Il lavoro è stato sostenuto dal Fondo per la ricerca scientifica per talenti di alto livello, Università della Cina meridionale.

1. Preparazione di plasmidi
<ol><li>Isolare i plasmidi da 4 mL di colture batteriche durante la notte utilizzando un kit di miniprep plasmidico. Eluire con 40 μl di tampone di eluizione. NOTA: L'isolamento dei plasmidi utilizzando un kit di preparazione al plasmide midi-prep non è necessario. Un kit di miniprep plasmidico può soddisfare pienamente i requisiti sperimentali per la microiniezione di embrioni. In questo protocollo, i plasmidi UAS-cDNA/ORF preparati contengono dieci copie di UAS, un promotore minimo Hsp70, un sito attB, un gene mini-bianco e un gene di interesse.</li>
	<li>Determinare la concentrazione di DNA plasmidico utilizzando uno spettrofotometro e conservarlo in congelatore a -80 °C. NOTA: La concentrazione di plasmidi non è fondamentale per il successo della microiniezione di embrioni, poiché le concentrazioni di plasmidi che vanno da 20 ng/μL a 1683 ng/μL funzionano bene per la transgenesi in Drosophila (Tabella supplementare 1).</li>
	<li>Poco prima della microiniezione, scongelare i plasmidi e centrifugare a 13000 x g per 5 minuti.</li>
	<li>Trasferire 10 μl di ciascun plasmide dallo strato superiore del liquido in una nuova provetta da 1,5 mL.</li>
</ol>2. Tirare gli aghi
<ol><li>Accendere un estrattore dell'ago con le impostazioni selezionate (Calore: 500, Trazione: 50, Vel: 60, Ritardo: 90, Pressione: 200, Test di rampa: 510).</li>
	<li>Inserire un capillare in vetro borosilicato (diametro esterno 1,0 mm, diametro interno 0,75 mm, lunghezza 10 cm) nell'estrattore dell'ago e chiudere il coperchio.</li>
	<li>Premere il pulsante Pull . Ogni capillare di vetro forma due aghi.</li>
</ol>3. Aghi abrasivi (Figura 1)
<ol><li>Utilizzare una smerigliatrice ad aghi montata con una piastra abrasiva appropriata (per punte di dimensioni 0,7-2,0 μm) di una smerigliatrice ad ago.</li>
	<li>Inumidire il panno (filo di riferimento) con una soluzione di macinazione (100 ml di acqua distillata con 0,9 g di NaCl, 1 ml di agente umettante) e fissare il panno.</li>
	<li>Accendere la smerigliatrice ad aghi e mantenere la piastra di macinazione in rotazione.</li>
	<li>Collegare un ago a una pompa dell'aria a pedale con un manometro tramite un tubo capillare in silicone, quindi montare l'ago su un supporto per aghi della smerigliatrice per aghi. Regolare l'angolo dell'ago rispetto alla piastra di macinazione a 35° (Figura 1A, B).</li>
	<li>Regolare la posizione della punta dell'ago appena sopra la superficie della piastra di macinazione utilizzando una manopola di controllo grossolana sotto il microscopio (Figura 1C). NOTA: Gli aghi tirati ottenuti nella sezione 2 hanno una conicità di 6-8 mm e una punta inferiore a 1 μm (Figura 1D), come descritto nel manuale d'uso dell'estrattore.</li>
	<li>Mantenere la pressione interna dell'ago a 40 psi utilizzando la pompa dell'aria a pedale. Regolare la posizione della punta dell'ago utilizzando una manopola di controllo fine sotto il microscopio e fare in modo che la punta dell'ago tocchi la piastra di macinazione.</li>
	<li>Macinare per 3-5 s. Quando minuscole bolle d'aria fuoriescono dalla punta dell'ago, scaricare l'ago (Figura 1E). NOTA: Durante il processo di macinazione, l'utilizzo di una pompa ad aria impedisce il sifonamento della soluzione di macinazione.</li>
	<li>Metti gli aghi macinati in una custodia. NOTA: Utilizzare il più possibile aghi appena macinati, anche se gli aghi macinati possono essere conservati in una custodia per almeno alcune settimane prima della microiniezione.</li>
</ol>4. Preparazione delle pipette per il caricamento dei plasmidi
<ol><li>Scaldare una pipetta da 200 μl con la fiamma esterna di un bruciatore ad alcool.</li>
	<li>Una volta che inizia a sciogliersi, allungare la pipetta.</li>
	<li>Tagliare l'estremità sigillata della pipetta allungata con le forbici e la pipetta allungata è quindi pronta per caricare il DNA in un ago rettificato. NOTA: In alternativa, sono disponibili in commercio punte estremamente lunghe e sottili per il riempimento degli aghi rettificati.</li>
