Die Arbeit wurde vom Scientific Research Fund for High-Level Talents der University of South China unterstützt.

1. Herstellung von Plasmiden
<ol><li>Isolieren Sie Plasmide aus 4-ml-Bakterienkulturen über Nacht mit einem Plasmid-Miniprep-Kit. Eluieren Sie mit 40 μl Elutionspuffer. HINWEIS: Die Isolierung von Plasmiden mit einem Plasmid-Midi-Prep-Kit ist nicht erforderlich. Ein Plasmid-Miniprep-Kit kann die experimentellen Anforderungen für die Mikroinjektion von Embryonen vollständig erfüllen. In diesem Protokoll enthalten die präparierten UAS-cDNA/ORF-Plasmide zehn Kopien von UAS, einen Hsp70-Minimalpromotor, eine attB-Stelle, ein mini-weißes Gen und ein Gen von Interesse.</li>
	<li>Bestimmen Sie die Plasmid-DNA-Konzentration mit einem Spektralphotometer und lagern Sie es bei -80 °C im Gefrierschrank. HINWEIS: Die Plasmidkonzentration ist für eine erfolgreiche Mikroinjektion des Embryos nicht entscheidend, da Plasmidkonzentrationen im Bereich von 20 ng/μl bis 1683 ng/μl gut für die Transgenese in Drosophila geeignet sind (Ergänzende Tabelle 1).</li>
	<li>Kurz vor der Mikroinjektion die Plasmide auftauen und bei 13000 x g für 5 min zentrifugieren.</li>
	<li>Übertragen Sie 10 μl jedes Plasmids aus der oberen Schicht der Flüssigkeit in ein neues 1,5-ml-Röhrchen.</li>
</ol>2. Nadeln ziehen
<ol><li>Schalten Sie einen Nadelabzieher mit ausgewählten Einstellungen ein (Hitze: 500, Zug: 50, Vel: 60, Verzögerung: 90, Druck: 200, Rampentest: 510).</li>
	<li>Führen Sie eine Kapillare aus Borosilikatglas (Außendurchmesser 1,0 mm, Innendurchmesser 0,75 mm, 10 cm Länge) in den Nadelabzieher ein und schließen Sie den Deckel.</li>
	<li>Drücken Sie die Pull-Taste . Jede Glaskapillare bildet zwei Nadeln.</li>
</ol>3. Schleifnadeln (Abbildung 1)
<ol><li>Verwenden Sie einen Nadelschleifer, der mit einer geeigneten Schleifplatte (für Spitzengrößen von 0,7-2,0 μm) eines Nadelschleifers montiert ist.</li>
	<li>Befeuchten Sie das Tuch (Referenzdraht) mit Schleiflösung (100 mL destilliertes Wasser mit 0,9 g NaCl, 1 mL Netzmittel) und fixieren Sie das Tuch.</li>
	<li>Schalten Sie den Nadelschleifer ein und drehen Sie die Schleifplatte weiter.</li>
	<li>Verbinden Sie eine Nadel mit einem Manometer über einen Silikonkapillarschlauch mit einer Fußluftpumpe und montieren Sie die Nadel dann auf einen Nadelhalter des Nadelschleifers. Stellen Sie den Winkel der Nadel relativ zur Schleifplatte auf 35° ein (Abbildung 1A, B).</li>
	<li>Stellen Sie die Position der Nadelspitze direkt über der Oberfläche der Schleifplatte ein, indem Sie einen groben Bedienknopf unter dem Mikroskop verwenden (Abbildung 1C). HINWEIS: Die in Abschnitt 2 erhaltenen gezogenen Nadeln haben eine Verjüngung von 6-8 mm und eine Spitze von weniger als 1 μm (Abbildung 1D), wie in der Bedienungsanleitung des Abziehers beschrieben.</li>
	<li>Halten Sie den Innendruck der Nadel mit der Fußluftpumpe bei 40 psi. Stellen Sie die Position der Nadelspitze mit einem feinen Drehknopf unter dem Mikroskop ein und lassen Sie die Spitze der Nadel die Schleifplatte berühren.</li>
	<li>3-5 s mahlen. Wenn winzige Luftblasen aus der Nadelspitze austreten, entladen Sie die Nadel (Abbildung 1E). HINWEIS: Während des Schleifvorgangs verhindert die Verwendung einer Luftpumpe, dass die Schleiflösung abgesaugt wird.</li>
