Les travaux ont été soutenus par le Fonds de recherche scientifique pour les talents de haut niveau de l’Université de Chine du Sud.

1. Préparation des plasmides
<ol><li>Isolez les plasmides de 4 ml de cultures bactériennes pendant la nuit à l’aide d’une trousse de minipréparation de plasmides. Éluer avec 40 μL de tampon d’élution. REMARQUE : L’isolement des plasmides à l’aide d’un kit de préparation de plasmides n’est pas nécessaire. Un kit de miniprep plasmidique peut répondre pleinement aux exigences expérimentales de la micro-injection d’embryons. Dans ce protocole, les plasmides UAS-ADNc/ORF préparés contiennent dix copies de UAS, un promoteur minimal Hsp70, un site attB, un gène mini-blanc et un gène d’intérêt.</li>
	<li>Déterminez la concentration d’ADN plasmidique à l’aide d’un spectrophotomètre et conservez-le au congélateur à -80 °C. REMARQUE : La concentration plasmidique n’est pas critique pour la réussite de la micro-injection embryonnaire, car des concentrations plasmidiques allant de 20 ng/μL à 1683 ng/μL fonctionnent bien pour la transgenèse chez la drosophile (tableau supplémentaire 1).</li>
	<li>Juste avant la microinjection, décongeler les plasmides et centrifuger à 13000 x g pendant 5 min.</li>
	<li>Transférez 10 μL de chaque plasmide de la couche supérieure du liquide dans un nouveau tube de 1,5 mL.</li>
</ol>2. Tirer les aiguilles
<ol><li>Allumez un extracteur d’aiguille avec les réglages sélectionnés (Chaleur : 500, Traction : 50, Vel : 60, Retard : 90, Pression : 200, Test de rampe : 510).</li>
	<li>Insérez un capillaire en verre borosilicate (diamètre extérieur 1,0 mm, diamètre intérieur 0,75 mm, longueur 10 cm) dans l’extracteur d’aiguille et fermez le couvercle.</li>
	<li>Appuyez sur le bouton Tirer . Chaque capillaire de verre forme deux aiguilles.</li>
</ol>3. Broyage des aiguilles (Figure 1)
<ol><li>Utilisez un broyeur à aiguilles monté avec une plaque abrasive appropriée (pour les pointes de 0,7 à 2,0 μm) d’un broyeur à aiguilles.</li>
	<li>Mouillez le chiffon (fil de référence) avec une solution de broyage (100 ml d’eau distillée avec 0,9 g de NaCl, 1 ml d’agent mouillant) et fixez le chiffon.</li>
	<li>Allumez le broyeur d’aiguilles et maintenez la plaque de broyage en rotation.</li>
	<li>Connectez une aiguille à une pompe à air à pied avec un manomètre via un tube capillaire en silicone, puis montez l’aiguille sur un porte-aiguille du broyeur d’aiguilles. Ajustez l’angle de l’aiguille par rapport à la plaque de broyage à 35° (Figure 1A, B).</li>
	<li>Ajustez la position de la pointe de l’aiguille juste au-dessus de la surface de la plaque de broyage à l’aide d’un bouton de commande grossier placé sous le microscope (Figure 1C). REMARQUE : Les aiguilles tirées obtenues dans la section 2 ont un cône de 6 à 8 mm et une pointe inférieure à 1 μm (Figure 1D), comme décrit dans le manuel d’utilisation de l’extracteur.</li>
	<li>Maintenez la pression intérieure de l’aiguille à 40 psi à l’aide de la pompe à air à pied. Ajustez la position de la pointe de l’aiguille à l’aide d’un bouton de commande fin sous le microscope et faites en sorte que la pointe de l’aiguille touche la plaque de broyage.</li>
	<li>Broyer pendant 3 à 5 s. Lorsque de minuscules bulles d’air sortent de la pointe de l’aiguille, déchargez l’aiguille (Figure 1E). REMARQUE : Dans le processus de broyage, l’utilisation d’une pompe à air empêche la solution de broyage de siphonner.</li>
	<li>Mettez les aiguilles à broyer dans un étui de rangement. REMARQUE : Utilisez autant que possible des aiguilles fraîchement moulues, bien que les aiguilles broyées puissent être conservées dans un étui de rangement pendant au moins quelques semaines avant la micro-injection.</li>
</ol>4. Préparation des pipettes pour le chargement des plasmides
<ol><li>Chauffer une pipette de 200 μL avec la flamme extérieure d’un brûleur à alcool.</li>
	<li>Une fois qu’elle commence à fondre, étirez la pipette.</li>
	<li>Coupez l’extrémité scellée de la pipette étirée avec des ciseaux, et la pipette étirée est alors prête à charger l’ADN dans une aiguille broyée. REMARQUE : Alternativement, des pointes extrêmement longues et fines pour remplir les aiguilles broyées sont disponibles dans le commerce.</li>
