Çalışma, Güney Çin Üniversitesi Üst Düzey Yetenekler için Bilimsel Araştırma Fonu tarafından desteklendi.

1. Plazmitlerin hazırlanması
<ol><li>Bir plazmid miniprep kiti kullanarak gece boyunca 4 mL bakteri kültürlerinden plazmitleri izole edin. 40 μL elüsyon tamponu ile elute. NOT: Bir plazmit midi hazırlama kiti kullanılarak plazmitlerin izolasyonu gerekli değildir. Bir plazmid miniprep kiti, embriyo mikroenjeksiyonu için deneysel gereksinimleri tam olarak karşılayabilir. Bu protokolde, hazırlanan UAS-cDNA/ORF plazmitleri, UAS'ın on kopyası, bir Hsp70 minimal promotörü, bir attB bölgesi, bir mini-beyaz gen ve ilgilenilen bir gen içerir.</li>
	<li>Bir spektrofotometre kullanarak plazmit DNA konsantrasyonunu belirleyin ve -80 °C dondurucuda saklayın. NOT: 20 ng/μL ila 1683 ng/μL arasında değişen plazmit konsantrasyonları Drosophila'da transgenez için iyi çalıştığından, plazmit konsantrasyonu başarılı embriyo mikroenjeksiyonu için kritik değildir (Ek Tablo 1).</li>
	<li>Mikroenjeksiyondan hemen önce, plazmitleri çözdürün ve 5 dakika boyunca 13000 x g'da santrifüjleyin.</li>
	<li>Her bir plazmitin 10 μL'sini sıvının üst katmanından 1.5 mL'lik yeni bir tüpe aktarın.</li>
</ol>2. İğne çekme
<ol><li>Seçili ayarlarla bir iğne çektirmesini açın (Isı: 500, Çekme: 50, Vel: 60, Gecikme: 90, Basınç: 200, Rampa Testi: 510).</li>
	<li>İğne çekiciye bir borosilikat cam kılcal damar (dış çap 1.0 mm, iç çap 0.75 mm, 10 cm uzunluk) yerleştirin ve kapağı kapatın.</li>
	<li>Çekme düğmesine basın. Her cam kılcal damar iki iğne yapar.</li>
</ol>3. Taşlama iğneleri (Şekil 1)
<ol><li>Bir iğneli taşlama makinesinin uygun bir aşındırıcı plakası (0,7-2,0 μm uç boyutları için) ile monte edilmiş bir iğneli öğütücü kullanın.</li>
	<li>Bezi (referans teli) öğütme solüsyonu (0,9 g NaCl ile 100 mL damıtılmış su, 1 mL ıslatıcı madde) ile ıslatın ve bezi sabitleyin.</li>
	<li>İğneli öğütücüyü açın ve taşlama plakasını döndürmeye devam edin.</li>
	<li>Silikon kılcal boru aracılığıyla bir basınç göstergesi ile bir ayak hava pompasına bir iğne bağlayın ve ardından iğneyi iğneli öğütücünün bir iğne tutucusuna monte edin. İğnenin taşlama plakasına göre açısını 35°'ye ayarlayın (Şekil 1A, B).</li>
	<li>Mikroskop altında kaba bir kontrol düğmesi kullanarak iğne ucunun taşlama plakası yüzeyinin hemen üzerindeki konumunu ayarlayın (Şekil 1C). NOT: Bölüm 2'de elde edilen çekilen iğneler, çektirmenin kullanım kılavuzunda açıklandığı gibi 6-8 mm konikliğe ve 1 μm'den daha az uca sahiptir (Şekil 1D).</li>
	<li>Ayak hava pompasını kullanarak iğnenin iç basıncını 40 psi'de tutun. Mikroskop altında ince bir kontrol düğmesi kullanarak iğne ucunun konumunu ayarlayın ve iğnenin ucunun taşlama plakasına temas etmesini sağlayın.</li>
	<li>3-5 sn öğütün. İğne ucundan küçük hava kabarcıkları çıktığında iğneyi boşaltın (Şekil 1E). NOT: Taşlama işleminde, bir hava pompası kullanmak öğütme çözeltisinin sifonlanmasını önler.</li>
	<li>Öğütülmüş iğneleri bir saklama kutusuna koyun. NOT: Mümkün olduğunca taze öğütülmüş iğneler kullanın, ancak öğütülmüş iğneler mikroenjeksiyondan önce en az birkaç hafta saklama kutusunda saklanabilir.</li>
</ol>4. Plazmitleri yüklemek için pipetlerin hazırlanması
<ol><li>200 μL'lik bir pipeti bir alkol brülörünün dış alevi ile ısıtın.</li>
	<li>Erimeye başladığında pipeti gerin.</li>
	<li>Gerilmiş pipetin kapalı ucunu makasla kesin ve gerilmiş pipet daha sonra DNA'yı bir öğütülmüş iğneye yüklemeye hazırdır. NOT: Alternatif olarak, öğütülmüş iğneleri doldurmak için son derece uzun ve ince uçlar ticari olarak temin edilebilir.</li>
	<li>Bu pipetleri otoklavlanmış plastik bir kutuya yerleştirin.</li>
</ol>5. Embriyoların toplanması