	<li>Lege die gemahlenen Nadeln in einen Aufbewahrungskoffer. HINWEIS: Verwenden Sie so oft wie möglich frisch gemahlene Nadeln, obwohl die gemahlenen Nadeln vor der Mikroinjektion mindestens einige Wochen in einem Aufbewahrungsbehälter aufbewahrt werden können.</li>
</ol>4. Vorbereiten von Pipetten zum Laden von Plasmiden
<ol><li>Eine 200-μl-Pipette mit der äußeren Flamme eines Alkoholbrenners erhitzen.</li>
	<li>Sobald es zu schmelzen beginnt, dehnen Sie die Pipette.</li>
	<li>Schneiden Sie das versiegelte Ende der gedehnten Pipette mit einer Schere ab, und die gedehnte Pipette ist dann bereit, die DNA in eine gemahlene Nadel zu laden. HINWEIS: Alternativ sind extrem lange und feine Spitzen zum Befüllen von geschliffenen Nadeln im Handel erhältlich.</li>
	<li>Legen Sie diese Pipetten in eine autoklavierte Kunststoffbox.</li>
</ol>5. Entnahme von Embryonen
<ol><li>Fliegen (vas-phiC31; + ; attP2), die phiC31-Integrase exprimieren und 3 Tage nach dem Schlüpfen die attP2-Andockstelle tragen, werden aus 50 Fläschchen gesammelt und in einen Käfig (φ 90 mm x 150 mm) gebracht. Gib etwas frische Hefepaste in die Mitte jeder Trauben-Agar-Platte18.</li>
	<li>Bereiten Sie 2-4 Käfige mit Fliegen vor. Halten Sie die Käfige und Platten bei 25 °C und wechseln Sie die Platten täglich für 2-4 Tage. HINWEIS: In dieser Studie wurde das vas-phiC31-Transgen (Stock # 36313, Bloomington Drosophila Stock Center) auf dem ersten Chromosom und das attP2-Transgen (Stock # 36313, Bloomington Drosophila Stock Center) auf dem dritten Chromosom kombiniert. Der resultierende Stamm (vas-phiC31; + ; attP2) wird in diesem Protokoll verwendet. Hefepaste muss täglich zubereitet werden, und frische Hefepaste muss an die Fliegen verfüttert werden. Die ersetzten Käfige müssen gereinigt und getrocknet werden, um die verbleibenden Embryonen in den Käfigen zu entfernen.</li>
	<li>Wechseln Sie am Tag der Mikroinjektion die Käfige und Platten am Morgen. Wechseln Sie dann alle 30 Minuten die Platten und entnehmen Sie Embryonen von diesen Platten. Wechseln Sie alle Käfige und Platten bei Raumtemperatur (RT) und halten Sie die Käfige und Platten anschließend bei 25 °C. HINWEIS: Einige Protokolle bevorzugen es, die Käfige und Platten für die Eiablage bei 18 °C zu inkubieren. Das hängt von der Anzahl der Embryonen ab, die man für die Mikroinjektion benötigt.</li>
</ol>6. Dechorionierung von Embryonen
<ol><li>Bereiten Sie 30 % Bleichmittel vor, indem Sie 60 ml Bleichmittel (mit einem Gehalt an aktivem Chlor von 34-46 g/l) und 140 ml doppelt destilliertes Wasser mischen.</li>
	<li>Entfernen Sie die restlichen Fliegen auf den Traubensaft-Agarplatten mit einer Bürste oder Pinzette und spülen Sie die Embryonen in ein Zellsieb mit doppelt destilliertem Wasser.</li>
	<li>Trocknen Sie das Zellsieb mit den Embryonen mit Seidenpapier ab.</li>
	<li>Geben Sie es in eine Petrischale mit 30 % Bleiche und schwenken Sie das Zellsieb von Hand oder einem horizontalen Shaker 1,5 Minuten lang bei 60 U/min. HINWEIS: Das Spülen ist ein kritischer Schritt. Wenn die Spülzeit nicht lang genug ist, löst sich die Hülle eines Embryos nicht vollständig. Wenn die Spülzeit zu lang ist, wird der Embryo weich und bricht leicht. Das Zellsieb sollte vollständig in das 30%ige Bleichmittel getaucht werden. Tragen Sie ein Paar Gummihandschuhe und einen Laborkittel, um Verletzungen durch Bleichmittel zu vermeiden.</li>