	<li>Placez ces pipettes dans une boîte en plastique autoclave.</li>
</ol>5. Prélèvement d’embryons
<ol><li>Prélever des mouches (vas-phiC31 ; + ; attP2) exprimant la phiC31 intégrase et portant le site d’amarrage de l’attP2 3 jours après leur éclosion à partir de 50 flacons et les transférer dans une cage (φ 90 mm x 150 mm). Ajouter un peu de pâte de levure fraîche au centre de chaque assiette de géloseau raisin 18.</li>
	<li>Préparez 2 à 4 cages de mouches. Gardez les cages et les plaques à 25 °C et changez les plaques tous les jours pendant 2 à 4 jours. REMARQUE : Cette étude a combiné le transgène vas-phiC31 (Stock # 36313, Bloomington Drosophila Stock Center) sur le premier chromosome et le transgène attP2 (Stock # 36313, Bloomington Drosophila Stock Center) sur le troisième chromosome. Le stock résultant (vas-phiC31 ; + ; attP2) est utilisé dans ce protocole. La pâte de levure doit être préparée quotidiennement et la pâte de levure fraîche doit être donnée aux mouches. Les cages remplacées doivent être nettoyées et séchées pour se débarrasser des embryons restants dans les cages.</li>
	<li>Le jour de la microinjection, changez les cages et les plaques le matin. Ensuite, changez les plaques toutes les 30 minutes et prélevez les embryons dans ces plaques. Changez toutes les cages et plaques à température ambiante (RT) et maintenez ensuite les cages et les plaques à 25 °C. REMARQUE : Certains protocoles préfèrent incuber les cages et les plaques à 18 °C pour la ponte. Cela dépend du nombre d’embryons dont on a besoin pour la micro-injection.</li>
</ol>6. Embryons déchorionnés
<ol><li>Préparez de l’eau de Javel à 30 % en mélangeant 60 ml d’eau de Javel (contenant du chlore actif de 34 à 46 g/L) et 140 ml d’eau distillée doublement.</li>
	<li>Retirez les mouches restantes sur les plaques de gélose au jus de raisin à l’aide d’une brosse ou d’une pince et rincez les embryons dans une passoire cellulaire avec de l’eau distillée deux fois.</li>
	<li>Séchez la passoire cellulaire contenant les embryons avec du papier de soie.</li>
	<li>Placez-le dans une boîte de Pétri contenant 30 % d’eau de Javel et faites tourner la passoire cellulaire à la main ou à l’aide d’un agitateur horizontal pendant 1,5 min à 60 tr/min. REMARQUE : Le rinçage est une étape critique. Si le temps de rinçage n’est pas assez long, la coquille d’un embryon ne se détachera pas complètement. Si le temps de rinçage est trop long, l’embryon deviendra mou et se cassera facilement. La passoire à cellules doit être complètement immergée dans l’eau de Javel à 30 %. Portez une paire de gants en caoutchouc et une blouse de laboratoire pour éviter les blessures causées par l’eau de Javel.</li>
	<li>Rincez les embryons pendant 2 minutes avec de l’eau distillée double stockée dans une bouteille de lavage en plastique de laboratoire pour éliminer l’eau de Javel résiduelle. Choisissez les embryons flottants pour la gamme.</li>
</ol>7. Aligner les embryons
<ol><li>Coupez l’agar au jus de raisin solide en longues lanières à l’aide d’une lame. REMARQUE : Utilisez du jus de raisin violet pour faciliter l’alignement des embryons blancs.</li>
	<li>Transférez les embryons sur une longue bande à l’aide d’un pinceau.</li>
	<li>Alignez environ 60 embryons avec une aiguille de dissection le long du bord d’une longue bande, les postérieurs tournés vers l’extérieur de la bande. Alignez environ 60 embryons en 5 minutes. REMARQUE : Le micropyle est une saillie en forme de cône au pôle antérieur de l’embryon, par laquelle le spermatozoïde entre pour féconder l’ovocyte (Figure 2A). Par conséquent, sur la base de la saillie en forme de cône au pôle antérieur de l’embryon, il est facile de déterminer la partie postérieure de l’embryon déchorionné.</li>
	<li>Placez un ruban adhésif double face de 18 mm dans le sens de la longueur le long du bord d’une lamelle (18 mm x 18 mm) et retirez le support papier. Appuyez doucement sur la lamelle sur les embryons alignés. Assurez-vous que les embryons sont collés au centre du ruban.</li>
</ol>8. Dessécher les embryons
<ol><li>Placez la lamelle avec les embryons alignés dans une boîte contenant du déshydratant. Le temps de séchage varie en fonction de la température et de l’humidité. REMARQUE : Le temps de séchage est critique pour la micro-injection et doit être déterminé expérimentalement. Le temps de séchage est généralement de 9 à 10 minutes en été et de 17 à 18 minutes en hiver.</li>