<ol><li>Yumurtadan çıktıktan 3 gün sonra phiC31 integraz eksprese eden ve attP2 yerleştirme bölgesini taşıyan sinekleri (vas-phiC31; + ; attP2) 50 flakondan toplayın ve bir kafese (φ 90 mm x 150 mm) aktarın. Her bir üzüm agar tabağının ortasına biraz taze maya ezmesi ekleyin18.</li>
	<li>2-4 kafes sinek hazırlayın. Kafesleri ve plakaları 25 °C'de tutun ve plakaları 2-4 gün boyunca her gün değiştirin. NOT: Bu çalışma, birinci kromozomdaki vas-phiC31 transgenini (Stok # 36313, Bloomington Drosophila Stok Merkezi) ve üçüncü kromozomdaki attP2 transgenini (Stok # 36313, Bloomington Drosophila Stok Merkezi) birleştirdi. Elde edilen stok (vas-phiC31; + ; attP2) bu protokolde kullanılır. Maya salçası günlük olarak hazırlanmalı ve sineklere taze maya ezmesi verilmelidir. Kafeslerde kalan embriyolardan kurtulmak için değiştirilen kafeslerin temizlenmesi ve kurutulması gerekir.</li>
	<li>Mikroenjeksiyon günü, sabahları kafesleri ve plakaları değiştirin. Daha sonra her 30 dakikada bir plakları değiştirin ve bu plaklardan embriyoları toplayın. Tüm kafesleri ve plakaları oda sıcaklığında (RT) değiştirin ve ardından kafesleri ve plakaları 25 °C'de tutun. NOT: Bazı protokoller, yumurtlama için kafesleri ve plakaları 18 °C'de inkübe etmeyi tercih eder. Mikroenjeksiyon için ihtiyaç duyulan embriyo sayısına bağlıdır.</li>
</ol>6. Dekoryonlu embriyolar
<ol><li>60 mL çamaşır suyu (34-46 g/L aktif klor içeriği içeren) ve 140 mL çift damıtılmış suyu karıştırarak% 30 çamaşır suyu hazırlayın.</li>
	<li>Üzüm suyu agar plakalarında kalan sinekleri bir fırça veya forseps ile çıkarın ve embriyoları çift damıtılmış su ile bir hücre süzgecine durulayın.</li>
	<li>Embriyoların bulunduğu hücre süzgecini kağıt mendil ile kurulayın.</li>
	<li>%30 çamaşır suyu içeren bir Petri kabına koyun ve hücre süzgecini elle veya yatay bir çalkalayıcıyla 60 rpm'de 1,5 dakika döndürün. NOT: Durulama kritik bir adımdır. Durulama süresi yeterince uzun değilse, embriyonun kabuğu tamamen çıkmaz. Durulama süresinin çok uzun olması embriyonun yumuşamasına ve kolayca kırılmasına neden olur. Hücre süzgeci tamamen %30'luk ağartıcıya batırılmalıdır. Çamaşır suyunun neden olduğu yaralanmaları önlemek için bir çift lastik eldiven ve laboratuvar önlüğü giyin.</li>
	<li>Kalan ağartıcıyı çıkarmak için embriyoları laboratuvar plastik yıkama şişesinde saklanan çift damıtılmış su ile 2 dakika durulayın. Diziliş için yüzen embriyoları seçin.</li>
</ol>7. Embriyoların sıralanması
<ol><li>Katı üzüm suyu agarını bir bıçak kullanarak uzun şeritler halinde kesin. NOT: Beyaz embriyoları sıralamayı kolaylaştırmak için mor üzüm suyu kullanın.</li>
	<li>Embriyoları bir boya fırçası kullanarak uzun bir şerit üzerine aktarın.</li>
	<li>Yaklaşık 60 embriyoyu, arka kısımları şeridin dışına bakacak şekilde uzun bir şeridin kenarı boyunca bir diseksiyon iğnesi ile hizalayın. 5 dakika içinde yaklaşık 60 embriyoyu sıralayın. NOT: Mikropil, embriyonun ön kutbunda, spermin oositi döllemek için girdiği koni şeklinde bir çıkıntıdır. Bu nedenle, embriyonun ön kutbundaki koni şeklindeki çıkıntıya dayanarak, dekoryonlu embriyonun arka tarafını belirlemek kolaydır.</li>
	<li>Lamelin kenarı boyunca (18 mm x 18 mm) uzunlamasına 18 mm çift taraflı bir bant yerleştirin ve kağıt desteğini çıkarın. Lameli hizalanmış embriyoların üzerine hafifçe bastırın. Embriyoların bandın ortasına yapıştırıldığından emin olun.</li>
</ol>8. Kuruyan embriyolar
<ol><li>Lameli sıralanmış embriyolarla birlikte kurutucu içeren bir kutuya yerleştirin. Kuruma süresi sıcaklık ve neme bağlı olarak değişir. NOT: Kuruma süresi mikroenjeksiyon için kritiktir ve deneysel olarak belirlenmesi gerekir. Kuruma süresi genellikle yaz aylarında 9-10 dk, kış aylarında ise 17-18 dk'dır.</li>