	<li>Collocare queste pipette in una scatola di plastica autoclavata.</li>
</ol>5. Raccolta di embrioni
<ol><li>Raccogliere i moscerini (vas-phiC31; + ; attP2) che esprimono l'integrasi phiC31 e che recano il sito di aggancio attP2 da 50 fiale 3 giorni dopo la schiusa e trasferirli in una gabbia (φ 90 mm x 150 mm). Aggiungere un po' di pasta di lievito fresco al centro di ogni piastra di agar d'uva18.</li>
	<li>Prepara 2-4 gabbie di mosche. Mantenere le gabbie e le piastre a 25 °C e cambiare le piastre ogni giorno per 2-4 giorni. NOTA: Questo studio ha combinato il transgene vas-phiC31 (Stock # 36313, Bloomington Drosophila Stock Center) sul primo cromosoma e il transgene attP2 (Stock # 36313, Bloomington Drosophila Stock Center) sul terzo cromosoma. Il materiale risultante (vas-phiC31; + ; attP2) viene utilizzato in questo protocollo. La pasta di lievito deve essere preparata quotidianamente e la pasta di lievito fresca deve essere somministrata alle mosche. Le gabbie sostituite devono essere ripulite e asciugate per eliminare gli embrioni rimanenti nelle gabbie.</li>
	<li>Il giorno della microiniezione, cambiare le gabbie e le piastre al mattino. Quindi, cambia le piastre ogni 30 minuti e raccogli gli embrioni da queste piastre. Sostituire tutte le gabbie e le piastre a temperatura ambiente (RT) e successivamente mantenere le gabbie e le piastre a 25 °C. NOTA: Alcuni protocolli preferiscono incubare le gabbie e le piastre a 18 °C per la deposizione delle uova. Dipende dal numero di embrioni di cui si ha bisogno per la microiniezione.</li>
</ol>6. Dechorionare gli embrioni
<ol><li>Preparare il 30% di candeggina mescolando 60 ml di candeggina (contenente un contenuto di cloro attivo di 34-46 g/L) e 140 ml di acqua distillata doppia.</li>
	<li>Rimuovere le mosche rimanenti sulle piastre di agar al succo d'uva con un pennello o una pinza e sciacquare gli embrioni in un colino cellulare con acqua distillata doppia.</li>
	<li>Asciugare il colino cellulare contenente gli embrioni con carta velina.</li>
	<li>Metterlo in una capsula di Petri contenente il 30% di candeggina e agitare il colino cellulare a mano o con uno shaker orizzontale per 1,5 minuti a 60 giri/min. NOTA: Il risciacquo è una fase fondamentale. Se il tempo di risciacquo non è abbastanza lungo, il guscio di un embrione non si staccherà completamente. Se il tempo di risciacquo è troppo lungo, l'embrione diventerà morbido e si romperà facilmente. Il filtro cellulare deve essere completamente immerso nel candeggina al 30%. Indossa un paio di guanti di gomma e un camice da laboratorio per evitare lesioni causate dalla candeggina.</li>
	<li>Sciacquare gli embrioni per 2 minuti con acqua distillata doppia conservata in un flacone di plastica da laboratorio per rimuovere la candeggina residua. Scegli gli embrioni galleggianti per la line-up.</li>
</ol>7. Allineare gli embrioni
<ol><li>Tagliare l'agar di succo d'uva solido a strisce lunghe usando una lama. NOTA: Usa il succo d'uva viola per facilitare l'allineamento degli embrioni bianchi.</li>
	<li>Trasferisci gli embrioni su una lunga striscia usando un pennello.</li>
	<li>Allinea circa 60 embrioni con un ago da dissezione lungo il bordo di una lunga striscia con la parte posteriore rivolta verso l'esterno della striscia. Allinea circa 60 embrioni entro 5 minuti. NOTA: Il micropilo è una sporgenza a forma di cono al polo anteriore dell'embrione, attraverso la quale lo spermatozoo entra per fecondare l'ovocita (Figura 2A). Pertanto, in base alla sporgenza a forma di cono al polo anteriore dell'embrione, è facile determinare la parte posteriore dell'embrione dechorionato.</li>
	<li>Posizionare un nastro biadesivo da 18 mm nel senso della lunghezza lungo il bordo di un vetrino coprioggetti (18 mm x 18 mm) e rimuovere il supporto di carta. Premere delicatamente il vetrino coprioggetti sugli embrioni allineati. Assicurati che gli embrioni siano incollati al centro del nastro.</li>
</ol>8. Essiccazione degli embrioni
<ol><li>Metti il vetrino coprioggetti con gli embrioni allineati in una scatola contenente essiccante. Il tempo di asciugatura varia a seconda della temperatura e dell'umidità. NOTA: Il tempo di asciugatura è fondamentale per la microiniezione e deve essere determinato sperimentalmente. Il tempo di asciugatura è solitamente di 9-10 minuti in estate e di 17-18 minuti in inverno.</li>