	<li>Couvrez les embryons d’huile d’halocarbure. REMARQUE : Ne laissez pas tomber trop d’huile sur les embryons, car l’huile supplémentaire pourrait déborder de l’adhésif. Le rapport volumique de l’huile d’halocarbure 700 et de l’huile d’halocarbure 27 est de 1:3.</li>
</ol>9. Micro-injection d’embryons
<ol><li>Chargez 2 μL d’ADN dans l’aiguille à l’aide de la pipette étirée. Assurez-vous qu’il n’y a pas de bulles dans l’aiguille. Placez l’aiguille dans le porte-aiguille du micromanipulateur.</li>
	<li>Placez les embryons alignés recouverts d’huile d’halocarbure sous un microscope inversé. Assurez-vous que les extrémités postérieures des embryons font face à l’aiguille.</li>
	<li>Utilisez le micromanipulateur pour approcher l’aiguille des embryons. Nettoyez l’aiguille. Assurez-vous qu’une goutte de liquide sortant de l’aiguille est visible. À partir d’une pression d’injection de 300 hPa et d’une pression d’équilibre de 20 hPa, ajustez la pression d’injection et la pression d’équilibre pour assurer la taille optimale de la goutte de liquide.</li>
	<li>À l’aide du micromanipulateur, insérez l’aiguille dans les extrémités postérieures des embryons et à l’aide de la pédale de commande reliée au microinjecteur pour injecter l’ADN (figure 2). Si un petit halo est visible, l’ADN est injecté avec succès dans l’embryon. REMARQUE : Sélectionnez les embryons multinucléés pour l’injection et tuez les embryons plus âgés à l’aide du bouton « nettoyer ». Si une grande quantité de cytoplasme fuit après l’injection, les embryons sont sous-secs. Si seule une petite quantité de cytoplasme ou aucune quantité ne s’échappe après l’injection, les injections sont considérées comme réussies. Si plus d’un tiers des embryons fuient du cytoplasme après l’injection, prolongez le temps de séchage de 1 à 2 minutes. Si plus d’un tiers des embryons sont trop secs, raccourcissez le temps de séchage de 1 à 2 minutes.</li>
	<li>Retirez l’aiguille de l’embryon. Déplacez l’aiguille vers l’extrémité postérieure de l’embryon suivant. Répétez les étapes ci-dessus.</li>
	<li>Mettez les embryons injectés dans une plaque de gélose. Placez l’assiette dans une pièce à 18-20 °C. Le lendemain, transférez la plaque dans un incubateur à une température de 25 °Cet une humidité de 50 à 60 %, et incubez pendant 1 jour. REMARQUE : Après l’injection, conservez les embryons à une température de 18-20 °C pour ralentir leur développement, faciliter l’intégration de l’ADN plasmidique dans le génome de la drosophile et augmenter le taux de survie des embryons injectés.</li>
</ol>10. Collecte des larves
<ol><li>Utilisez une aiguille de dissection pour gratter et détacher les aliments dans un flacon. Fournissez à la nourriture quelques gouttes d’eau distillée. REMARQUE : Laissez l’eau distillée être absorbée dans la nourriture pour éviter que les larves ne se noient.</li>
	<li>Sortez les plaques de l’incubateur.</li>
	<li>Prélevez les larves écloses à l’aide d’un pinceau sous un stéréomicroscope et transférez-les dans le flacon.</li>
	<li>Placez le flacon dans un incubateur à une température de 25 °Cet à une humidité de50 à 60 %.</li>
</ol>11. Obtenir des mouches transgéniques
<ol><li>Récupérez les mouches écloses après l’incubation du flacon à 25 °Cpendant 10 jours.</li>
	<li>Croisez une seule mouche mâle avec trois mouches femelles vierges des équilibreurs TM2/TM6C Sb1 Tb1 , et croisez une seule mouche femelle avec trois mouches mâles des équilibreurs TM2/TM6C Sb1 Tb1 .</li>
	<li>Placez les croix dans un incubateur à une température de 25 °C et à une humidité de 50 à 60 %.</li>
	<li>Filtrez la progéniture pour les mouches aux yeux orange. Il s’agit des mouches transgéniques (Figure 3A-C). REMARQUE : Les mouches portant une copie du transgène au site d’amarrage attP2 ont les yeux orange.</li>
	<li>Croisez une seule mouche mâle aux yeux orange avec trois mouches femelles vierges des équilibreurs TM2/TM6C Sb1 Tb1 pour établir un stock. REMARQUE : Plus d’une génération de croisements doit être mise en place afin de rayer le transgène phiC31 sur le premier chromosome.</li>
</ol>

