우리 연구 그룹은 미토콘드리아를 화학요법, 살충제 등과 같은 다양한 제품 개발을 위한 약리학적 표적으로 사용합니다. 이 비디오를 통해 미토콘드리아 호흡의 효소를 평가하는 방법론을 보다 접근하기 쉽고 이해하기 쉽고 사용 가능한 방식으로 설명하고자 합니다. 우리 연구실에서는 쥐, 모기 및 진드기의 미토콘드리아에 대한 이종생물체학의 다양한 효과를 평가하기 위한 프로토콜을 수립하여 특정 미토콘드리아 반응에 대한 몇 가지 통찰력을 제공합니다.
이 접근법은 비표적 독성을 최소화하는 데 중요한 미토콘드리아 생물 에너지 중단을 식별하여 바이오 안전 살충제 제형을 지원합니다. 당사의 차별화된 장점으로는 수천 개의 분자에 대한 인실리코(in silico) 분석으로 시작하여 생물 보안 기준을 충족하는 분자에 대한 체외 검증으로 마무리되는 살충제 설계 프로토콜이 있으며, 이는 생체 내 테스트로 마무리됩니다. 이 방법은 시간과 자원을 절약하는 동시에 살충제 생산의 모범 사례를 준수합니다.
중기적으로는 곤충 미토콘드리아를 표적으로 유전자 변형과 결합할 수 있는 자연 유래 분자를 선택하여 비표적 유기체의 특이성과 생물학적 안전성을 향상시키는 것을 목표로 할 것입니다. 시작하려면 BSA 0.2g을 포함하거나 포함하지 않고 250ml의 미토콘드리아 분리 완충액을 준비합니다. 완충액 10ml를 얼음처럼 차가운 원뿔형 튜브에 분취합니다.
쥐를 안락사시킨 후, 쥐의 간을 완전히 해부하고 얼음처럼 차가운 격리 완충액에 넣어 헹굽니다. 두 번 씻은 후 10ml의 분리 완충액이 들어 있는 페트리 접시에 날카로운 가위로 간 조직을 다집니다. 용액을 Potter-Elvehjem 조직 균질화 튜브에 넣어 분당 390회전의 낮은 속도로 다진 조직을 최소 10회 균질화합니다.
그런 다음 균질화된 용액을 원뿔형 튜브로 옮기고 섭씨 4도에서 10분 동안 600G에서 원심분리합니다. 원심분리 후 상등액을 새 원뿔형 튜브에 조심스럽게 붓습니다. 상층액을 다시 7, 000G에서 섭씨 4도에서 10분 동안 원심분리하고 생성된 상등액을 버립니다.
분리된 미토콘드리아 펠릿을 BSA 없이 2ml의 분리 완충액에 재현탁합니다. 실험 일주일 전에 Aedes aegypti 알이 여과된 탈염소수가 담긴 쟁반에서 부화했는지 확인하고 유충의 털갈이 과정을 모니터링합니다. 유충이 L3 단계에 도달하면 최대 12시간 동안 기다렸다가 수집합니다.
파스퇴르 피펫을 사용하여 약 30ml의 무염소 물에 instars L3에서 L4에서 최소 100마리의 Aedes aegypti 유충을 수집합니다. 여과 후 유충이 있는 용액을 Potter-Elvehjem 조직 균질화 튜브로 옮기고 분당 약 390회전으로 최소 10회 조심스럽게 균질화합니다. 균질화된 조직을 유리솜 주사기를 통해 옮겨 큰 외골격 잔류물을 걸러냅니다.
시작하려면 쥐 간 미토콘드리아와 균질화된 Aedes aegypti L3, L4 유충을 얻습니다. 폴라로그래픽 분석의 경우, 분석을 시작하기 전에 매일 제조업체의 지침에 따라 고해상도 호흡계를 보정하십시오. 챔버에 반응 배지를 추가하여 표준 실험 챔버 부피인 2밀리리터보다 최소 0.2밀리리터 이상 초과되도록 합니다.
반응 완충액, 단백질 0.1mg, 기질을 추가한 후 NADH 및 숙시네이트 산화효소 활성을 측정하기 위해 산소 소비량을 모니터링합니다. 산소 농도 신호가 안정될 때까지 기다렸다가 기록하십시오. 전자 수송 단백질 억제제를 챔버에 추가하여 관찰된 산소 소비가 미토콘드리아 호흡 사슬에 의한 것인지 확인합니다.
NADH 탈수소효소 활성을 위해서는 먼저 필요한 모든 성분을 포함하는 반응 시스템을 준비하고 분광광도계 셀에 시약을 추가합니다. 420나노미터에서 페로시아나이드칼륨의 감소로 NADH 탈수소효소 활성을 모니터링합니다. 농도를 계산하려면 센티미터당 밀리몰당 1.04의 몰 흡광 계수를 사용합니다.
마지막으로, 보고된 활성을 특정 효소 활성을 얻는 데 사용된 단백질 농도로 나눕니다. 유사하게, 적절한 반응 혼합물을 사용하여 숙시네이트 탈수소효소 및 시토크롬 c 환원효소 또는 복합체 III 활성을 평가합니다. 사이토크롬 c 산화효소 또는 복합체 IV 활성을 측정하려면 반응 시스템을 준비하고 동일한 몰량의 사이토크롬 c와 디티오나이트나트륨을 혼합하여 완전한 감소를 보장합니다.
인산염 완충액을 이동상으로 사용하여 감소된 혼합물을 가교 결합된 dextran 겔 컬럼에 통과시킵니다. 분광 광도계에서 550나노미터에서 수집된 분획을 정량화합니다. 마지막으로 Beer의 법칙을 적용하여 센티미터당 밀리몰당 19.8의 몰 흡광 계수로 농도를 계산합니다.
보고된 활성을 특정 효소 활성 결과에 대한 단백질 농도로 나눕니다. 9.7ppm의 카바크롤은 NADH 산화효소 활성을 약 9.35% 감소시켰고, 10ppm에서 Cymbopogon flexuosus 에센셜 오일(EO)은 NADH 산화 및 산소 환원을 약 34% 감소시켜 복합체 I과 복합체 IV 사이의 전자 수송 억제를 나타냈다.카바크롤은 Aedes aegypti 유충에서 숙신산 산화효소 활성을 약 10.84% 감소시켰다. Cymbopogon flexuosus EO는 고립된 쥐 간 미토콘드리아에서 숙시네이트 산화효소 활성을 최대 50%까지 감소시켰으며, 이는 복합체 II와 복합체 IV 사이의 억제를 시사하며, Cavacrol은 Aedes aegypti 유충의 복합체 IV에서 NADH 사이토크롬 c 환원효소 활성과 시토크롬 c 산화 및 산소 환원을 감소시켰으며, Cymbopogon flexuosus EO는 쥐 간 미토콘드리아에서 사이토크롬 c 산화효소 활성을 약 58% 감소시켰습니다.