	<li>Embriyoları halokarbon yağı ile örtün. NOT: Embriyoların üzerine çok fazla yağ damlatmayın, çünkü fazla yağ yapıştırıcıdan taşabilir. Halokarbon yağı 700 ve halokarbon yağı 27'nin hacim oranı 1:3'tür.</li>
</ol>9. Embriyoların mikroenjekte edilmesi
<ol><li>Gerilmiş pipeti kullanarak iğneye 2 μL DNA yükleyin. İğnede kabarcık olmadığından emin olun. İğneyi mikromanipülatörün iğne tutucusuna yerleştirin.</li>
	<li>Halokarbon yağı ile kaplanmış hizalanmış embriyoları ters çevrilmiş bir mikroskop altına yerleştirin. Embriyoların arka uçlarının iğneye baktığından emin olun.</li>
	<li>İğneyi embriyolara yaklaştırmak için mikromanipülatörü kullanın. İğneyi temizleyin. İğneden çıkan bir damla sıvının göründüğünden emin olun. 300 hPa enjeksiyon basıncından ve 20 hPa denge basıncından başlayarak, sıvı damlasının optimum boyutunu sağlamak için enjeksiyon basıncını ve denge basıncını ayarlayın.</li>
	<li>İğneyi embriyoların arka uçlarına sokmak için mikromanipülatörü kullanın ve DNA'yı enjekte etmek için mikroenjektöre bağlı ayak kumandasını kullanın (Şekil 2). Küçük bir hale görünüyorsa, DNA başarıyla embriyoya enjekte edilir. NOT: Enjeksiyon için çok çekirdekli embriyoları seçin ve "temizle" düğmesini kullanarak eski embriyoları öldürün. Enjeksiyondan sonra büyük miktarda sitoplazma sızarsa, embriyolar az kurutulur. Enjeksiyondan sonra sadece az miktarda sitoplazma sızarsa veya hiç sızmazsa, enjeksiyonların başarılı olduğu kabul edilir. Embriyoların üçte birinden fazlası enjeksiyondan sonra sitoplazma sızdırırsa, kuruma süresini 1-2 dakika uzatın. Embriyoların üçte birinden fazlası fazla kurutulmuşsa, kuruma süresini 1-2 dakika kısaltın.</li>
	<li>İğneyi embriyodan çıkarın. İğneyi bir sonraki embriyonun arka ucuna hareket ettirin. Yukarıdaki adımları tekrarlayın.</li>
	<li>Enjekte edilen embriyoları bir agar plakasına koyun. Plakayı 18-20 °C'de bir odaya yerleştirin. Ertesi gün, plakayı 25 °Csıcaklıkta ve% 50 -% 60 nemde bir inkübatöre aktarın ve 1 gün inkübe edin. NOT: Enjeksiyondan sonra, gelişimlerini yavaşlatmak, plazmit DNA'nın Drosophila genomuna entegrasyonunu kolaylaştırmak ve enjekte edilen embriyoların hayatta kalma oranını artırmak için embriyoları 18-20 ° C'lik bir sıcaklıkta tutun.</li>
</ol>10. Larvaların toplanması
<ol><li>Bir şişedeki yiyecekleri kazımak ve gevşetmek için bir diseksiyon iğnesi kullanın. Yiyecekleri birkaç damla damıtılmış su ile sağlayın. NOT: Larvaların boğulmasını önlemek için damıtılmış suyun yiyeceğe emilmesine izin verin.</li>
	<li>Plakaları inkübatörden çıkarın.</li>
	<li>Yumurtadan çıkan larvaları stereo mikroskop altında bir boya fırçası ile toplayın ve bunları şişeye aktarın.</li>
	<li>Şişeyi 25 °Csıcaklıkta ve% 50 -% 60 nemdebir inkübatöre yerleştirin.</li>
</ol>11. Transgenik sineklerin elde edilmesi
<ol><li>Flakon 10 gün boyunca 25 ° C'deinkübe edildikten sonra yumurtadan çıkan sinekleri toplayın.</li>
	<li>Tek bir erkek sineği TM2/TM6C Sb1 Tb1 dengeleyicilerinin üç bakire dişi sineğine çaprazlayın ve tek bir dişi sineği TM2/TM6C Sb1 Tb1 dengeleyicilerinin üç erkek sineğine çaprazlayın.</li>
	<li>Haçları 25 °C sıcaklıkta ve% 50 -% 60 nemde bir inkübatöre yerleştirin.</li>
	<li>Turuncu gözlü sinekler için dölleri tarayın. Bunlar transgenik sineklerdir (Şekil 3A-C). NOT: attP2 yerleştirme sahasında transgenin bir kopyasını taşıyan sineklerin turuncu gözleri vardır.</li>
	<li>Bir stok oluşturmak için tek bir turuncu gözlü erkek sineği TM2/TM6C Sb1 Tb1 dengeleyicilerin üç bakire dişi sineğine çaprazlayın. NOT: İlk kromozomdaki phiC31 transgenini çaprazlamak için birden fazla nesil çaprazlamanın kurulması gerekir.</li>
</ol>