phiC31 Transgénèse embryonnaire médiée par l’intégrase chez la drosophile

<ol>
	<li>Rubin, G. M., Spradling, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+transformation+of+Drosophila+with+transposable+element+vectors.">Genetic transformation of Drosophila with transposable element vectors.</a> Science. 218 (4570), 348-353 (1982).</li><li>Venken, K. J., Bellen, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenesis+upgrades+for+Drosophila+melanogaster.">Transgenesis upgrades for Drosophila melanogaster.</a> Development. 134 (20), 3571-3584 (2007).</li><li>Groth, A. C., Fish, M., Nusse, R., Calos, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+of+transgenic+Drosophila+by+using+the+site-specific+integrase+from+phage+phic31.">Construction of transgenic Drosophila by using the site-specific integrase from phage phic31.</a> Genetics. 166 (4), 1775-1782 (2004).</li><li>Bischof, J., Maeda, R. K., Hediger, M., Karch, F., Basler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimized+transgenesis+system+for+Drosophila+using+germ-line-specific+phic31+integrases.">An optimized transgenesis system for Drosophila using germ-line-specific phic31 integrases.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (9), 3312-3317 (2007).</li><li>Markstein, M., Pitsouli, C., Villalta, C., Celniker, S. E., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploiting+position+effects+and+the+gypsy+retrovirus+insulator+to+engineer+precisely+expressed+transgenes.">Exploiting position effects and the gypsy retrovirus insulator to engineer precisely expressed transgenes.</a> Nat Genet. 40 (4), 476-483 (2008).</li><li>Bateman, J. R., Lee, A. M., Wu, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specific+transformation+of+Drosophila+via+phic31+integrase-mediated+cassette+exchange.">Site-specific transformation of Drosophila via phic31 integrase-mediated cassette exchange.</a> Genetics. 173 (2), 769-777 (2006).</li><li>Venken, K. J., He, Y., Hoskins, R. A., Bellen, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=P[acman]:+A+BAC+transgenic+platform+for+targeted+insertion+of+large+DNA+fragments+in+D.+melanogaster.">P[acman]: A BAC transgenic platform for targeted insertion of large DNA fragments in D. melanogaster.</a> Science. 314 (5806), 1747-1751 (2006).</li><li>Szabad, J., Bellen, H. J., Venken, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+assay+to+detect+in+vivo+Y+chromosome+loss+in+Drosophila+wing+disc+cells.">An assay to detect in vivo Y chromosome loss in Drosophila wing disc cells.</a> G3. 2 (9), 1095-1102 (2012).</li><li>Ringrose, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenesis+in+Drosophila+melanogaster.">Transgenesis in Drosophila melanogaster.</a> Methods Mol Biol. 561, 3-19 (2009).</li><li>Van Der Graaf, K., Srivastav, S., Singh, P., Mcnew, J. A., Stern, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Drosophila+melanogaster+attp40+docking+site+and+derivatives+are+insertion+mutations+of+msp-300.">The Drosophila melanogaster attp40 docking site and derivatives are insertion mutations of msp-300.</a> PLoS One. 17 (12), e0278598 (2022).</li><li>Duan, Q., Estrella, R., Carson, A., Chen, Y., Volkan, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+Drosophila+attp40+background+on+the+glomerular+organization+of+or47b+olfactory+receptor+neurons.">The effect of Drosophila attp40 background on the glomerular organization of or47b olfactory receptor neurons.