	<li>Spülen Sie die Embryonen 2 Minuten lang mit doppelt destilliertem Wasser, das in einer Labor-Plastikwaschflasche aufbewahrt wird, um die Bleichmittelreste zu entfernen. Wählen Sie die schwimmenden Embryonen für die Aufstellung aus.</li>
</ol>7. Embryonen aneinanderreihen
<ol><li>Den festen Traubensaft-Agar mit einer Klinge in lange Streifen schneiden. HINWEIS: Verwenden Sie violetten Traubensaft, um das Aneinanderreihen weißer Embryonen zu erleichtern.</li>
	<li>Übertragen Sie die Embryonen mit einem Pinsel auf einen langen Streifen.</li>
	<li>Richten Sie etwa 60 Embryonen mit einer Präpariernadel entlang des Randes eines langen Streifens aus, wobei ihr Hinterteil zur Außenseite des Streifens zeigt. Stellen Sie etwa 60 Embryonen innerhalb von 5 Minuten auf. HINWEIS: Die Mikropyle ist ein kegelförmiger Vorsprung am vorderen Pol des Embryos, durch den das Sperma eintritt, um die Eizelle zu befruchten (Abbildung 2A). Anhand des kegelförmigen Vorsprungs am vorderen Pol des Embryos ist es daher einfach, den hinteren Teil des dechorionierten Embryos zu bestimmen.</li>
	<li>Legen Sie ein doppelseitiges Klebeband von 18 mm in Längsrichtung entlang der Kante eines Deckglases (18 mm x 18 mm) und entfernen Sie die Papierunterlage. Drücken Sie das Deckglas vorsichtig auf die ausgerichteten Embryonen. Stellen Sie sicher, dass die Embryonen in der Mitte des Klebebandes festgeklebt sind.</li>
</ol>8. Austrocknen von Embryonen
<ol><li>Legen Sie das Deckglas mit den aufgereihten Embryonen in eine Schachtel mit Trockenmittel. Die Trocknungszeit variiert je nach Temperatur und Luftfeuchtigkeit. HINWEIS: Die Trocknungszeit ist für die Mikroinjektion entscheidend und muss experimentell bestimmt werden. Die Trocknungszeit beträgt in der Regel 9-10 min im Sommer und 17-18 min im Winter.</li>
	<li>Bedecken Sie die Embryonen mit Halogenkohlenwasserstofföl. HINWEIS: Tropfen Sie nicht zu viel Öl auf die Embryonen, da das überschüssige Öl den Klebstoff überlaufen lassen kann. Das Volumenverhältnis von Halogenkohlenwasserstofföl 700 und Halogenkohlenwasserstofföl 27 beträgt 1:3.</li>
</ol>9. Mikroinjektion von Embryonen
<ol><li>Laden Sie 2 μl DNA mit der gedehnten Pipette in die Nadel. Achten Sie darauf, dass sich keine Blasen in der Nadel befinden. Setzen Sie die Nadel in den Nadelhalter des Mikromanipulators ein.</li>
	<li>Legen Sie die ausgerichteten Embryonen, die mit Halogenkohlenwasserstofföl bedeckt sind, unter ein inverses Mikroskop. Stellen Sie sicher, dass die hinteren Enden der Embryonen zur Nadel zeigen.</li>
	<li>Verwenden Sie den Mikromanipulator, um die Nadel in die Nähe der Embryonen zu bringen. Säubern Sie die Nadel. Stellen Sie sicher, dass ein Tropfen Flüssigkeit, der aus der Nadel austritt, sichtbar ist. Ausgehend von 300 hPa Einspritzdruck und 20 hPa Gleichgewichtsdruck den Einspritzdruck und den Gleichgewichtsdruck anpassen, um die optimale Größe des Flüssigkeitstropfens zu gewährleisten.</li>
