تستخدم مجموعتنا البحثية الميتوكوندريا كهدف دوائي لتطوير منتجات مختلفة مثل المواد الكيميائية والمبيدات الحشرية وغيرها. من خلال هذا الفيديو، نريد وصف منهجية تقييم إنزيمات تنفس الميتوكوندريا بطريقة يسهل الوصول إليها وقابلية للفهم وقابلية للاستخدام. في مختبرنا ، أنشأنا بروتوكولا لتقييم التأثيرات المختلفة على الكائنات الغريبة الحيوية على الميتوكوندريا في الفئران والبعوض والقراد ، مما يوفر بعض الأفكار حول استجابة معينة للميتوكوندريا.
يدعم هذا النهج صياغة مبيدات الآفات الآمنة بيولوجيا من خلال تحديد اضطرابات الطاقة الحيوية للميتوكوندريا الحاسمة لتقليل السمية غير المستهدفة. تشمل ميزتنا التفاضلية بروتوكول تصميم المبيدات الحشرية الذي يبدأ بتحليل السيليكو لآلاف الجزيئات ، يليه التحقق من الصحة في المختبر لتلك التي تفي بمعايير الأمن البيولوجي ، وينتهي باختبار في الجسم الحي. توفر هذه الطريقة الوقت والموارد مع الالتزام بأفضل الممارسات في إنتاج مبيدات الآفات.
على المدى المتوسط ، سنختار الجزيئات المشتقة بشكل طبيعي والتي يمكن دمجها مع التعديل الجيني ، واستهداف الميتوكوندريا الحشرية ، بهدف تعزيز الخصوصية والأمن البيولوجي في الكائنات غير المستهدفة. للبدء ، قم بإعداد 250 مل من عازل عزل الميتوكوندريا مع أو بدون 0.2 جرام من BSA. Aliquot 10 مل من المخزن المؤقت في أنبوب مخروطي بارد مثلج.
بعد القتل الرحيم للفأر ، قم بتشريح كبده تماما وضعه في عازلة العزل المثلجة لشطفه. بعد غسلتين ، افرم أنسجة الكبد بمقص حاد في طبق بتري يحتوي على 10 مل من عازلة العزل. ضع المحلول في أنبوب خالط الأنسجة Potter-Elvehjem لتجانس الأنسجة المفرومة 10 مرات على الأقل بسرعة منخفضة تبلغ 390 دورة في الدقيقة.
بعد ذلك ، انقل المحلول المتجانس إلى أنبوب مخروطي الشكل وجهاز طرد مركزي عند 600 جم لمدة 10 دقائق عند أربع درجات مئوية. بعد الطرد المركزي ، اسكب المادة الطافية بعناية في أنبوب مخروطي جديد. قم بتشغيل الطرد الطافي مرة أخرى عند 7 ، 000 جم لمدة 10 دقائق عند أربع درجات مئوية وتخلص من المادة الطافية الناتجة.
أعد تعليق حبيبات الميتوكوندريا المعزولة في ملليلترين من المخزن المؤقت للعزل بدون BSA. تحقق مما إذا كان بيض الزاعجة المصرية قد فقس في صواني بماء منزوع الكلور مفلتر قبل أسبوع واحد من التجربة ، وراقب عملية طرح الريش في اليرقات. بمجرد وصول اليرقات إلى المرحلة L3 ، انتظر لمدة أقصاها 12 ساعة قبل جمعها.
باستخدام ماصة باستور، اجمع ما لا يقل عن 100 يرقة الزاعجة المصرية في الأطوار L3 إلى L4 في حوالي 30 مل من الماء الخالي من الكلور. بعد التصفية ، انقل المحلول مع اليرقات إلى أنبوب خالط الأنسجة Potter-Elvehjem وقم بتجانس بعناية عند حوالي 390 دورة في الدقيقة 10 مرات على الأقل. انقل الأنسجة المتجانسة من خلال حقنة من الصوف الزجاجي لتصفية بقايا الهيكل الخارجي الكبيرة.