Drosophila'da phiC31 İntegraz Aracılı Embriyo Transgenezi

<ol>
	<li>Rubin, G. M., Spradling, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+transformation+of+Drosophila+with+transposable+element+vectors.">Genetic transformation of Drosophila with transposable element vectors.</a> Science. 218 (4570), 348-353 (1982).</li><li>Venken, K. J., Bellen, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenesis+upgrades+for+Drosophila+melanogaster.">Transgenesis upgrades for Drosophila melanogaster.</a> Development. 134 (20), 3571-3584 (2007).</li><li>Groth, A. C., Fish, M., Nusse, R., Calos, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+of+transgenic+Drosophila+by+using+the+site-specific+integrase+from+phage+phic31.">Construction of transgenic Drosophila by using the site-specific integrase from phage phic31.</a> Genetics. 166 (4), 1775-1782 (2004).</li><li>Bischof, J., Maeda, R. K., Hediger, M., Karch, F., Basler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimized+transgenesis+system+for+Drosophila+using+germ-line-specific+phic31+integrases.">An optimized transgenesis system for Drosophila using germ-line-specific phic31 integrases.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (9), 3312-3317 (2007).</li><li>Markstein, M., Pitsouli, C., Villalta, C., Celniker, S. E., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploiting+position+effects+and+the+gypsy+retrovirus+insulator+to+engineer+precisely+expressed+transgenes.">Exploiting position effects and the gypsy retrovirus insulator to engineer precisely expressed transgenes.</a> Nat Genet. 40 (4), 476-483 (2008).</li><li>Bateman, J. R., Lee, A. M., Wu, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specific+transformation+of+Drosophila+via+phic31+integrase-mediated+cassette+exchange.">Site-specific transformation of Drosophila via phic31 integrase-mediated cassette exchange.</a> Genetics. 173 (2), 769-777 (2006).</li><li>Venken, K. J., He, Y., Hoskins, R. A., Bellen, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=P[acman]:+A+BAC+transgenic+platform+for+targeted+insertion+of+large+DNA+fragments+in+D.+melanogaster.">P[acman]: A BAC transgenic platform for targeted insertion of large DNA fragments in D. melanogaster.</a> Science. 314 (5806), 1747-1751 (2006).</li><li>Szabad, J., Bellen, H. J., Venken, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+assay+to+detect+in+vivo+Y+chromosome+loss+in+Drosophila+wing+disc+cells.">An assay to detect in vivo Y chromosome loss in Drosophila wing disc cells.</a> G3. 2 (9), 1095-1102 (2012).</li><li>Ringrose, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenesis+in+Drosophila+melanogaster.">Transgenesis in Drosophila melanogaster.</a> Methods Mol Biol. 561, 3-19 (2009).</li><li>Van Der Graaf, K., Srivastav, S., Singh, P., Mcnew, J. A., Stern, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Drosophila+melanogaster+attp40+docking+site+and+derivatives+are+insertion+mutations+of+msp-300.">The Drosophila melanogaster attp40 docking site and derivatives are insertion mutations of msp-300.</a> PLoS One. 17 (12), e0278598 (2022).</li><li>Duan, Q., Estrella, R., Carson, A., Chen, Y., Volkan, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+Drosophila+attp40+background+on+the+glomerular+organization+of+or47b+olfactory+receptor+neurons.">The effect of Drosophila attp40 background on the glomerular organization of or47b olfactory receptor neurons.</a> G3. 13 (4), 022 (2023).</li><li>Dietzl, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genome-wide+transgenic+RNAi+library+for+conditional+gene+inactivation+in+Drosophila.">A genome-wide transgenic RNAi library for conditional gene inactivation in Drosophila.</a> Nature. 448 (7150), 151-156 (2007).</li><li>Pfeiffer, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tools+for+neuroanatomy+and+neurogenetics+in+Drosophila.">Tools for neuroanatomy and neurogenetics in Drosophila.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (28), 9715-9720 (2008).</li><li>Bellen, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Drosophila+gene+disruption+project:+Progress+using+transposons+with+distinctive+site+specificities.">The Drosophila gene disruption project: Progress using transposons with distinctive site specificities.</a> Genetics. 188 (3), 731-743 (2011).</li><li>Zirin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+transgenic+drosophila+resource+collections+for+loss-+and+gain-of-function+studies.">Large-scale transgenic drosophila resource collections for loss- and gain-of-function studies.</a> Genetics. 214 (4), 755-767 (2020).</li><li>Wei, P., Xue, W., Zhao, Y., Ning, G., Wang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-based+modular+assembly+of+a+UAS-cDNA/ORF+plasmid+library+for+more+than+5500+Drosophila+genes+conserved+in+humans.">CRISPR-based modular assembly of a UAS-cDNA/ORF plasmid library for more than 5500 Drosophila genes conserved in humans.</a> Genome Res. 30 (1), 95-106 (2020).</li><li>Fish, M. P., Groth, A. C., Calos, M. P., Nusse, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Creating+transgenic+Drosophila+by+microinjecting+the+site-specific+phic31+integrase+mRNA+and+a+transgene-containing+donor+plasmid.">Creating transgenic Drosophila by microinjecting the site-specific phic31 integrase mRNA and a transgene-containing donor plasmid.</a> Nat Protoc. 2 (10), 2325-2331 (2007).</li><li>Fujioka, M., Jaynes, J. B., Bejsovec, A., Weir, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+transgenic+Drosophila.">Production of transgenic Drosophila.</a> Methods Mol Biol. 136, 353-363 (2000).</li><li>Loncar, D., Singer, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+membrane+formation+during+the+cellularization+of+the+syncytial+blastoderm+of+Drosophila.">Cell membrane formation during the cellularization of the syncytial blastoderm of Drosophila.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (6), 2199-2203 (1995).</li><li>Carmo, C., Araujo, M., Oliveira, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microinjection+techniques+in+fly+embryos+to+study+the+function+and+dynamics+of+SMC+complexes.">Microinjection techniques in fly embryos to study the function and dynamics of SMC complexes.</a> Methods Mol Biol. 2004, 251-268 (2019).</li></ol>