	<li>Verwenden Sie den Mikromanipulator, um die Nadel in die hinteren Enden der Embryonen einzuführen, und verwenden Sie den Fußschalter, der mit dem Mikroinjektor verbunden ist, um die DNA zu injizieren (Abbildung 2). Ist ein kleiner Halo sichtbar, wird die DNA erfolgreich in den Embryo injiziert. HINWEIS: Wählen Sie die mehrkernigen Embryonen für die Injektion aus und töten Sie die älteren Embryonen mit der Schaltfläche "Reinigen". Wenn nach der Injektion eine große Menge Zytoplasma austritt, werden die Embryonen untergetrocknet. Wenn nach der Injektion nur eine geringe oder keine Menge Zytoplasma austritt, gelten Injektionen als erfolgreich. Wenn mehr als ein Drittel der Embryonen nach der Injektion Zytoplasma austritt, verlängern Sie die Trocknungszeit um 1-2 Minuten. Wenn mehr als ein Drittel der Embryonen übergetrocknet sind, verkürzen Sie die Trocknungszeit um 1-2 Minuten.</li>
	<li>Entferne die Nadel aus dem Embryo. Bewegen Sie die Nadel zum hinteren Ende des nächsten Embryos. Wiederholen Sie die obigen Schritte.</li>
	<li>Legen Sie die injizierten Embryonen in eine Agarplatte. Stellen Sie die Platte in einen Raum mit 18-20 °C. Am nächsten Tag stellen Sie die Platte bei einer Temperatur von 25 °Cund einer Luftfeuchtigkeit von 50%-60% in einen Inkubator und inkubieren Sie sie 1 Tag lang. HINWEIS: Halten Sie die Embryonen nach der Injektion bei einer Temperatur von 18-20 °C, um ihre Entwicklung zu verlangsamen, die Integration von Plasmid-DNA in das Drosophila-Genom zu erleichtern und die Überlebensrate der injizierten Embryonen zu erhöhen.</li>
</ol>10. Larven sammeln
<ol><li>Verwenden Sie eine Präpariernadel, um das Essen in einem Fläschchen abzukratzen und zu lösen. Versorgen Sie die Lebensmittel mit ein paar Tropfen destilliertem Wasser. HINWEIS: Lassen Sie das destillierte Wasser in das Futter aufnehmen, um ein Ertrinken der Larven zu verhindern.</li>
	<li>Nehmen Sie die Platten aus dem Inkubator.</li>
	<li>Sammeln Sie die geschlüpften Larven mit einem Pinsel unter einem Stereomikroskop und übertragen Sie sie in das Fläschchen.</li>
	<li>Stellen Sie das Fläschchen bei einer Temperatur von 25 °Cund einer Luftfeuchtigkeit von50%-60% in einen Inkubator.</li>
</ol>11. Gewinnung transgener Fliegen
<ol><li>Sammeln Sie die geschlüpften Fliegen, nachdem das Fläschchen 10 Tage lang bei 25 °Cinkubiert wurde.</li>
	<li>Kreuzen Sie eine einzelne männliche Fliege mit drei jungfräulichen weiblichen Fliegen der TM2/TM6C Sb1 Tb1 Balancer und kreuzen Sie eine einzelne weibliche Fliege mit drei männlichen Fliegen der TM2/TM6C Sb1 Tb1 Balancer.</li>
	<li>Legen Sie die Kreuze bei einer Temperatur von 25 °C und einer Luftfeuchtigkeit von 50%-60% in einen Inkubator.</li>
	<li>Untersuchen Sie die Nachkommen auf Fliegen mit orangefarbenen Augen. Dies sind die transgenen Fliegen (Abbildung 3A-C). HINWEIS: Fliegen, die eine Kopie des Transgens an der attP2-Andockstelle tragen, haben orangefarbene Augen.</li>
	<li>Kreuzen Sie eine einzelne orangeäugige männliche Fliege mit drei jungfräulichen weiblichen Fliegen der TM2/TM6C Sb1 Tb1 Balancer, um einen Bestand anzulegen. HINWEIS: Es müssen mehr als eine Generation von Kreuzungen eingerichtet werden, um das phiC31-Transgen auf dem ersten Chromosom durchzustreichen.</li>
</ol>