	<li>Coprire gli embrioni con olio di alocarburi. NOTA: Non far cadere troppo olio sugli embrioni, poiché l'olio in eccesso potrebbe far traboccare l'adesivo. Il rapporto in volume dell'olio alocarbonico 700 e dell'olio alocarbonico 27 è 1:3.</li>
</ol>9. Microiniezione di embrioni
<ol><li>Caricare 2 μL di DNA nell'ago utilizzando la pipetta allungata. Assicurarsi che non ci siano bolle nell'ago. Posizionare l'ago nel supporto dell'ago del micromanipolatore.</li>
	<li>Posizionare gli embrioni allineati ricoperti di olio di alocarburi al microscopio invertito. Assicurati che le estremità posteriori degli embrioni siano rivolte verso l'ago.</li>
	<li>Usa il micromanipolatore per avvicinare l'ago agli embrioni. Elimina l'ago. Assicurarsi che sia visibile una goccia di liquido che fuoriesce dall'ago. A partire da una pressione di iniezione di 300 hPa e una pressione di equilibrio di 20 hPa, regolare la pressione di iniezione e la pressione di equilibrio per garantire la dimensione ottimale della goccia di liquido.</li>
	<li>Utilizzare il micromanipolatore per inserire l'ago nelle estremità posteriori degli embrioni e utilizzare il comando a pedale collegato al microiniettore per iniettare il DNA (Figura 2). Se è visibile un piccolo alone, il DNA viene iniettato con successo nell'embrione. NOTA: Seleziona gli embrioni multinucleati per l'iniezione e uccidi gli embrioni più vecchi utilizzando il pulsante "pulisci". Se una grande quantità di citoplasma fuoriesce dopo l'iniezione, gli embrioni sono poco essiccati. Se dopo l'iniezione fuoriesce solo una piccola quantità o nessuna quantità di citoplasma, le iniezioni sono considerate riuscite. Se più di un terzo degli embrioni perde citoplasma dopo l'iniezione, prolungare il tempo di asciugatura di 1-2 minuti. Se più di un terzo degli embrioni è troppo essiccato, accorciare il tempo di asciugatura di 1-2 minuti.</li>
	<li>Rimuovere l'ago dall'embrione. Sposta l'ago all'estremità posteriore dell'embrione successivo. Ripeti i passaggi precedenti.</li>
	<li>Metti gli embrioni iniettati in una piastra di agar. Posizionare la piastra in una stanza a 18-20 °C. Il giorno successivo, trasferire la piastra in un'incubatrice a una temperatura di 25 °Ce un'umidità del 50%-60% e incubare per 1 giorno. NOTA: Dopo l'iniezione, mantenere gli embrioni a una temperatura di 18-20 °C per rallentarne lo sviluppo, facilitare l'integrazione del DNA plasmidico nel genoma di Drosophila e aumentare il tasso di sopravvivenza degli embrioni iniettati.</li>
</ol>10. Raccolta delle larve
<ol><li>Usa un ago da dissezione per raschiare e allentare il cibo in una fiala. Fornire al cibo alcune gocce di acqua distillata. NOTA: Lasciare che l'acqua distillata venga assorbita nel cibo per evitare che le larve anneghino.</li>
	<li>Estrarre le piastre dall'incubatrice.</li>
	<li>Raccogli le larve schiuse con un pennello sotto uno stereomicroscopio e trasferiscile nella fiala.</li>
	<li>Mettere il flaconcino in un'incubatrice a una temperatura di 25 °Ce un'umidità del50%-60%.</li>
</ol>11. Ottenere mosche transgeniche
<ol><li>Raccogliere le mosche schiuse dopo che la fiala è stata incubata a 25 °Cper 10 giorni.</li>
	<li>Incrocia una singola mosca maschio con tre mosche femmine vergini dei bilanciatori TM2/TM6C Sb1 Tb1 e incrocia una singola mosca femmina con tre mosche maschi dei bilanciatori TM2/TM6C Sb1 Tb1 .</li>
	<li>Mettere le croci in un'incubatrice a una temperatura di 25 °C e un'umidità del 50%-60%.</li>
	<li>Esamina la progenie alla ricerca di mosche con gli occhi arancioni. Queste sono le mosche transgeniche (Figura 3A-C). NOTA: I moscerini che portano una copia del transgene nel sito di attracco attP2 hanno gli occhi arancioni.</li>
	<li>Incrocia una singola mosca maschio dagli occhi arancioni con tre mosche femmine vergini dei bilanciatori TM2/TM6C Sb1 Tb1 per stabilire uno stock. NOTA: È necessario impostare più di una generazione di incroci per incrociare il transgene phiC31 sul primo cromosoma.</li>
</ol>