Yazarların ifşa edecek hiçbir şeyi yok.

Burada, Drosophila'da transgenez için embriyo mikroenjeksiyonu için bir protokol sunuyoruz. phiC31 aracılı bölgeye özgü transgenez için, her plazmit için 120-140 embriyo enjekte ettik ve plazmitlerin yaklaşık %85'i için en az bir transgenik hat elde ettik (Ek Tablo 2). Deneyimlerimize göre, bir plazmit miniprep kiti ile izole edilen plazmit DNA, Drosophila'da transgenez için yeterlidir. 20 ng/μL ila 1683 ng/μL arasında değişen plazmit DNA konsantrasyonları, transgene...

Meyve sineği Drosophila melanogaster, genetik manipülasyon ve genetik analiz için son derece uygundur. Transgenik meyve sinekleri biyolojik araştırmalarda yaygın olarak kullanılmaktadır. 1980'lerin başında geliştirildiğinden beri, P-element transpozon aracılı transgenez, Drosophila araştırması için vazgeçilmez olmuştur1. Bazı senaryolarda, Drosophila'da transgenez için piggyBac ve Minos gibi diğer transpozonlar dakullanılmıştır 2. Transpozon yoluyla transgenler rastgele Drosophila genomuna yerleştirilir ve farklı genomik lokuslardaki transgenlerin ekspresyon seviyeleri pozisyon etkilerine bağlı olarak değişebilir ve bu nedenle karşılaştırılamaz2. Bu dezavantajlar, phiC31 aracılı bölgeye özgü transgenez3 ile aşıldı. Bakteriyofaj phiC31 geni, Drosophila3'teki attB ve attP bölgeleri arasındaki diziye özgü rekombinasyona aracılık eden bir integrazı kodlar. Birçok attP yerleştirme sahası karakterize edilmiştir ve Bloomington Drosophila Stok Merkezi 3,4,5,6,7,8,9'da mevcuttur.
Drosophila için phiC31 transgenez sistemi, sinek topluluğu tarafından yaygın olarak kullanılmaktadır. AttP yerleştirme bölgeleri arasında, X kromozomundaki attP18, ikinci kromozomdaki attP40 ve üçüncü kromozomdaki attP2, genellikle her bir kromozomdaki transgen entegrasyonu için tercih edilen bölgelerdir, çünkü üç bölgedeki transgenler, düşük bazal ekspresyon seviyelerine sahipken yüksek seviyelerde indüklenebilir ekspresyon gösterir5. Bununla birlikte, son zamanlarda, van der Graaf ve meslektaşları, Msp300 gen lokusuna yakın olan attP40 bölgesinin ve attP40'a entegre edilmiş transgenlerin, Drosophila10'da larva kası nükleer kümelenmesine neden olduğunu buldular. Yakın tarihli bir başka çalışmada, Duan ve meslektaşları, homozigot attP40 kromozomunun, Drosophila11'deki Or47b koku alma reseptörü nöron sınıfının normal glomerüler organizasyonunu bozduğunu buldular. Bu bulgular, deneyler tasarlanırken ve veriler yorumlanırken titiz kontrollerin dahil edilmesi gerektiğini göstermektedir.
Drosophila, kısa yaşam döngüsü, düşük maliyeti ve kolay bakımı nedeniyle gen fonksiyonunun in vivo sorgulanması için ideal bir model organizmadır. Genom çapında genetik tarama, Drosophila 12,13,14,15'te genom çapında transgenik kütüphanelerin inşasına dayanır. Daha önce, Drosophila Genomik Kaynak Merkezi (DGRC) Altın Koleksiyonu16'da insanlarda korunan Drosophila genlerinin %83'ünü kapsayan ikili GAL4/yukarı akış aktivasyon dizisi (GAL4/UAS) sistemine dayalı 5551 UAS-cDNA/ORF yapısı oluşturduk. UAS-cDNA/ORF plazmitleri, Drosophila'da transgenik bir UAS-cDNA/ORF kütüphanesinin oluşturulması için kullanılabilir. Verimli embriyo mikroenjeksiyon teknolojisi, transgenik sinek kütüphanelerinin oluşturulmasını hızlandırabilir.