phiC31 Integrase-vermittelte Embryotransgenese bei Drosophila

<ol>
	<li>Rubin, G. M., Spradling, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+transformation+of+Drosophila+with+transposable+element+vectors.">Genetic transformation of Drosophila with transposable element vectors.</a> Science. 218 (4570), 348-353 (1982).</li><li>Venken, K. J., Bellen, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenesis+upgrades+for+Drosophila+melanogaster.">Transgenesis upgrades for Drosophila melanogaster.</a> Development. 134 (20), 3571-3584 (2007).</li><li>Groth, A. C., Fish, M., Nusse, R., Calos, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+of+transgenic+Drosophila+by+using+the+site-specific+integrase+from+phage+phic31.">Construction of transgenic Drosophila by using the site-specific integrase from phage phic31.</a> Genetics. 166 (4), 1775-1782 (2004).</li><li>Bischof, J., Maeda, R. K., Hediger, M., Karch, F., Basler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimized+transgenesis+system+for+Drosophila+using+germ-line-specific+phic31+integrases.">An optimized transgenesis system for Drosophila using germ-line-specific phic31 integrases.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (9), 3312-3317 (2007).</li><li>Markstein, M., Pitsouli, C., Villalta, C., Celniker, S. E., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploiting+position+effects+and+the+gypsy+retrovirus+insulator+to+engineer+precisely+expressed+transgenes.">Exploiting position effects and the gypsy retrovirus insulator to engineer precisely expressed transgenes.</a> Nat Genet. 40 (4), 476-483 (2008).</li><li>Bateman, J. R., Lee, A. M., Wu, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specific+transformation+of+Drosophila+via+phic31+integrase-mediated+cassette+exchange.">Site-specific transformation of Drosophila via phic31 integrase-mediated cassette exchange.</a> Genetics. 173 (2), 769-777 (2006).</li><li>Venken, K. J., He, Y., Hoskins, R. A., Bellen, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=P[acman]:+A+BAC+transgenic+platform+for+targeted+insertion+of+large+DNA+fragments+in+D.+melanogaster.">P[acman]: A BAC transgenic platform for targeted insertion of large DNA fragments in D. melanogaster.</a> Science. 314 (5806), 1747-1751 (2006).</li><li>Szabad, J., Bellen, H. J., Venken, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+assay+to+detect+in+vivo+Y+chromosome+loss+in+Drosophila+wing+disc+cells.">An assay to detect in vivo Y chromosome loss in Drosophila wing disc cells.</a> G3. 2 (9), 1095-1102 (2012).</li><li>Ringrose, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenesis+in+Drosophila+melanogaster.">Transgenesis in Drosophila melanogaster.</a> Methods Mol Biol. 561, 3-19 (2009).</li><li>Van Der Graaf, K., Srivastav, S., Singh, P., Mcnew, J. A., Stern, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Drosophila+melanogaster+attp40+docking+site+and+derivatives+are+insertion+mutations+of+msp-300.">The Drosophila melanogaster attp40 docking site and derivatives are insertion mutations of msp-300.</a> PLoS One. 17 (12), e0278598 (2022).</li><li>Duan, Q., Estrella, R., Carson, A., Chen, Y., Volkan, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+Drosophila+attp40+background+on+the+glomerular+organization+of+or47b+olfactory+receptor+neurons.">The effect of Drosophila attp40 background on the glomerular organization of or47b olfactory receptor neurons.</a> G3. 13 (4), 022 (2023).</li><li>Dietzl, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genome-wide+transgenic+RNAi+library+for+conditional+gene+inactivation+in+Drosophila.">A genome-wide transgenic RNAi library for conditional gene inactivation in Drosophila.</a> Nature. 448 (7150), 151-156 (2007).</li><li>Pfeiffer, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tools+for+neuroanatomy+and+neurogenetics+in+Drosophila.">Tools for neuroanatomy and neurogenetics in Drosophila.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (28), 9715-9720 (2008).</li><li>Bellen, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Drosophila+gene+disruption+project:+Progress+using+transposons+with+distinctive+site+specificities.">The Drosophila gene disruption project: Progress using transposons with distinctive site specificities.</a> Genetics. 188 (3), 731-743 (2011).</li><li>Zirin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+transgenic+drosophila+resource+collections+for+loss-+and+gain-of-function+studies.">Large-scale transgenic drosophila resource collections for loss- and gain-of-function studies.</a> Genetics. 214 (4), 755-767 (2020).</li><li>Wei, P., Xue, W., Zhao, Y., Ning, G., Wang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-based+modular+assembly+of+a+UAS-cDNA/ORF+plasmid+library+for+more+than+5500+Drosophila+genes+conserved+in+humans.">CRISPR-based modular assembly of a UAS-cDNA/ORF plasmid library for more than 5500 Drosophila genes conserved in humans.</a> Genome Res. 30 (1), 95-106 (2020).</li><li>Fish, M. P., Groth, A. C., Calos, M. P., Nusse, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Creating+transgenic+Drosophila+by+microinjecting+the+site-specific+phic31+integrase+mRNA+and+a+transgene-containing+donor+plasmid.">Creating transgenic Drosophila by microinjecting the site-specific phic31 integrase mRNA and a transgene-containing donor plasmid.</a> Nat Protoc. 2 (10), 2325-2331 (2007).</li><li>Fujioka, M., Jaynes, J. B., Bejsovec, A., Weir, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+transgenic+Drosophila.">Production of transgenic Drosophila.</a> Methods Mol Biol. 136, 353-363 (2000).</li><li>Loncar, D., Singer, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+membrane+formation+during+the+cellularization+of+the+syncytial+blastoderm+of+Drosophila.">Cell membrane formation during the cellularization of the syncytial blastoderm of Drosophila.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (6), 2199-2203 (1995).</li><li>Carmo, C., Araujo, M., Oliveira, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microinjection+techniques+in+fly+embryos+to+study+the+function+and+dynamics+of+SMC+complexes.">Microinjection techniques in fly embryos to study the function and dynamics of SMC complexes.</a> Methods Mol Biol. 2004, 251-268 (2019).</li></ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Hier stellen wir ein Protokoll für die Mikroinjektion von Embryonen zur Transgenese bei Drosophila vor. Für die phiC31-vermittelte ortsspezifische Transgenese injizierten wir 120-140 Embryonen für jedes Plasmid und erhielten mindestens eine transgene Linie für etwa 85% der Plasmide (Ergänzende Tabelle 2). Unserer Erfahrung nach ist Plasmid-DNA, die mit einem Plasmid-Miniprep-Kit isoliert wurde, für die Transgenese in Drosophila ausreichend. Plasmid-DNA-Konzentrationen von 20 ng/μ...