phiC31 Transgenesi embrionale mediata dall'integrasi in Drosophila

<ol>
	<li>Rubin, G. M., Spradling, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+transformation+of+Drosophila+with+transposable+element+vectors.">Genetic transformation of Drosophila with transposable element vectors.</a> Science. 218 (4570), 348-353 (1982).</li><li>Venken, K. J., Bellen, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenesis+upgrades+for+Drosophila+melanogaster.">Transgenesis upgrades for Drosophila melanogaster.</a> Development. 134 (20), 3571-3584 (2007).</li><li>Groth, A. C., Fish, M., Nusse, R., Calos, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+of+transgenic+Drosophila+by+using+the+site-specific+integrase+from+phage+phic31.">Construction of transgenic Drosophila by using the site-specific integrase from phage phic31.</a> Genetics. 166 (4), 1775-1782 (2004).</li><li>Bischof, J., Maeda, R. K., Hediger, M., Karch, F., Basler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimized+transgenesis+system+for+Drosophila+using+germ-line-specific+phic31+integrases.">An optimized transgenesis system for Drosophila using germ-line-specific phic31 integrases.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (9), 3312-3317 (2007).</li><li>Markstein, M., Pitsouli, C., Villalta, C., Celniker, S. E., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploiting+position+effects+and+the+gypsy+retrovirus+insulator+to+engineer+precisely+expressed+transgenes.">Exploiting position effects and the gypsy retrovirus insulator to engineer precisely expressed transgenes.</a> Nat Genet. 40 (4), 476-483 (2008).</li><li>Bateman, J. R., Lee, A. M., Wu, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specific+transformation+of+Drosophila+via+phic31+integrase-mediated+cassette+exchange.">Site-specific transformation of Drosophila via phic31 integrase-mediated cassette exchange.</a> Genetics. 173 (2), 769-777 (2006).</li><li>Venken, K. J., He, Y., Hoskins, R. A., Bellen, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=P[acman]:+A+BAC+transgenic+platform+for+targeted+insertion+of+large+DNA+fragments+in+D.+melanogaster.">P[acman]: A BAC transgenic platform for targeted insertion of large DNA fragments in D. melanogaster.</a> Science. 314 (5806), 1747-1751 (2006).</li><li>Szabad, J., Bellen, H. J., Venken, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+assay+to+detect+in+vivo+Y+chromosome+loss+in+Drosophila+wing+disc+cells.">An assay to detect in vivo Y chromosome loss in Drosophila wing disc cells.</a> G3. 2 (9), 1095-1102 (2012).</li><li>Ringrose, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenesis+in+Drosophila+melanogaster.">Transgenesis in Drosophila melanogaster.</a> Methods Mol Biol. 561, 3-19 (2009).</li><li>Van Der Graaf, K., Srivastav, S., Singh, P., Mcnew, J. A., Stern, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Drosophila+melanogaster+attp40+docking+site+and+derivatives+are+insertion+mutations+of+msp-300.">The Drosophila melanogaster attp40 docking site and derivatives are insertion mutations of msp-300.</a> PLoS One. 17 (12), e0278598 (2022).</li><li>Duan, Q., Estrella, R., Carson, A., Chen, Y., Volkan, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+Drosophila+attp40+background+on+the+glomerular+organization+of+or47b+olfactory+receptor+neurons.">The effect of Drosophila attp40 background on the glomerular organization of or47b olfactory receptor neurons.