Embriyo mikroenjeksiyonu için, iğne ucu normalde bir lamel17'ye karşı kırılır. Bu nedenle, iğneler sıklıkla tıkanır veya büyük miktarlarda sitoplazma sızıntısına neden olur ve bu sorunlar ortaya çıktığında yeni iğneler kullanılmalıdır. Kaynak ağzı açma iğneleri mikroenjeksiyon verimliliğini artırabilse de, öğütme çözeltisi öğütme işlemi sırasında eğimli uca girer. Eğimli uçtaki öğütme çözeltisi doğal olarak hızlı bir şekilde buharlaşmaz; Bu nedenle, iğneler eğim verildikten hemen sonra mikroenjeksiyon için kullanılamaz. Bu faktörler embriyo mikroenjeksiyon işlemlerinin etkinliğini azaltmaktadır. Burada, örnek olarak Drosophila'da phiC31 aracılı bölgeye özgü transgenezi kullanarak, Drosophila'da transgenez için embriyo mikroenjeksiyonu için bir protokol sunuyoruz. Öğütme çözeltisinin iğneye girmesini önlemek için, iğne içinde hava basıncı uygulamak için bir hava pompası kullanıyoruz, böylece öğütme çözeltisinin eğimli uca girmesini önlüyoruz. Eğimli iğneler, eğim verildikten hemen sonra numune yükleme ve mikroenjeksiyon için hazırdır.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>100 &#956;m Cell Strainer</td>
			<td>NEST</td>
			<td>258367</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3M double-sided adhesive</td>
			<td>3M</td>
			<td>415</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate glass</td>
			<td>SUTTER</td>
			<td>B100-75-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diamond abrasive plate</td>
			<td>SUTTER</td>
			<td>104E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FLAMING/BROWN Micropipette Puller</td>
			<td>SUTTER</td>
			<td>P-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foot air pump with pressure gauge</td>
			<td>Shenfeng</td>
			<td>SF8705D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halocarbon oil 27</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H8773</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halocarbon oil 700</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H8898</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>ECLIPSE Ts2R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microinjection pump</td>
			<td>eppendorf</td>
			<td>FemtoJet 4i</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>eppendorf</td>
			<td>TransferMan 4r</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette Beveler</td>
			<td>SUTTER</td>
			<td>BV-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope cover glasses (18 mm x 18 mm)</td>
			<td>CITOLAS</td>
			<td>10211818C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides (25 mm x 75 mm)</td>
			<td>CITOLAS</td>
			<td>188105W</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish (90 mm x 15 mm)</td>
			<td>LAIBOER</td>
			<td>4190152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photo-Flo 200</td>
			<td>Kodak</td>
			<td>1026269</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAprep Spin Miniprep Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>27106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ745</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

