقن المجهري للجنين للجينات المحورة في ذبابة الفاكهة.

The fruit fly Drosophila melanogaster is extremely amenable to genetic manipulation and genetic analysis. Transgenic fruit flies are widely used in biological research. Since it was developed in the early 1980s, P-element transposon-mediated transgenesis has been indispensable for Drosophila research1. In some scenarios, other transposons, such as piggyBac and Minos have been used for transgenesis in Drosophila as well2. Transgenes via transposon are randomly inserted into the Drosophila genome, and the expression levels of transgenes at different genomic loci may vary due to position effects and thereby can not be compared2. These drawbacks were overcome by the phiC31-mediated site-specific transgenesis3. The bacteriophage&#160;phiC31 gene encodes an integrase that mediates sequence-specific recombination between the attB and attP sites in Drosophila3. Many attP docking sites have been characterized and are available in the Bloomington Drosophila Stock Center3,4,5,6,7,8,9.
The phiC31 transgenesis system for Drosophila has been widely used by the fly community. Among the attP docking sites, attP18 on the X chromosome, attP40 on the second chromosome, and attP2 on the third chromosome are usually the preferred sites for transgene integration on each chromosome because transgenes at the three sites show high levels of inducible expression while having low levels of basal expression5. Recently, however, van der Graaf and colleagues found that the attP40 site, close to the Msp300 gene locus, and transgenes integrated at attP40 cause larval muscle nuclear clustering in Drosophila10. In another recent study, Duan and colleagues found that the homozygous attP40 chromosome disrupts the normal glomerular organization of the Or47b olfactory receptor neuron class in Drosophila11. These findings suggest that rigorous controls should be included when designing experiments and interpreting data.
Drosophila is an ideal model organism for in vivo interrogation of gene function due to its short life cycle, low cost, and easy maintenance. Genome-wide genetic screening relies on the construction of genome-wide transgenic libraries in Drosophila12,13,14,15. We previously generated 5551 UAS-cDNA/ORF constructs based on the binary GAL4/upstream activating sequence (GAL4/UAS) system, covering 83% of the Drosophila genes conserved in humans in the Drosophila Genomics Resource Center (DGRC) Gold Collection16. The UAS-cDNA/ORF plasmids can be used for the creation of a transgenic UAS-cDNA/ORF library in Drosophila. Efficient embryo microinjection technology can accelerate the creation of transgenic fly libraries.
For embryo microinjection, the needle tip is normally broken against a coverslip17. Thereby, needles frequently become clogged or cause leakage of large amounts of cytoplasm, and when these issues arise, new needles must be employed. Although beveling needles can enhance microinjection efficiency, the grinding solution enters the beveled tip during the grinding process. The grinding solution in the beveled tip does not quickly evaporate naturally; therefore, needles can not be utilized for microinjection directly after beveling. These factors reduce the efficiency of embryo microinjection procedures. Here, using the phiC31-mediated site-specific transgenesis in Drosophila as an example, we present a protocol for embryo microinjection for transgenesis in Drosophila.&#160;To prevent the grinding solution from entering the needle, we utilize an air pump to exert air pressure within the needle, thereby preventing the grinding solution from entering the beveled tip. Beveled needles are ready for sample loading and microinjection directly after beveling.

تسليط الضوء على المؤلف: تحسين الحقن المجهري للأجنة ل Transgenesis في ذبابة الفاكهة

الحقن المجهري للجنين للجينات المحورة في ذبابة الفاكهة

Transgenesis in Drosophila is essential for studying gene function at the organism level. Embryo microinjection is a crucial step for construction of transgenic flies. Here, we take the phiC31 integrase-mediated transgenesis in Drosophila as an example and present a detailed protocol for embryo microinjection for transgenesis in Drosophila.Injection needles whose tips are beveled by a grinder do not usually get blocked or elicit large cytoplasmic leakage. However, the grinding solution can enter the beveled tip of a needle during the grinding process and the grinding solution inside the tip does not naturally dry up quickly. Our protocol uses a foot air pump with a pressure gauge to apply air pressure to a needle while grinding its tip.This prevents the grinding solution from siphoning, thereby the grinding solution is prevented from entering the beveled tip, enabling the beveled needle to be used immediately.