</a> G3. 13 (4), 022 (2023).</li><li>Dietzl, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genome-wide+transgenic+RNAi+library+for+conditional+gene+inactivation+in+Drosophila.">A genome-wide transgenic RNAi library for conditional gene inactivation in Drosophila.</a> Nature. 448 (7150), 151-156 (2007).</li><li>Pfeiffer, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tools+for+neuroanatomy+and+neurogenetics+in+Drosophila.">Tools for neuroanatomy and neurogenetics in Drosophila.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (28), 9715-9720 (2008).</li><li>Bellen, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Drosophila+gene+disruption+project:+Progress+using+transposons+with+distinctive+site+specificities.">The Drosophila gene disruption project: Progress using transposons with distinctive site specificities.</a> Genetics. 188 (3), 731-743 (2011).</li><li>Zirin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+transgenic+drosophila+resource+collections+for+loss-+and+gain-of-function+studies.">Large-scale transgenic drosophila resource collections for loss- and gain-of-function studies.</a> Genetics. 214 (4), 755-767 (2020).</li><li>Wei, P., Xue, W., Zhao, Y., Ning, G., Wang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-based+modular+assembly+of+a+UAS-cDNA/ORF+plasmid+library+for+more+than+5500+Drosophila+genes+conserved+in+humans.">CRISPR-based modular assembly of a UAS-cDNA/ORF plasmid library for more than 5500 Drosophila genes conserved in humans.</a> Genome Res. 30 (1), 95-106 (2020).</li><li>Fish, M. P., Groth, A. C., Calos, M. P., Nusse, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Creating+transgenic+Drosophila+by+microinjecting+the+site-specific+phic31+integrase+mRNA+and+a+transgene-containing+donor+plasmid.">Creating transgenic Drosophila by microinjecting the site-specific phic31 integrase mRNA and a transgene-containing donor plasmid.</a> Nat Protoc. 2 (10), 2325-2331 (2007).</li><li>Fujioka, M., Jaynes, J. B., Bejsovec, A., Weir, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+transgenic+Drosophila.">Production of transgenic Drosophila.</a> Methods Mol Biol. 136, 353-363 (2000).</li><li>Loncar, D., Singer, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+membrane+formation+during+the+cellularization+of+the+syncytial+blastoderm+of+Drosophila.">Cell membrane formation during the cellularization of the syncytial blastoderm of Drosophila.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (6), 2199-2203 (1995).</li><li>Carmo, C., Araujo, M., Oliveira, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microinjection+techniques+in+fly+embryos+to+study+the+function+and+dynamics+of+SMC+complexes.">Microinjection techniques in fly embryos to study the function and dynamics of SMC complexes.</a> Methods Mol Biol. 2004, 251-268 (2019).</li></ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Ici, nous présentons un protocole de micro-injection embryonnaire pour la transgenèse chez la drosophile. Pour la transgenèse spécifique du site médiée par phiC31, nous avons injecté 120 à 140 embryons pour chaque plasmide et obtenu au moins une lignée transgénique pour environ 85 % des plasmides (tableau supplémentaire 2). D’après notre expérience, l’ADN plasmidique isolé par un kit de mini-préparation plasmidique suffit pour la transgenèse chez la drosophile. Des c...