embryo microinjection for transgenesis in drosophila

Drosophila'daki transgenez, organizma düzeyinde gen fonksiyonunu incelemek için önemli bir yaklaşımdır. Embriyo mikroenjeksiyonu, transgenik sineklerin inşası için çok önemli bir adımdır. Mikroenjeksiyon, bir mikroenjektör, bir mikromanipülatör, bir ters mikroskop ve bir stereo mikroskop dahil olmak üzere bazı ekipman türleri gerektirir. Bir plazmid miniprep kiti ile izole edilen plazmitler mikroenjeksiyon için uygundur. Çekirdeklerin ortak bir sitoplazmayı paylaştığı blastoderm öncesi veya sinsityal blastoderm aşamasındaki embriyolar mikroenjeksiyona tabi tutulur. Bir hücre süzgeci, embriyoların dekoryona ayrılma sürecini kolaylaştırır. Embriyoların dekoryonasyonu ve kuruması için en uygun zamanın deneysel olarak belirlenmesi gerekir. Embriyo mikroenjeksiyonunun etkinliğini artırmak için, bir çektirme tarafından hazırlanan iğnelerin bir iğneli öğütücü ile pahlanması gerekir. İğneleri taşlama sürecinde, iğne ucunun kılcal etkisini önlemek için manometreli bir ayak hava pompası kullanıyoruz. Her plazmit için rutin olarak 120-140 embriyo enjekte ediyoruz ve plazmitlerin yaklaşık% 85'i için en az bir transgenik hat elde ediyoruz. Bu makale, Drosophila'daki phiC31 integraz aracılı transgenezi örnek olarak almakta ve Drosophila'da transgenez için embriyo mikroenjeksiyonu için ayrıntılı bir protokol sunmaktadır.

The fruit fly Drosophila melanogaster is extremely amenable to genetic manipulation and genetic analysis. Transgenic fruit flies are widely used in biological research. Since it was developed in the early 1980s, P-element transposon-mediated transgenesis has been indispensable for Drosophila research1. In some scenarios, other transposons, such as piggyBac and Minos have been used for transgenesis in Drosophila as well2. Transgenes via transposon are randomly inserted into the Drosophila genome, and the expression levels of transgenes at different genomic loci may vary due to position effects and thereby can not be compared2. These drawbacks were overcome by the phiC31-mediated site-specific transgenesis3. The bacteriophage&#160;phiC31 gene encodes an integrase that mediates sequence-specific recombination between the attB and attP sites in Drosophila3. Many attP docking sites have been characterized and are available in the Bloomington Drosophila Stock Center3,4,5,6,7,8,9.
The phiC31 transgenesis system for Drosophila has been widely used by the fly community. Among the attP docking sites, attP18 on the X chromosome, attP40 on the second chromosome, and attP2 on the third chromosome are usually the preferred sites for transgene integration on each chromosome because transgenes at the three sites show high levels of inducible expression while having low levels of basal expression5. Recently, however, van der Graaf and colleagues found that the attP40 site, close to the Msp300 gene locus, and transgenes integrated at attP40 cause larval muscle nuclear clustering in Drosophila10. In another recent study, Duan and colleagues found that the homozygous attP40 chromosome disrupts the normal glomerular organization of the Or47b olfactory receptor neuron class in Drosophila11. These findings suggest that rigorous controls should be included when designing experiments and interpreting data.
Drosophila is an ideal model organism for in vivo interrogation of gene function due to its short life cycle, low cost, and easy maintenance. Genome-wide genetic screening relies on the construction of genome-wide transgenic libraries in Drosophila12,13,14,15. We previously generated 5551 UAS-cDNA/ORF constructs based on the binary GAL4/upstream activating sequence (GAL4/UAS) system, covering 83% of the Drosophila genes conserved in humans in the Drosophila Genomics Resource Center (DGRC) Gold Collection16. The UAS-cDNA/ORF plasmids can be used for the creation of a transgenic UAS-cDNA/ORF library in Drosophila. Efficient embryo microinjection technology can accelerate the creation of transgenic fly libraries.
For embryo microinjection, the needle tip is normally broken against a coverslip17. Thereby, needles frequently become clogged or cause leakage of large amounts of cytoplasm, and when these issues arise, new needles must be employed. Although beveling needles can enhance microinjection efficiency, the grinding solution enters the beveled tip during the grinding process. The grinding solution in the beveled tip does not quickly evaporate naturally; therefore, needles can not be utilized for microinjection directly after beveling. These factors reduce the efficiency of embryo microinjection procedures. Here, using the phiC31-mediated site-specific transgenesis in Drosophila as an example, we present a protocol for embryo microinjection for transgenesis in Drosophila.&#160;To prevent the grinding solution from entering the needle, we utilize an air pump to exert air pressure within the needle, thereby preventing the grinding solution from entering the beveled tip. Beveled needles are ready for sample loading and microinjection directly after beveling.