للبدء ، احصل على ميتوكوندريا كبد الفئران واليرقات الزاعجة المصرية المتجانسة L3 ، L4. بالنسبة للفحص الاستبطاري ، قم بمعايرة مقياس التنفس عالي الدقة كل يوم قبل بدء أي فحوصات ، باتباع تعليمات الشركة المصنعة. أضف وسيط التفاعل إلى الغرف ، مما يضمن زيادة لا تقل عن 0.2 مل فوق حجم الغرفة التجريبية القياسي البالغ ملليلترا.
راقب استهلاك الأكسجين لقياس أنشطة NADH وأوكسيداز السكسينات بعد إضافة مخزن التفاعل المؤقت، 0.1 ملليغرام من البروتين، والركيزة. انتظر حتى تستقر إشارة تركيز الأكسجين وقم بتسجيلها. أضف مثبطات بروتين نقل الإلكترون إلى الغرفة للتأكد من أن استهلاك الأكسجين الملحوظ يرجع إلى سلسلة الجهاز التنفسي للميتوكوندريا.
بالنسبة لنشاط نازعة هيدروجين NADH ، قم أولا بإعداد نظام التفاعل الذي يحتوي على جميع المكونات المطلوبة وأضف الكواشف إلى خلية مقياس الطيف الضوئي. راقب نشاط نازعة هيدروجين NADH مع تقليل فيروسيانيد البوتاسيوم عند 420 نانومتر. استخدم معامل الانقراض المولي البالغ 1.04 لكل مليمولار لكل سنتيمتر لحساب التركيز.
أخيرا ، اقسم النشاط المبلغ عنه على تركيز البروتين المستخدم للحصول على نشاط الإنزيم المحدد. وبالمثل ، قم بتقييم نازعة هيدروجين السكسينات وخزل السيتوكروم ج أو النشاط الثالث المركب باستخدام مخاليط التفاعل المناسبة. لقياس السيتوكروم ج أوكسيديز أو نشاط المركب الرابع ، قم بإعداد نظام التفاعل وخلط كميات مولية متساوية من السيتوكروم ج وديثيونيت الصوديوم ، مما يضمن التخفيض الكامل.
مرر الخليط المخفض عبر عمود هلام ديكستران متقاطع باستخدام المخزن المؤقت للفوسفات كمرحلة متحركة. حدد الكسور التي تم جمعها عند 550 نانومتر في مقياس الطيف الضوئي. أخيرا ، احسب التركيز بمعامل انقراض مولي يبلغ 19.8 لكل مليمولار لكل سنتيمتر ، بتطبيق قانون بير.
اقسم النشاط المبلغ عنه على تركيز البروتين للحصول على نتائج نشاط إنزيم معين. قلل كافاكرول بنسبة 9.7 جزء في المليون من نشاط أوكسيديز NADH بحوالي 9.35٪ بينما قلل زيت Cymbopogon flexuosus العطري ، أو EO ، عند 10 أجزاء في المليون من أكسدة NADH وتقليل الأكسجين بحوالي 34٪ مما يشير إلى تثبيط في نقل الإلكترون بين المركب الأول والمركب IV ، قلل كافاكرول من نشاط أوكسيديز السكسينات بحوالي 10.84٪ في يرقات الزاعجة المصرية ، و Cymbopogon flexuosus EO قلل من نشاط أوكسيديز السكسينات بنسبة تصل إلى 50٪ في الميتوكوندريا المعزولة في كبد الفئران ، مما يشير إلى تثبيط بين المركب الثاني والمركب IV.Cavacrol قلل من نشاط اختزال السيتوكروم ج NADH وأكسدة السيتوكروم ج وتقليل الأكسجين في المركب الرابع في يرقات الزاعجة المصرية ، بينما قلل Cymbopogon flexuosus EO من نشاط السيتوكروم ج أوكسيديز بحوالي 58٪ في الميتوكوندريا في كبد الفئران.
