وهذا البروتوكول هام لأنه يوفر طريقة محددة للهندسة الدقيقة لأنوفيليس غامبيا، التي كان من الصعب تاريخيا تحويلها باستخدام تقنيات الهندسة الوراثية الشائعة. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه يخلق موثوق أنوفيليس غامبيا المعدلة وراثيا. وتمتد تطبيقات هذه التقنية نحو استراتيجيات جديدة للقضاء على الملاريا من خلال تسهيل إنشاء البعوض المناسب لقمع السكان أو تعديل مجموعات الأنوفيليس الغامبية البرية.
ويمكن تكييف هذه المنهجية بسهولة مع أنواع البعوض المختلفة. تكنولوجيا الميكروبيكت لدينا تأخذ الصبر والممارسة. هناك منحنى التعلم.
للبدء، استخدم الطامح لوضع 20 إلى 30 أنثى في أنبوب مخروطي شفاف 50 ملليلتر. تأكد من قطع الأنبوب مفتوحا في كلا الطرفين وتغطيته بفيلم أسنان اللاتكس في أحد الطرفين وشبكة نايلون وورق تصفية في الطرف الآخر ، حيث سيضع البعوض بيضه. ضع الأنبوب المملوء بالبعوض في طبق بيتري صغير مليء بالماء المقطر المزدوج ، ثم ضع الأنبوب والطبق في حاضنة عند 28 درجة مئوية لمدة 45 دقيقة.
قم بإزالة الأنبوب من الحاضنة وأدخل الأنبوب في قفص فارغ. اضغط بلطف على الأنبوب للسماح للبعوض بالطيران. إزالة الأنبوب من القفص مرة واحدة وقد طار كل البعوض.
عندما يكون الأنبوب خاليا من البعوض ، فك الحلقة السفلية ، وإزالة النايلون ، واستخدام ملقط لإزالة ورق التصفية بعناية مع البيض من الأنبوب. ضع ورقة التصفية المحملة بالبيض في طبق بيتري بلاستيكي يحتوي على طبقة من ورق التصفية المرطب بالماء. وضع غشاء على شريحة زجاجية نظيفة واستخدام ملقط نظيف لتغطية الغشاء بقطعة من ورق التصفية ، وترك حوالي ملليمتر واحد من مرشح الغشاء غير مكشوف.
قم بتبلل ورق الفلتر بالماء المتأين، ثم استخدم الفرشاة لنقل 30 إلى 50 جنينا برفق إلى حافة الغشاء ومحاذاة البويضات عموديا على طول الغشاء. توجيه البيض في نفس الاتجاه بحيث عندما لوحظ البيض تحت المجهر microinjection، والنهاية الخلفية في موقف أسفل ويشكل زاوية من 15 درجة مع الإبرة. خط حافة كامل من الغشاء مع البيض.
استخدام طرف microloader لملء الإبر مع اثنين من microliters من خليط الحمض النووي. أدخل الإبرة في حامل الإبرة وربط أنابيب مضخة الضغط الآلي. محاذاة الإبرة بحيث يجعل زاوية 15 درجة مع الطائرة الشريحة.
افتح طرف الإبرة عن طريق لمس البيضة الأولى بعناية، ثم أدخل طرف الإبرة إلى حوالي 10 ميكرومترات في القطب الخلفي. حقنة ناجحة سوف تؤدي إلى حركة صغيرة من السيتوبلازم داخل البيض. استخدم عناصر التحكم في المرحلة المحورية للمجهر للانتقال إلى البيضة التالية لمواصلة الحقن.
لضمان بقاء طرف الإبرة مفتوحا وعدم انسداده، اضغط على زر الحقن قبل إدخال جنين آخر واتصور القطيرات الصغيرة عند فتح الإبرة. إذا تم انسداد الإبرة، فاضغط على الزر مسح لمسح الإبرة وكرر اختبار التصور القطير. ضبط الضغط حسب الحاجة إذا فتح طرف إبرة يحصل أكبر قليلا لضمان أن حجم قطرة يبقى صغيرا.
حقن حوالي 40 إلى 50 بيضة بإبرة واحدة. بعد اكتمال الحقن، اشطف البيض في وعاء زجاجي مبطن بورق فلتر ومليء ب 50 ملليلتر من الماء المنزوع الأيونات. وباستخدام هذا البروتوكول، أدخل نظام مستقل للجينات في الخط الجرثومي لسلالة مختبرية من نوع G3 من أنوفيليس غامبيا.
تم تصميم النظام لاستهداف تقويم العظام الكاردينال، أو Agcd، على الكروموسوم الثالث في هذا النوع. يظهر pCO37 البلازميد. أنه يحتوي على المكورات العقدية pyogenes Cas9 الاندوكليس تحت السيطرة على العناصر التنظيمية لتقويم العظام الجينات نانوس.
بالإضافة إلى ذلك، لديها دليل الجيش الملكي النيبالي تحت سيطرة مروج الجينات U6 وكاسيت علامة CFP 3XP3 المهيمنة التي تعبر عن بروتين الفلورسنت السماوي. وتحققت النهج الجزيئية من الإدراج الدقيق لحوالي 10 كيلوغرامات من الحمض النووي، الذي تم تعيينه باسم AgNosCd-1. وأظهرت تحليلات المتابعة المستفيضة أن AgNosCd-1 كان عالي الكفاءة في القيادة، وأنشأ عددا قليلا من الأليل المقاومة، ولم يكن لديه حمل وراثي كبير بسبب تكامل نظام محرك الجينات والتعبير عنه.
كان الدافع الجيني الهوموزيغيوس الذي يحتوي على البعوض طفرات فقدان الوظيفة ، مع وجود اليرقات والجراء والبالغين الناشئين حديثا من النمط الظاهري للعين الحمراء. عند محاولة هذا البروتوكول، حفظ في 88 أمر بالغ الأهمية لتفقيس جيدة لضوء البيض الرمادي وتجنب البيض الأبيض.