</a> G3. 13 (4), 022 (2023).</li><li>Dietzl, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genome-wide+transgenic+RNAi+library+for+conditional+gene+inactivation+in+Drosophila.">A genome-wide transgenic RNAi library for conditional gene inactivation in Drosophila.</a> Nature. 448 (7150), 151-156 (2007).</li><li>Pfeiffer, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tools+for+neuroanatomy+and+neurogenetics+in+Drosophila.">Tools for neuroanatomy and neurogenetics in Drosophila.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (28), 9715-9720 (2008).</li><li>Bellen, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Drosophila+gene+disruption+project:+Progress+using+transposons+with+distinctive+site+specificities.">The Drosophila gene disruption project: Progress using transposons with distinctive site specificities.</a> Genetics. 188 (3), 731-743 (2011).</li><li>Zirin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+transgenic+drosophila+resource+collections+for+loss-+and+gain-of-function+studies.">Large-scale transgenic drosophila resource collections for loss- and gain-of-function studies.</a> Genetics. 214 (4), 755-767 (2020).</li><li>Wei, P., Xue, W., Zhao, Y., Ning, G., Wang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-based+modular+assembly+of+a+UAS-cDNA/ORF+plasmid+library+for+more+than+5500+Drosophila+genes+conserved+in+humans.">CRISPR-based modular assembly of a UAS-cDNA/ORF plasmid library for more than 5500 Drosophila genes conserved in humans.</a> Genome Res. 30 (1), 95-106 (2020).</li><li>Fish, M. P., Groth, A. C., Calos, M. P., Nusse, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Creating+transgenic+Drosophila+by+microinjecting+the+site-specific+phic31+integrase+mRNA+and+a+transgene-containing+donor+plasmid.">Creating transgenic Drosophila by microinjecting the site-specific phic31 integrase mRNA and a transgene-containing donor plasmid.</a> Nat Protoc. 2 (10), 2325-2331 (2007).</li><li>Fujioka, M., Jaynes, J. B., Bejsovec, A., Weir, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+transgenic+Drosophila.">Production of transgenic Drosophila.</a> Methods Mol Biol. 136, 353-363 (2000).</li><li>Loncar, D., Singer, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+membrane+formation+during+the+cellularization+of+the+syncytial+blastoderm+of+Drosophila.">Cell membrane formation during the cellularization of the syncytial blastoderm of Drosophila.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (6), 2199-2203 (1995).</li><li>Carmo, C., Araujo, M., Oliveira, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microinjection+techniques+in+fly+embryos+to+study+the+function+and+dynamics+of+SMC+complexes.">Microinjection techniques in fly embryos to study the function and dynamics of SMC complexes.</a> Methods Mol Biol. 2004, 251-268 (2019).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Qui, presentiamo un protocollo per la microiniezione di embrioni per la transgenesi in Drosophila. Per la transgenesi sito-specifica mediata da phiC31, abbiamo iniettato 120-140 embrioni per ciascun plasmide e ottenuto almeno una linea transgenica per circa l'85% dei plasmidi (Tabella supplementare 2). Nella nostra esperienza, il DNA plasmidico isolato da un kit di miniprep plasmidico è sufficiente per la transgenesi in Drosophila. Concentrazioni di DNA plasmidico comprese tra 20 ng/μ...