Yazar Spotlight: Drosophila'da Transgenez için Embriyo Mikroenjeksiyonunun Optimize Edilmesi

Drosophila'da Transgenez için Embriyo Mikroenjeksiyonu

Transgenesis in Drosophila is essential for studying gene function at the organism level. Embryo microinjection is a crucial step for construction of transgenic flies. Here, we take the phiC31 integrase-mediated transgenesis in Drosophila as an example and present a detailed protocol for embryo microinjection for transgenesis in Drosophila.Injection needles whose tips are beveled by a grinder do not usually get blocked or elicit large cytoplasmic leakage. However, the grinding solution can enter the beveled tip of a needle during the grinding process and the grinding solution inside the tip does not naturally dry up quickly. Our protocol uses a foot air pump with a pressure gauge to apply air pressure to a needle while grinding its tip.This prevents the grinding solution from siphoning, thereby the grinding solution is prevented from entering the beveled tip, enabling the beveled needle to be used immediately.

Bir enjeksiyon iğnesinin ucu, bir iğneli öğütücü ile eğimlendirilir (Şekil 1). Bir saatte 50-60 iğne eğim verilebilir. DNA, çekirdeklerin ortak bir sitoplazmayı paylaştığı blastoderm öncesi veya sinsityal blastoderm aşamasında bir embriyonun arkasına mikroenjekte edilir (Şekil 2A). Bir embriyonun arka tarafı, embriyonun ön tarafındaki mikropil'e bağlı olarak kolayca yerleştirilebilir (Şekil 2A). Hücrese...

Bu makale, Drosophila'daki phiC31 integraz aracılı transgenezi örnek olarak almakta ve transgenik sinekler oluşturmak için çok önemli bir adım olan embriyo mikroenjeksiyonu için optimize edilmiş bir protokol sunmaktadır.

Transgenesis in Drosophila is an essential approach to studying gene function at the organism level. Embryo microinjection is a crucial step for the ...

Drosophila'daki transgenez, organizma düzeyinde gen fonksiyonunu incelemek için gereklidir. Embriyo mikroenjeksiyonu, transgenik sineklerin inşası için çok önemli bir adımdır. Burada, Drosophila'daki phiC31 integraz aracılı transgenezi örnek olarak alıyoruz ve Drosophila'da transgenez için embriyo mikroenjeksiyonu için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz.Uçları bir öğütücü tarafından pahlanan enjeksiyon iğneleri genellikle tıkanmaz veya büyük sitoplazmik sızıntıya neden olmaz. Bununla birlikte, öğütme çözeltisi, öğütme işlemi sırasında bir iğnenin eğimli ucuna girebilir ve ucun içindeki öğütme çözeltisi doğal olarak hızlı bir şekilde kurumaz. Protokolümüz, ucunu taşlarken bir iğneye hava basıncı uygulamak için manometreli bir ayak hava pompası kullanır.Bu, öğütme çözeltisinin sifonlanmasını önler, böylece öğütme çözeltisinin eğimli uca girmesi önlenir ve eğimli iğnenin hemen kullanılmasını sağlar.

embryo-microinjection-for-transgenesis-in-drosophila

Research

JoVE Journal

Genetics

Embryo Microinjection for Transgenesis in Drosophila

994 Görüntüleme.  University of South China. Drosophila'daki transgenez, organizma düzeyinde gen fonksiyonunu incelemek için gereklidir. Embriyo mikroenjeksiyonu, transgenik sineklerin inşası için çok önemli bir adımdır. Burada, Drosophila'daki phiC31 integraz aracılı transgenezi örnek olarak alıyoruz ve Drosophila'da transgenez için embriyo mikroenjeksiyonu için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz.Uçları bir öğütücü tarafından pahlanan enjeksiyon iğneleri genellikle tıkanmaz veya büyük sitoplazmik sız...