طرف إبرة الحقن مشطوف بمطحنة إبرة (الشكل 1). يمكن للمرء شطبة 50-60 إبرة في ساعة واحدة. يتم حقن الحمض النووي (DNA) في الجزء الخلفي من الجنين في مرحلة ما قبل الأرومة أو مرحلة البلاستوديرم المخلوي ، حيث تشترك النوى في سيتوبلازم مشترك (الشكل 2 أ). يمكن تحديد موقع الجزء ال...

تأخذ هذه المقالة الجينات المحورة بوساطة phiC31 integrase في ذبابة الفاكهة كمثال وتقدم بروتوكولا محسنا للحقن المجهري للأجنة ، وهي خطوة حاسمة لإنشاء الذباب المعدل وراثيا.

Transgenesis in Drosophila is an essential approach to studying gene function at the organism level. Embryo microinjection is a crucial step for the ...

يعد التحوير الوراثي في ذبابة الفاكهة ضروريا لدراسة وظيفة الجينات على مستوى الكائن الحي. الحقن المجهري للأجنة هو خطوة حاسمة لبناء الذباب المعدل وراثيا. هنا ، نأخذ الجينات المحورة بوساطة phiC31 integrase في ذبابة الفاكهة كمثال ونقدم بروتوكولا مفصلا للحقن المجهري للأجنة للجينات المحورة في ذبابة الفاكهة.لا يتم عادة حظر إبر الحقن التي تكون أطرافها مشطوفة بواسطة مطحنة أو تثير تسربا سيتوبلازميا كبيرا. ومع ذلك ، يمكن أن يدخل محلول الطحن إلى الطرف المشطوف للإبرة أثناء عملية الطحن ولا يجف محلول الطحن داخل الطرف بسرعة بشكل طبيعي. يستخدم بروتوكولنا مضخة هواء القدم مع مقياس ضغط لتطبيق ضغط الهواء على إبرة أثناء طحن طرفها.هذا يمنع محلول الطحن من السحب ، وبالتالي يتم منع محلول الطحن من دخول الطرف المشطوف ، مما يتيح استخدام الإبرة المشطوفة على الفور.

embryo-microinjection-for-transgenesis-in-drosophila

Research

JoVE Journal

Genetics

Embryo Microinjection for Transgenesis in Drosophila

1.0K Views.  University of South China. يعد التحوير الوراثي في ذبابة الفاكهة ضروريا لدراسة وظيفة الجينات على مستوى الكائن الحي. الحقن المجهري للأجنة هو خطوة حاسمة لبناء الذباب المعدل وراثيا. هنا ، نأخذ الجينات المحورة بوساطة phiC31 integrase في ذبابة الفاكهة كمثال ونقدم بروتوكولا مفصلا للحقن المجهري للأجنة للجينات ال?...

Video: تسليط الضوء على المؤلف: تحسين الحقن المجهري للأجنة ل Transgenesis في ذبابة الفاكهة

Transgenesis in Drosophila is an essential approach to studying gene function at the organism level. Embryo microinjection is a crucial step for the construction of transgenic flies. Microinjection requires some types of equipment, including a microinjector, a micromanipulator, an inverted microscope, and a stereo microscope.&#160;Plasmids isolated with a plasmid miniprep kit are qualified for microinjection. Embryos at the pre-blastoderm or syncytial blastoderm stage, where nuclei share a common cytoplasm, are subjected to microinjection. A cell strainer eases the process of dechorionating embryos. The optimal time for dechorionation and desiccation of embryos needs to be determined experimentally. To increase the efficiency of embryo microinjection, needles prepared by a puller need to be beveled by a needle grinder. In the process of grinding needles, we utilize a foot air pump with a pressure gauge to avoid the capillary effect of the needle tip. We routinely inject 120-140 embryos for each plasmid and obtain at least one transgenic line for around 85% of plasmids. This article takes the phiC31 integrase-mediated transgenesis in Drosophila as an example and&#160;presents a detailed protocol for embryo microinjection for transgenesis in Drosophila.

This article takes the phiC31 integrase-mediated transgenesis in Drosophila as an example and presents an optimized protocol for embryo microinjection,&#160;a crucial step for creating transgenic flies.