Il moscerino della frutta Drosophila melanogaster è estremamente suscettibile di manipolazione genetica e analisi genetica. I moscerini della frutta transgenici sono ampiamente utilizzati nella ricerca biologica. Da quando è stata sviluppata nei primi anni '80, la transgenesi mediata da trasposoni di elementi P è stata indispensabile per laricerca sulla Drosophila. In alcuni scenari, altri trasposoni, come piggyBac e Minos sono stati utilizzati per la transgenesi in Drosophila 2. I transgeni tramite trasposone vengono inseriti casualmente nel genoma di Drosophila e i livelli di espressione dei transgeni in diversi loci genomici possono variare a causa degli effetti di posizione e quindi non possono essere confrontati2. Questi inconvenienti sono stati superati dalla transgenesi sito-specifica 3 mediata da phiC31. Il gene del batteriofago phiC31 codifica per un'integrasi che media la ricombinazione sequenza-specifica tra i siti attB e attP in Drosophila3. Molti siti di attracco attP sono stati caratterizzati e sono disponibili nel Bloomington Drosophila Stock Center 3,4,5,6,7,8,9.
Il sistema di transgenesi phiC31 per Drosophila è stato ampiamente utilizzato dalla comunità delle mosche. Tra i siti di aggancio di attP, attP18 sul cromosoma X, attP40 sul secondo cromosoma e attP2 sul terzo cromosoma sono solitamente i siti preferiti per l'integrazione del transgene su ciascun cromosoma perché i transgeni nei tre siti mostrano alti livelli di espressione inducibile pur avendo bassi livelli di espressione basale5. Recentemente, tuttavia, van der Graaf e colleghi hanno scoperto che il sito attP40, vicino al locus del gene Msp300, e i transgeni integrati in attP40 causano il raggruppamento nucleare del muscolo larvale in Drosophila10. In un altro studio recente, Duan e colleghi hanno scoperto che il cromosoma omozigote attP40 interrompe la normale organizzazione glomerulare della classe di neuroni del recettore olfattivo Or47b in Drosophila11. Questi risultati suggeriscono che dovrebbero essere inclusi controlli rigorosi nella progettazione degli esperimenti e nell'interpretazione dei dati.
La Drosophila è un organismo modello ideale per l'interrogazione in vivo della funzione genica grazie al suo breve ciclo di vita, al basso costo e alla facile manutenzione. Lo screening genetico dell'intero genoma si basa sulla costruzione di librerie transgeniche dell'intero genoma in Drosophila 12,13,14,15. In precedenza abbiamo generato 5551 costrutti UAS-cDNA/ORF basati sul sistema binario GAL4/upstream activating sequence (GAL4/UAS), che coprono l'83% dei geni di Drosophila conservati nell'uomo nella Drosophila Genomics Resource Center (DGRC) Gold Collection16. I plasmidi UAS-cDNA/ORF possono essere utilizzati per la creazione di una libreria transgenica UAS-cDNA/ORF in Drosophila. Un'efficiente tecnologia di microiniezione di embrioni può accelerare la creazione di librerie di mosche transgeniche.
Per la microiniezione di embrioni, la punta dell'ago è normalmente rotta contro un vetrino coprioggetti17. In tal modo, gli aghi spesso si intasano o causano la fuoriuscita di grandi quantità di citoplasma e, quando si verificano questi problemi, è necessario utilizzare nuovi aghi. Sebbene gli aghi smussati possano migliorare l'efficienza della microiniezione, la soluzione di macinazione entra nella punta smussata durante il processo di macinazione. La soluzione di macinazione nella punta smussata non evapora rapidamente in modo naturale; pertanto, gli aghi non possono essere utilizzati per la microiniezione direttamente dopo la smussatura. Questi fattori riducono l'efficienza delle procedure di microiniezione embrionale. Qui, utilizzando come esempio la transgenesi sito-specifica mediata da phiC31 in Drosophila , presentiamo un protocollo per la microiniezione di embrioni per la transgenesi in Drosophila. Per evitare che la soluzione di macinazione entri nell'ago, utilizziamo una pompa dell'aria per esercitare una pressione dell'aria all'interno dell'ago, impedendo così alla soluzione di macinazione di entrare nella punta smussata. Gli aghi smussati sono pronti per il caricamento del campione e la microiniezione subito dopo la smussatura.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>100 &#956;m Cell Strainer</td>
			<td>NEST</td>
			<td>258367</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3M double-sided adhesive</td>
			<td>3M</td>
			<td>415</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate glass</td>
			<td>SUTTER</td>
			<td>B100-75-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diamond abrasive plate</td>
			<td>SUTTER</td>
			<td>104E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FLAMING/BROWN Micropipette Puller</td>
			<td>SUTTER</td>
			<td>P-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foot air pump with pressure gauge</td>
			<td>Shenfeng</td>
			<td>SF8705D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halocarbon oil 27</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H8773</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halocarbon oil 700</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H8898</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>ECLIPSE Ts2R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microinjection pump</td>
			<td>eppendorf</td>
			<td>FemtoJet 4i</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>eppendorf</td>
			<td>TransferMan 4r</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette Beveler</td>
			<td>SUTTER</td>
			<td>BV-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope cover glasses (18 mm x 18 mm)</td>
			<td>CITOLAS</td>
			<td>10211818C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides (25 mm x 75 mm)</td>
			<td>CITOLAS</td>
			<td>188105W</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish (90 mm x 15 mm)</td>
			<td>LAIBOER</td>
			<td>4190152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photo-Flo 200</td>
			<td>Kodak</td>
			<td>1026269</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAprep Spin Miniprep Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>27106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ745</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