Die Fruchtfliege Drosophila melanogaster ist äußerst empfänglich für genetische Manipulationen und genetische Analysen. Transgene Fruchtfliegen sind in der biologischen Forschung weit verbreitet. Seit ihrer Entwicklung in den frühen 1980er Jahren ist die P-Element-Transposon-vermittelte Transgenese für die Drosophila-Forschung unverzichtbar1. In einigen Szenarien wurden auch andere Transposons wie piggyBac und Minos für die Transgenese in Drosophila verwendet2. Transgene über Transposons werden zufällig in das Drosophila-Genom eingefügt, und die Expressionsniveaus von Transgenen an verschiedenen genomischen Loci können aufgrund von Positionseffekten variieren und können daher nicht verglichen werden2. Diese Nachteile wurden durch die phiC31-vermittelte ortsspezifische Transgeneseüberwunden 3. Das Bakteriophagen-Gen phiC31 kodiert für eine Integrase, die die sequenzspezifische Rekombination zwischen den attB- und attP-Stellen in Drosophila3 vermittelt. Viele attP-Andockstellen wurden charakterisiert und sind im Bloomington Drosophila Stock Center 3,4,5,6,7,8,9 verfügbar.
Das phiC31-Transgenese-System für Drosophila wird von der Fliegengemeinschaft in großem Umfang eingesetzt. Unter den attP-Andockstellen sind attP18 auf dem X-Chromosom, attP40 auf dem zweiten Chromosom und attP2 auf dem dritten Chromosom in der Regel die bevorzugten Stellen für die Transgenintegration auf jedem Chromosom, da Transgene an den drei Stellen ein hohes Maß an induzierbarer Expression aufweisen, während sie ein geringes Maß an basaler Expression aufweisen5. Kürzlich fanden van der Graaf und Kollegen jedoch heraus, dass die attP40-Stelle in der Nähe des Msp300-Genlocus und an attP40 integrierte Transgene in Drosophila10 eine nukleare Clusterbildung der Larvenmuskulatur verursachen. In einer anderen aktuellen Studie fanden Duan und Kollegen heraus, dass das homozygote attP40-Chromosom die normale glomeruläre Organisation der Or47b-Geruchsrezeptor-Neuronenklasse in Drosophilastört 11. Diese Ergebnisse legen nahe, dass bei der Planung von Experimenten und der Interpretation von Daten strenge Kontrollen einbezogen werden sollten.
Drosophila ist aufgrund seines kurzen Lebenszyklus, seiner geringen Kosten und seiner einfachen Wartung ein idealer Modellorganismus für die In-vivo-Abfrage der Genfunktion. Das genomweite genetische Screening beruht auf dem Aufbau genomweiter transgener Bibliotheken in Drosophila 12,13,14,15. Wir haben zuvor 5551 UAS-cDNA/ORF-Konstrukte basierend auf dem binären GAL4/Upstream Activating Sequence (GAL4/UAS)-System generiert, das 83% der Drosophila-Gene abdeckt, die beim Menschen in der Drosophila Genomics Resource Center (DGRC) Gold Collection16 konserviert sind. Die UAS-cDNA/ORF-Plasmide können für die Erstellung einer transgenen UAS-cDNA/ORF-Bibliothek in Drosophila verwendet werden. Die effiziente Mikroinjektionstechnologie für Embryonen kann die Erstellung transgener Fliegenbibliotheken beschleunigen.
Bei der Mikroinjektion von Embryonen wird die Nadelspitze normalerweise gegen ein Deckglasgebrochen 17. Dadurch verstopfen häufig die Nadeln oder verursachen das Austreten großer Mengen an Zytoplasma, und wenn diese Probleme auftreten, müssen neue Nadeln verwendet werden. Obwohl das Anfasen von Nadeln die Effizienz der Mikroinjektion verbessern kann, gelangt die Schleiflösung während des Schleifvorgangs in die abgeschrägte Spitze. Die Mahllösung in der abgeschrägten Spitze verdunstet nicht schnell auf natürliche Weise; Daher können Nadeln nicht direkt nach dem Anfasen für die Mikroinjektion verwendet werden. Diese Faktoren verringern die Effizienz von Mikroinjektionsverfahren für Embryonen. Am Beispiel der phiC31-vermittelten ortsspezifischen Transgenese in Drosophila wird ein Protokoll für die Mikroinjektion von Embryonen zur Transgenese in Drosophila vorgestellt. Um zu verhindern, dass die Schleiflösung in die Nadel eindringt, verwenden wir eine Luftpumpe, die Luftdruck in der Nadel ausübt und so verhindert, dass die Schleiflösung in die abgeschrägte Spitze eindringt. Abgeschrägte Nadeln sind direkt nach dem Anfasen bereit für die Probenbeladung und Mikroinjektion.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>100 &#956;m Cell Strainer</td>
			<td>NEST</td>
			<td>258367</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3M double-sided adhesive</td>
			<td>3M</td>
			<td>415</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate glass</td>
			<td>SUTTER</td>
			<td>B100-75-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diamond abrasive plate</td>
			<td>SUTTER</td>
			<td>104E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FLAMING/BROWN Micropipette Puller</td>
			<td>SUTTER</td>
			<td>P-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foot air pump with pressure gauge</td>
			<td>Shenfeng</td>
			<td>SF8705D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halocarbon oil 27</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H8773</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halocarbon oil 700</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H8898</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>ECLIPSE Ts2R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microinjection pump</td>
			<td>eppendorf</td>
			<td>FemtoJet 4i</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>eppendorf</td>
			<td>TransferMan 4r</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette Beveler</td>
			<td>SUTTER</td>
			<td>BV-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope cover glasses (18 mm x 18 mm)</td>
			<td>CITOLAS</td>
			<td>10211818C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides (25 mm x 75 mm)</td>
			<td>CITOLAS</td>
			<td>188105W</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish (90 mm x 15 mm)</td>
			<td>LAIBOER</td>
			<td>4190152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photo-Flo 200</td>
			<td>Kodak</td>
			<td>1026269</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAprep Spin Miniprep Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>27106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ745</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