La mouche des fruits Drosophila melanogaster est extrêmement sensible à la manipulation génétique et à l’analyse génétique. Les mouches des fruits transgéniques sont largement utilisées dans la recherche biologique. Depuis son développement au début des années 1980, la transgenèse médiée par le transposon de l’élément P est indispensable à la recherche sur la drosophile 1. Dans certains scénarios, d’autres transposons, tels que piggyBac et Minos, ont également été utilisés pour la transgenèse chez la drosophile 2. Les transgènes via transposon sont insérés au hasard dans le génome de la drosophile, et les niveaux d’expression des transgènes à différents loci génomiques peuvent varier en raison des effets de position et ne peuvent donc pas être comparés2. Ces inconvénients ont été surmontés par la transgénèse spécifique au sitemédiée par phiC31 3. Le gène phiC31 du bactériophage code pour une intégrase qui médie la recombinaison spécifique de la séquence entre les sites attB et attP chez la drosophile3. De nombreux sites d’amarrage attP ont été caractérisés et sont disponibles dans le Bloomington Drosophila Stock Center 3,4,5,6,7,8,9.
Le système de transgenèse phiC31 pour la drosophile a été largement utilisé par la communauté des mouches. Parmi les sites d’amarrage attP, attP18 sur le chromosome X, attP40 sur le deuxième chromosome et attP2 sur le troisième chromosome sont généralement les sites privilégiés pour l’intégration des transgènes sur chaque chromosome, car les transgènes sur les trois sites présentent des niveaux élevés d’expression inductible tout en ayant de faibles niveaux d’expression basale5. Récemment, cependant, van der Graaf et ses collègues ont découvert que le site attP40, proche du locus du gène Msp300, et les transgènes intégrés à attP40 provoquent le regroupement nucléaire des muscles larvaires chez la drosophile10. Dans une autre étude récente, Duan et ses collègues ont découvert que le chromosome homozygote attP40 perturbe l’organisation glomérulaire normale de la classe de neurones récepteurs olfactifs Or47b chez la drosophile11. Ces résultats suggèrent que des contrôles rigoureux devraient être inclus lors de la conception des expériences et de l’interprétation des données.
La drosophile est un organisme modèle idéal pour l’interrogation in vivo de la fonction des gènes en raison de son cycle de vie court, de son faible coût et de sa facilité d’entretien. Le criblage génétique à l’échelle du génome repose sur la construction de banques transgéniques à l’échelle du génome chez la drosophile 12,13,14,15. Nous avons précédemment généré 5551 constructions UAS-ADNc/ORF basées sur le système binaire GAL4/séquence d’activation en amont (GAL4/UAS), couvrant 83% des gènes de la drosophile conservés chez l’homme dans la collection Gold16 du Drosophila Genomics Resource Center (DGRC). Les plasmides UAS-ADNc/ORF peuvent être utilisés pour la création d’une banque transgénique UAS-ADNc/ORF chez la drosophile. Une technologie efficace de micro-injection d’embryons peut accélérer la création de banques de mouches transgéniques.
Pour la microinjection d’embryons, la pointe de l’aiguille est normalement cassée contre une lamelle17. Ainsi, les aiguilles se bouchent fréquemment ou provoquent des fuites de grandes quantités de cytoplasme, et lorsque ces problèmes surviennent, de nouvelles aiguilles doivent être utilisées. Bien que les aiguilles biseautées puissent améliorer l’efficacité de la microinjection, la solution de broyage pénètre dans la pointe biseautée pendant le processus de broyage. La solution de broyage dans la pointe biseautée ne s’évapore pas rapidement naturellement ; Par conséquent, les aiguilles ne peuvent pas être utilisées pour la micro-injection directement après le biseautage. Ces facteurs réduisent l’efficacité des procédures de micro-injection d’embryons. Ici, en utilisant la transgenèse spécifique du site médiée par phiC31 chez la drosophile comme exemple, nous présentons un protocole de micro-injection embryonnaire pour la transgenèse chez la drosophile. Pour empêcher la solution de broyage de pénétrer dans l’aiguille, nous utilisons une pompe à air pour exercer une pression d’air à l’intérieur de l’aiguille, empêchant ainsi la solution de broyage de pénétrer dans la pointe biseautée. Les aiguilles biseautées sont prêtes pour le chargement de l’échantillon et la micro-injection directement après le biseautage.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>100 &#956;m Cell Strainer</td>
			<td>NEST</td>
			<td>258367</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3M double-sided adhesive</td>
			<td>3M</td>
			<td>415</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate glass</td>
			<td>SUTTER</td>
			<td>B100-75-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diamond abrasive plate</td>
			<td>SUTTER</td>
			<td>104E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FLAMING/BROWN Micropipette Puller</td>
			<td>SUTTER</td>
			<td>P-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foot air pump with pressure gauge</td>
			<td>Shenfeng</td>
			<td>SF8705D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halocarbon oil 27</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H8773</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halocarbon oil 700</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H8898</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>ECLIPSE Ts2R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microinjection pump</td>
			<td>eppendorf</td>
			<td>FemtoJet 4i</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>eppendorf</td>
			<td>TransferMan 4r</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette Beveler</td>
			<td>SUTTER</td>
			<td>BV-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope cover glasses (18 mm x 18 mm)</td>
			<td>CITOLAS</td>
			<td>10211818C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides (25 mm x 75 mm)</td>
			<td>CITOLAS</td>
			<td>188105W</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish (90 mm x 15 mm)</td>
			<td>LAIBOER</td>
			<td>4190152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photo-Flo 200</td>
			<td>Kodak</td>
			<td>1026269</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAprep Spin Miniprep Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>27106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ745</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

