Araştırma grubumuz, diğerlerinin yanı sıra kemoterapuslar, böcek ilaçları gibi farklı ürünlerin geliştirilmesi için farmakolojik hedef olarak mitokondriyi kullanmaktadır. Bu video ile mitokondriyal solunum enzimlerini daha erişilebilir, anlaşılır ve kullanılabilir bir şekilde değerlendirmek için metodolojiyi açıklamak istiyoruz. Laboratuvarımızda, sıçanlarda, sivrisineklerde ve kenelerde mitokondri üzerindeki ksenobiyotikler üzerindeki farklı etkileri değerlendirmek için bir protokol oluşturduk ve belirli bir mitokondriyal yanıt hakkında bazı bilgiler sağladık.
Bu yaklaşım, hedef dışı toksisiteyi en aza indirmek için kritik olan mitokondriyal biyoenerjetik bozulmalarını belirleyerek biyo-güvenli pestisit formülasyonunu destekler. Diferansiyel avantajımız, binlerce molekülün in silico analizi ile başlayan, ardından biyogüvenlik kriterlerini karşılayanların in vitro validasyonu ile devam eden ve in vivo testlerle sonuçlanan bir insektisit tasarım protokolünü içerir. Bu yöntem, pestisit üretimindeki en iyi uygulamaya bağlı kalırken zamandan ve kaynaklardan tasarruf sağlar.
Orta vadede, böcek mitokondrilerini hedef alan, hedef olmayan organizmalarda gelişmiş özgüllük ve biyogüvenliği hedefleyen, genetik modifikasyonla birleştirilebilen doğal olarak türetilmiş molekülleri seçeceğiz. Başlamak için, 0.2 gram BSA olsun veya olmasın 250 mililitre mitokondri izolasyon tamponu hazırlayın. Tamponun 10 mililitresini buz gibi soğuk bir konik tüpe koyun.
Bir fareye ötenazi yaptıktan sonra, karaciğerini tamamen inceleyin ve durulamak için buz gibi soğuk izolasyon tamponuna koyun. İki yıkamadan sonra, karaciğer dokusunu 10 mililitre izolasyon tamponu içeren bir Petri kabında keskin bir makasla kıyın. Kıyılmış dokuyu dakikada 390 devir gibi düşük bir hızda en az 10 kez homojenize etmek için solüsyonu Potter-Elvehjem doku homojenizatör tüpüne yerleştirin.
Daha sonra homojenize çözeltiyi konik bir tüpe aktarın ve dört santigrat derecede 10 dakika boyunca 600 G'de santrifüjleyin. Santrifüjlemeden sonra, süpernatanı dikkatlice yeni bir konik tüpe dökün. Süpernatanı tekrar 7.000 G'de dört santigrat derecede 10 dakika santrifüjleyin ve elde edilen süpernatanı atın.
İzole edilmiş mitokondriyal peleti BSA olmadan iki mililitre izolasyon tamponunda yeniden süspanse edin. Deneyden bir hafta önce Aedes aegypti yumurtalarının filtrelenmiş klorsuz su ile tepsilerde yumurtadan çıkıp çıkmadığını kontrol edin ve larvalardaki tüy dökme sürecini izleyin. Larvalar L3 aşamasına ulaştığında, onları toplamadan önce en fazla 12 saat bekleyin.
Bir Pasteur pipeti kullanarak, yaklaşık 30 mililitre klorsuz suda L3 ila L4 arasındaki yıldızlarda en az 100 Aedes aegypti larvası toplayın. Filtrelemeden sonra, larvalarla olan çözeltiyi Potter-Elvehjem doku homojenizatör tüpüne aktarın ve en az 10 kez dakikada yaklaşık 390 devirde dikkatlice homojenize edin. Büyük dış iskelet kalıntılarını filtrelemek için homojenize dokuyu bir cam yünü şırıngadan geçirin.
Başlamak için, sıçan karaciğeri mitokondri ve homojenize Aedes aegypti L3, L4 larvaları elde edin. Polarografik tahlil için, herhangi bir tahlillere başlamadan önce üreticinin talimatlarını izleyerek yüksek çözünürlüklü respirometreyi her gün kalibre edin. Odalara reaksiyon ortamı ekleyin, iki mililitrelik standart deney odası hacminin üzerinde en az 0.2 mililitre fazlalık sağlayın.
Reaksiyon tamponu, 0.1 miligram protein ve substrat eklendikten sonra NADH ve süksinat oksidaz aktivitelerini ölçmek için oksijen tüketimini izleyin. Oksijen konsantrasyonu sinyali stabilize olana kadar bekleyin ve kaydedin. Gözlenen oksijen tüketiminin mitokondriyal solunum zincirinden kaynaklandığını doğrulamak için odaya elektron taşıma protein inhibitörleri ekleyin.
NADH dehidrojenaz aktivitesi için önce gerekli tüm bileşenleri içeren reaksiyon sistemini hazırlayın ve reaktifleri spektrofotometre hücresine ekleyin. 420 nanometrede potasyum ferrosiyanürün azaltılmasıyla NADH dehidrojenaz aktivitesini izleyin. Konsantrasyonu hesaplamak için santimetre başına milimolar başına 1.04 molar sönme katsayısını kullanın.
Son olarak, rapor edilen aktiviteyi, spesifik enzim aktivitesini elde etmek için kullanılan protein konsantrasyonuna bölün. Benzer şekilde, uygun reaksiyon karışımları kullanarak süksinat dehidrojenaz ve sitokrom c redüktaz veya kompleks III aktivitesini değerlendirin. Sitokrom c oksidaz veya Kompleks IV aktivitesini ölçmek için, reaksiyon sistemini hazırlayın ve eşit molar miktarlarda sitokrom c ve sodyum ditiyonit karıştırarak tam indirgeme sağlayın.
İndirgenmiş karışımı, mobil faz olarak fosfat tamponunu kullanarak çapraz bağlı bir dekstran jel kolonundan geçirin. Bir spektrofotometrede 550 nanometrede toplanan fraksiyonları ölçün. Son olarak, Beer yasasını uygulayarak santimetre başına milimolar başına 19.8'lik bir molar sönme katsayısı ile konsantrasyonu hesaplayın.
Spesifik enzim aktivitesi sonuçları için rapor edilen aktiviteyi protein konsantrasyonuna bölün. Milyonda 9.7 parçada Cavacrol, NADH oksidaz aktivitesini yaklaşık% 9.35 oranında azaltırken, Cymbopogon flexuosus esansiyel yağı veya EO, milyonda 10 parçada, NADH oksidasyonunu ve oksijen azalmasını yaklaşık% 34 oranında azalttı, bu da Kompleks I ve Kompleks IV arasındaki elektron taşınmasında inhibisyonu gösterir. ve Cymbopogon flexuosus EO, izole sıçan karaciğeri mitokondrisinde süksinat oksidaz aktivitesini %50'ye kadar azalttı, bu da Kompleks II ve Kompleks IV arasında bir inhibisyon olduğunu düşündürdü. Aedes aegypti larvalarında NADH sitokrom c redüktaz aktivitesini ve Kompleks IV'te sitokrom c oksidasyonunu ve oksijen redüksiyonunu azaltırken, Cymbopogon flexuosus EO, sıçan karaciğeri mitokondrilerinde sitokrom c oksidaz aktivitesini yaklaşık% 58 oranında azalttı.