embryo microinjection for transgenesis in drosophila

La transgenesi in Drosophila è un approccio essenziale per studiare la funzione genica a livello dell'organismo. La microiniezione di embrioni è un passaggio cruciale per la costruzione di mosche transgeniche. La microiniezione richiede alcuni tipi di apparecchiature, tra cui un microiniettore, un micromanipolatore, un microscopio invertito e uno stereomicroscopio. I plasmidi isolati con un kit di miniprep plasmidico sono qualificati per la microiniezione. Gli embrioni allo stadio di pre-blastoderma o blastoderma sinciziale, in cui i nuclei condividono un citoplasma comune, vengono sottoposti a microiniezione. Un colino cellulare facilita il processo di dechorionizzazione degli embrioni. Il momento ottimale per la decorionazione e l'essiccazione degli embrioni deve essere determinato sperimentalmente. Per aumentare l'efficienza della microiniezione di embrioni, gli aghi preparati da un estrattore devono essere smussati da una smerigliatrice ad aghi. Nel processo di rettifica degli aghi, utilizziamo una pompa dell'aria a pedale con un manometro per evitare l'effetto capillare della punta dell'ago. Iniettiamo abitualmente 120-140 embrioni per ogni plasmide e otteniamo almeno una linea transgenica per circa l'85% dei plasmidi. Questo articolo prende come esempio la transgenesi mediata dall'integrasi phiC31 in Drosophila e presenta un protocollo dettagliato per la microiniezione di embrioni per la transgenesi in Drosophila.

The fruit fly Drosophila melanogaster is extremely amenable to genetic manipulation and genetic analysis. Transgenic fruit flies are widely used in biological research. Since it was developed in the early 1980s, P-element transposon-mediated transgenesis has been indispensable for Drosophila research1. In some scenarios, other transposons, such as piggyBac and Minos have been used for transgenesis in Drosophila as well2. Transgenes via transposon are randomly inserted into the Drosophila genome, and the expression levels of transgenes at different genomic loci may vary due to position effects and thereby can not be compared2. These drawbacks were overcome by the phiC31-mediated site-specific transgenesis3. The bacteriophage&#160;phiC31 gene encodes an integrase that mediates sequence-specific recombination between the attB and attP sites in Drosophila3. Many attP docking sites have been characterized and are available in the Bloomington Drosophila Stock Center3,4,5,6,7,8,9.
The phiC31 transgenesis system for Drosophila has been widely used by the fly community. Among the attP docking sites, attP18 on the X chromosome, attP40 on the second chromosome, and attP2 on the third chromosome are usually the preferred sites for transgene integration on each chromosome because transgenes at the three sites show high levels of inducible expression while having low levels of basal expression5. Recently, however, van der Graaf and colleagues found that the attP40 site, close to the Msp300 gene locus, and transgenes integrated at attP40 cause larval muscle nuclear clustering in Drosophila10. In another recent study, Duan and colleagues found that the homozygous attP40 chromosome disrupts the normal glomerular organization of the Or47b olfactory receptor neuron class in Drosophila11. These findings suggest that rigorous controls should be included when designing experiments and interpreting data.
Drosophila is an ideal model organism for in vivo interrogation of gene function due to its short life cycle, low cost, and easy maintenance. Genome-wide genetic screening relies on the construction of genome-wide transgenic libraries in Drosophila12,13,14,15. We previously generated 5551 UAS-cDNA/ORF constructs based on the binary GAL4/upstream activating sequence (GAL4/UAS) system, covering 83% of the Drosophila genes conserved in humans in the Drosophila Genomics Resource Center (DGRC) Gold Collection16. The UAS-cDNA/ORF plasmids can be used for the creation of a transgenic UAS-cDNA/ORF library in Drosophila. Efficient embryo microinjection technology can accelerate the creation of transgenic fly libraries.
For embryo microinjection, the needle tip is normally broken against a coverslip17. Thereby, needles frequently become clogged or cause leakage of large amounts of cytoplasm, and when these issues arise, new needles must be employed. Although beveling needles can enhance microinjection efficiency, the grinding solution enters the beveled tip during the grinding process. The grinding solution in the beveled tip does not quickly evaporate naturally; therefore, needles can not be utilized for microinjection directly after beveling. These factors reduce the efficiency of embryo microinjection procedures. Here, using the phiC31-mediated site-specific transgenesis in Drosophila as an example, we present a protocol for embryo microinjection for transgenesis in Drosophila.&#160;To prevent the grinding solution from entering the needle, we utilize an air pump to exert air pressure within the needle, thereby preventing the grinding solution from entering the beveled tip. Beveled needles are ready for sample loading and microinjection directly after beveling.