embryo microinjection for transgenesis in drosophila

La transgenèse chez la drosophile est une approche essentielle pour étudier la fonction des gènes au niveau de l’organisme. La micro-injection d’embryons est une étape cruciale pour la construction des mouches transgéniques. La micro-injection nécessite certains types d’équipement, notamment un micro-injecteur, un micromanipulateur, un microscope inversé et un stéréomicroscope. Les plasmides isolés à l’aide d’un kit de miniprep plasmidique sont qualifiés pour la micro-injection. Les embryons au stade pré-blastoderme ou blastoderme syncytial, où les noyaux partagent un cytoplasme commun, sont soumis à une micro-injection. Une passoire cellulaire facilite le processus de déchâtionnement des embryons. Le moment optimal pour la déchorionisation et la dessiccation des embryons doit être déterminé expérimentalement. Pour augmenter l’efficacité de la micro-injection d’embryons, les aiguilles préparées par un extracteur doivent être biseautées par un broyeur d’aiguilles. Dans le processus de broyage des aiguilles, nous utilisons une pompe à air à pied avec un manomètre pour éviter l’effet capillaire de la pointe de l’aiguille. Nous injectons régulièrement 120 à 140 embryons pour chaque plasmide et obtenons au moins une lignée transgénique pour environ 85 % des plasmides. Cet article prend l’exemple de la transgenèse médiée par l’intégrase phiC31 chez la drosophile et présente un protocole détaillé pour la micro-injection embryonnaire pour la transgenèse chez la drosophile.

The fruit fly Drosophila melanogaster is extremely amenable to genetic manipulation and genetic analysis. Transgenic fruit flies are widely used in biological research. Since it was developed in the early 1980s, P-element transposon-mediated transgenesis has been indispensable for Drosophila research1. In some scenarios, other transposons, such as piggyBac and Minos have been used for transgenesis in Drosophila as well2. Transgenes via transposon are randomly inserted into the Drosophila genome, and the expression levels of transgenes at different genomic loci may vary due to position effects and thereby can not be compared2. These drawbacks were overcome by the phiC31-mediated site-specific transgenesis3. The bacteriophage&#160;phiC31 gene encodes an integrase that mediates sequence-specific recombination between the attB and attP sites in Drosophila3. Many attP docking sites have been characterized and are available in the Bloomington Drosophila Stock Center3,4,5,6,7,8,9.
The phiC31 transgenesis system for Drosophila has been widely used by the fly community. Among the attP docking sites, attP18 on the X chromosome, attP40 on the second chromosome, and attP2 on the third chromosome are usually the preferred sites for transgene integration on each chromosome because transgenes at the three sites show high levels of inducible expression while having low levels of basal expression5. Recently, however, van der Graaf and colleagues found that the attP40 site, close to the Msp300 gene locus, and transgenes integrated at attP40 cause larval muscle nuclear clustering in Drosophila10. In another recent study, Duan and colleagues found that the homozygous attP40 chromosome disrupts the normal glomerular organization of the Or47b olfactory receptor neuron class in Drosophila11. These findings suggest that rigorous controls should be included when designing experiments and interpreting data.
Drosophila is an ideal model organism for in vivo interrogation of gene function due to its short life cycle, low cost, and easy maintenance. Genome-wide genetic screening relies on the construction of genome-wide transgenic libraries in Drosophila12,13,14,15. We previously generated 5551 UAS-cDNA/ORF constructs based on the binary GAL4/upstream activating sequence (GAL4/UAS) system, covering 83% of the Drosophila genes conserved in humans in the Drosophila Genomics Resource Center (DGRC) Gold Collection16. The UAS-cDNA/ORF plasmids can be used for the creation of a transgenic UAS-cDNA/ORF library in Drosophila. Efficient embryo microinjection technology can accelerate the creation of transgenic fly libraries.
For embryo microinjection, the needle tip is normally broken against a coverslip17. Thereby, needles frequently become clogged or cause leakage of large amounts of cytoplasm, and when these issues arise, new needles must be employed. Although beveling needles can enhance microinjection efficiency, the grinding solution enters the beveled tip during the grinding process. The grinding solution in the beveled tip does not quickly evaporate naturally; therefore, needles can not be utilized for microinjection directly after beveling. These factors reduce the efficiency of embryo microinjection procedures. Here, using the phiC31-mediated site-specific transgenesis in Drosophila as an example, we present a protocol for embryo microinjection for transgenesis in Drosophila.&#160;To prevent the grinding solution from entering the needle, we utilize an air pump to exert air pressure within the needle, thereby preventing the grinding solution from entering the beveled tip. Beveled needles are ready for sample loading and microinjection directly after beveling.