embryo microinjection for transgenesis in drosophila

Die Transgenese in Drosophila ist ein wesentlicher Ansatz zur Untersuchung der Genfunktion auf der Ebene des Organismus. Die Mikroinjektion von Embryonen ist ein entscheidender Schritt für die Konstruktion transgener Fliegen. Für die Mikroinjektion sind einige Arten von Geräten erforderlich, darunter ein Mikroinjektor, ein Mikromanipulator, ein inverses Mikroskop und ein Stereomikroskop. Plasmide, die mit einem Plasmid-Miniprep-Kit isoliert wurden, sind für die Mikroinjektion qualifiziert. Embryonen im Prä-Blastoderm- oder Synzytial-Blastoderm-Stadium, bei denen sich die Zellkerne ein gemeinsames Zytoplasma teilen, werden einer Mikroinjektion unterzogen. Ein Zellsieb erleichtert den Prozess der Dechorionisierung von Embryonen. Der optimale Zeitpunkt für die Dechorionierung und Austrocknung von Embryonen muss experimentell bestimmt werden. Um die Effizienz der Mikroinjektion von Embryonen zu erhöhen, müssen die mit einem Abzieher vorbereiteten Nadeln mit einem Nadelschleifer abgeschrägt werden. Beim Schleifen von Nadeln verwenden wir eine Fußluftpumpe mit Manometer, um die Kapillarwirkung der Nadelspitze zu vermeiden. Wir injizieren routinemäßig 120-140 Embryonen für jedes Plasmid und erhalten mindestens eine transgene Linie für etwa 85% der Plasmide. Dieser Artikel nimmt die phiC31-Integrase-vermittelte Transgenese in Drosophila als Beispiel und stellt ein detailliertes Protokoll für die Mikroinjektion von Embryonen zur Transgenese in Drosophila vor.

The fruit fly Drosophila melanogaster is extremely amenable to genetic manipulation and genetic analysis. Transgenic fruit flies are widely used in biological research. Since it was developed in the early 1980s, P-element transposon-mediated transgenesis has been indispensable for Drosophila research1. In some scenarios, other transposons, such as piggyBac and Minos have been used for transgenesis in Drosophila as well2. Transgenes via transposon are randomly inserted into the Drosophila genome, and the expression levels of transgenes at different genomic loci may vary due to position effects and thereby can not be compared2. These drawbacks were overcome by the phiC31-mediated site-specific transgenesis3. The bacteriophage&#160;phiC31 gene encodes an integrase that mediates sequence-specific recombination between the attB and attP sites in Drosophila3. Many attP docking sites have been characterized and are available in the Bloomington Drosophila Stock Center3,4,5,6,7,8,9.
The phiC31 transgenesis system for Drosophila has been widely used by the fly community. Among the attP docking sites, attP18 on the X chromosome, attP40 on the second chromosome, and attP2 on the third chromosome are usually the preferred sites for transgene integration on each chromosome because transgenes at the three sites show high levels of inducible expression while having low levels of basal expression5. Recently, however, van der Graaf and colleagues found that the attP40 site, close to the Msp300 gene locus, and transgenes integrated at attP40 cause larval muscle nuclear clustering in Drosophila10. In another recent study, Duan and colleagues found that the homozygous attP40 chromosome disrupts the normal glomerular organization of the Or47b olfactory receptor neuron class in Drosophila11. These findings suggest that rigorous controls should be included when designing experiments and interpreting data.
Drosophila is an ideal model organism for in vivo interrogation of gene function due to its short life cycle, low cost, and easy maintenance. Genome-wide genetic screening relies on the construction of genome-wide transgenic libraries in Drosophila12,13,14,15. We previously generated 5551 UAS-cDNA/ORF constructs based on the binary GAL4/upstream activating sequence (GAL4/UAS) system, covering 83% of the Drosophila genes conserved in humans in the Drosophila Genomics Resource Center (DGRC) Gold Collection16. The UAS-cDNA/ORF plasmids can be used for the creation of a transgenic UAS-cDNA/ORF library in Drosophila. Efficient embryo microinjection technology can accelerate the creation of transgenic fly libraries.
For embryo microinjection, the needle tip is normally broken against a coverslip17. Thereby, needles frequently become clogged or cause leakage of large amounts of cytoplasm, and when these issues arise, new needles must be employed. Although beveling needles can enhance microinjection efficiency, the grinding solution enters the beveled tip during the grinding process. The grinding solution in the beveled tip does not quickly evaporate naturally; therefore, needles can not be utilized for microinjection directly after beveling. These factors reduce the efficiency of embryo microinjection procedures. Here, using the phiC31-mediated site-specific transgenesis in Drosophila as an example, we present a protocol for embryo microinjection for transgenesis in Drosophila.&#160;To prevent the grinding solution from entering the needle, we utilize an air pump to exert air pressure within the needle, thereby preventing the grinding solution from entering the beveled tip. Beveled needles are ready for sample loading and microinjection directly after beveling.