Autore in primo piano: Ottimizzazione della microiniezione di embrioni per la transgenesi in Drosophila

Microiniezione di embrioni per la transgenesi in Drosophila

La punta di un ago per iniezione è smussata da una smerigliatrice ad aghi (Figura 1). Si possono smussare 50-60 aghi in un'ora. Il DNA viene microiniettato nella parte posteriore di un embrione allo stadio di pre-blastoderma o blastoderma sinciziale, dove i nuclei condividono un citoplasma comune (Figura 2A). La parte posteriore di un embrione può essere facilmente localizzata in base al micropilo nella parte anteriore dell'embrione (Figur...

Questo articolo prende come esempio la transgenesi mediata dall'integrasi phiC31 in Drosophila e presenta un protocollo ottimizzato per la microiniezione di embrioni, un passaggio cruciale per la creazione di mosche transgeniche.

Transgenesis in Drosophila is an essential approach to studying gene function at the organism level. Embryo microinjection is a crucial step for the ...

La transgenesi in Drosophila è essenziale per studiare la funzione genica a livello dell'organismo. La microiniezione di embrioni è un passaggio cruciale per la costruzione di mosche transgeniche. Qui, prendiamo come esempio la transgenesi mediata dall'integrasi phiC31 in Drosophila e presentiamo un protocollo dettagliato per la microiniezione di embrioni per la transgenesi in Drosophila.Gli aghi per iniezione le cui punte sono smussate da una smerigliatrice di solito non si bloccano o provocano grandi perdite citoplasmatiche. Tuttavia, la soluzione di macinazione può entrare nella punta smussata di un ago durante il processo di macinazione e la soluzione di macinazione all'interno della punta non si asciuga naturalmente rapidamente. Il nostro protocollo utilizza una pompa ad aria a pedale con un manometro per applicare la pressione dell'aria a un ago mentre si macina la punta.In questo modo si evita che la soluzione di macinazione si sifoni, quindi che la soluzione di macinazione entri nella punta smussata, consentendo l'utilizzo immediato dell'ago smussato.

embryo-microinjection-for-transgenesis-in-drosophila

Research

JoVE Journal

Genetics

Embryo Microinjection for Transgenesis in Drosophila

1.2K Views.  University of South China. La transgenesi in Drosophila è essenziale per studiare la funzione genica a livello dell'organismo. La microiniezione di embrioni è un passaggio cruciale per la costruzione di mosche transgeniche. Qui, prendiamo come esempio la transgenesi mediata dall'integrasi phiC31 in Drosophila e presentiamo un protocollo dettagliato per la microiniezione di embrioni per la transgenesi in Drosophila.Gli aghi per iniezione le cui punte sono smussate da una smerigliatrice di solito non si bloccano...

Video: Autore in primo piano: Ottimizzazione della microiniezione di embrioni per la transgenesi in Drosophila

Transgenesis in Drosophila is an essential approach to studying gene function at the organism level. Embryo microinjection is a crucial step for the construction of transgenic flies. Microinjection requires some types of equipment, including a microinjector, a micromanipulator, an inverted microscope, and a stereo microscope.&#160;Plasmids isolated with a plasmid miniprep kit are qualified for microinjection. Embryos at the pre-blastoderm or syncytial blastoderm stage, where nuclei share a common cytoplasm, are subjected to microinjection. A cell strainer eases the process of dechorionating embryos. The optimal time for dechorionation and desiccation of embryos needs to be determined experimentally. To increase the efficiency of embryo microinjection, needles prepared by a puller need to be beveled by a needle grinder. In the process of grinding needles, we utilize a foot air pump with a pressure gauge to avoid the capillary effect of the needle tip. We routinely inject 120-140 embryos for each plasmid and obtain at least one transgenic line for around 85% of plasmids. This article takes the phiC31 integrase-mediated transgenesis in Drosophila as an example and&#160;presents a detailed protocol for embryo microinjection for transgenesis in Drosophila.

This article takes the phiC31 integrase-mediated transgenesis in Drosophila as an example and presents an optimized protocol for embryo microinjection,&#160;a crucial step for creating transgenic flies.