Pleins feux sur l’auteur : Optimisation de la micro-injection embryonnaire pour la transgenèse chez la drosophile

Microinjection embryonnaire pour la transgenèse chez la drosophile

La pointe d’une aiguille d’injection est biseautée par une meuleuse à aiguilles (Figure 1). On peut biseauter 50 à 60 aiguilles en une heure. L’ADN est micro-injecté dans la partie postérieure d’un embryon au stade pré-blastoderme ou blastoderme syncytial, où les noyaux partagent un cytoplasme commun (Figure 2A). La partie postérieure d’un embryon peut être facilement localisée grâce au micropyle situé à l’avant de l’embryon (<strong c...

Cet article prend l’exemple de la transgenèse médiée par l’intégrase phiC31 chez la drosophile et présente un protocole optimisé pour la micro-injection embryonnaire, une étape cruciale pour la création de mouches transgéniques.

Transgenesis in Drosophila is an essential approach to studying gene function at the organism level. Embryo microinjection is a crucial step for the ...

La transgenèse chez la drosophile est essentielle pour étudier la fonction des gènes au niveau de l’organisme. La micro-injection d’embryons est une étape cruciale pour la construction des mouches transgéniques. Ici, nous prenons l’exemple de la transgenèse médiée par l’intégrase phiC31 chez la drosophile et présentons un protocole détaillé pour la micro-injection d’embryons pour la transgenèse chez la drosophile.Les aiguilles d’injection dont les pointes sont biseautées par un broyeur ne se bloquent généralement pas et ne provoquent pas de fuites cytoplasmiques importantes. Cependant, la solution de broyage peut pénétrer dans la pointe biseautée d’une aiguille pendant le processus de broyage et la solution de broyage à l’intérieur de la pointe ne sèche pas naturellement et rapidement. Notre protocole utilise une pompe à air à pied avec un manomètre pour appliquer une pression d’air à une aiguille tout en meulant sa pointe.Cela empêche la solution de broyage de siphonner, ce qui empêche la solution de broyage de pénétrer dans la pointe biseautée, ce qui permet d’utiliser immédiatement l’aiguille biseautée.

embryo-microinjection-for-transgenesis-in-drosophila

Research

JoVE Journal

Genetics

Embryo Microinjection for Transgenesis in Drosophila

1.2K vues.  University of South China. La transgenèse chez la drosophile est essentielle pour étudier la fonction des gènes au niveau de l’organisme. La micro-injection d’embryons est une étape cruciale pour la construction des mouches transgéniques. Ici, nous prenons l’exemple de la transgenèse médiée par l’intégrase phiC31 chez la drosophile et présentons un protocole détaillé pour la micro-injection d’embryons pour la transgenèse chez la drosophile.Les aiguilles d’injection dont les pointes sont ...

Vidéo: Pleins feux sur l’auteur : Optimisation de la micro-injection embryonnaire pour la transgenèse chez la drosophile

Transgenesis in Drosophila is an essential approach to studying gene function at the organism level. Embryo microinjection is a crucial step for the construction of transgenic flies. Microinjection requires some types of equipment, including a microinjector, a micromanipulator, an inverted microscope, and a stereo microscope.&#160;Plasmids isolated with a plasmid miniprep kit are qualified for microinjection. Embryos at the pre-blastoderm or syncytial blastoderm stage, where nuclei share a common cytoplasm, are subjected to microinjection. A cell strainer eases the process of dechorionating embryos. The optimal time for dechorionation and desiccation of embryos needs to be determined experimentally. To increase the efficiency of embryo microinjection, needles prepared by a puller need to be beveled by a needle grinder. In the process of grinding needles, we utilize a foot air pump with a pressure gauge to avoid the capillary effect of the needle tip. We routinely inject 120-140 embryos for each plasmid and obtain at least one transgenic line for around 85% of plasmids. This article takes the phiC31 integrase-mediated transgenesis in Drosophila as an example and&#160;presents a detailed protocol for embryo microinjection for transgenesis in Drosophila.

This article takes the phiC31 integrase-mediated transgenesis in Drosophila as an example and presents an optimized protocol for embryo microinjection,&#160;a crucial step for creating transgenic flies.