Autor im Rampenlicht: Optimierung der Mikroinjektion von Embryonen für die Transgenese in Drosophila

Mikroinjektion von Embryonen zur Transgenese bei Drosophila

Transgenesis in Drosophila is essential for studying gene function at the organism level. Embryo microinjection is a crucial step for construction of transgenic flies. Here, we take the phiC31 integrase-mediated transgenesis in Drosophila as an example and present a detailed protocol for embryo microinjection for transgenesis in Drosophila.Injection needles whose tips are beveled by a grinder do not usually get blocked or elicit large cytoplasmic leakage. However, the grinding solution can enter the beveled tip of a needle during the grinding process and the grinding solution inside the tip does not naturally dry up quickly. Our protocol uses a foot air pump with a pressure gauge to apply air pressure to a needle while grinding its tip.This prevents the grinding solution from siphoning, thereby the grinding solution is prevented from entering the beveled tip, enabling the beveled needle to be used immediately.

Die Spitze einer Injektionsnadel wird von einem Nadelschleifer abgeschrägt (Abbildung 1). Man kann 50-60 Nadeln in einer Stunde abschrägen. DNA wird im Prä-Blastoderm- oder Synzytial-Blastoderm-Stadium, wo sich die Zellkerne ein gemeinsames Zytoplasma teilen, in den hinteren Teil eines Embryos mikroinjiziert (Abbildung 2A). Der hintere Teil eines Embryos kann anhand der Mikropyle am vorderen Teil des Embryos leicht lokalisiert werden (Abb...

Dieser Artikel nimmt die phiC31-Integrase-vermittelte Transgenese in Drosophila als Beispiel und stellt ein optimiertes Protokoll für die Mikroinjektion von Embryonen vor, ein entscheidender Schritt für die Entstehung transgener Fliegen.

Transgenesis in Drosophila is an essential approach to studying gene function at the organism level. Embryo microinjection is a crucial step for the ...

Die Transgenese in Drosophila ist essentiell für die Untersuchung der Genfunktion auf der Ebene des Organismus. Die Mikroinjektion von Embryonen ist ein entscheidender Schritt für die Konstruktion transgener Fliegen. Hier nehmen wir die phiC31-Integrase-vermittelte Transgenese in Drosophila als Beispiel und stellen ein detailliertes Protokoll für die Mikroinjektion von Embryonen zur Transgenese in Drosophila vor.Injektionsnadeln, deren Spitzen von einer Schleifmaschine abgeschrägt werden, werden in der Regel nicht verstopft oder lösen keine großen zytoplasmatischen Leckagen aus. Allerdings kann die Schleiflösung während des Schleifvorgangs in die abgeschrägte Spitze einer Nadel eindringen und die Schleiflösung im Inneren der Spitze trocknet auf natürliche Weise nicht schnell aus. Unser Protokoll verwendet eine Fußluftpumpe mit einem Manometer, um Luftdruck auf eine Nadel auszuüben, während sie ihre Spitze schleift.Dadurch wird ein Absaugen der Schleiflösung verhindert, wodurch verhindert wird, dass die Schleiflösung in die abgeschrägte Spitze gelangt, so dass die abgeschrägte Nadel sofort verwendet werden kann.

embryo-microinjection-for-transgenesis-in-drosophila

Research

JoVE Journal

Genetics

Embryo Microinjection for Transgenesis in Drosophila

950 Aufrufe.  University of South China. Die Transgenese in Drosophila ist essentiell für die Untersuchung der Genfunktion auf der Ebene des Organismus. Die Mikroinjektion von Embryonen ist ein entscheidender Schritt für die Konstruktion transgener Fliegen. Hier nehmen wir die phiC31-Integrase-vermittelte Transgenese in Drosophila als Beispiel und stellen ein detailliertes Protokoll für die Mikroinjektion von Embryonen zur Transgenese in Drosophila vor.Injektionsnadeln, deren Spitzen von einer Schleifmaschine abgeschrägt ...