単離されたミトコンドリアにおける異種生物の輸送と効果の解明:呼吸器測定および酵素アッセイからの洞察

私たちの研究グループでは、ミトコンドリアを薬理学的標的として、ケモセラプテス、殺虫剤などのさまざまな製品を開発しています。このビデオでは、ミトコンドリア呼吸の酵素をよりアクセスしやすく、理解しやすく、使いやすい方法で評価する方法を説明したいと思います。私たちの研究室では、ラット、蚊、ダニのミトコンドリアに対する生体異物のさまざまな影響を評価するためのプロトコルを確立し、特定のミトコンドリア応答に関するいくつかの洞察を提供しています。

このアプローチは、非標的毒性を最小限に抑えるために重要なミトコンドリアの生体エネルギー破壊を特定することにより、バイオセーフな農薬製剤をサポートします。当社の差別化された利点には、数千の分子のin silico分析から始まり、バイオセキュリティ基準を満たす分子のin vitro検証、およびin vivo試験で終わる殺虫剤設計プロトコルが含まれます。この方法は、農薬製造のベストプラクティスを遵守しながら、時間とリソースを節約します。

中期的には、昆虫のミトコンドリアを標的として、遺伝子組換えと組み合わせ可能な天然由来の分子を選抜し、非標的生物の特異性とバイオセキュリティの向上を目指します。まず、0.2グラムのBSAの有無にかかわらず、250ミリリットルのミトコンドリア分離バッファーを調製します。10ミリリットルのバッファーを氷のように冷たい円錐形のチューブに分注します。

ラットを安楽死させた後、肝臓を完全に解剖し、氷冷分離バッファーに入れてすすぎます。2回の洗浄後、10ミリリットルの分離緩衝液を含むペトリ皿で鋭利なはさみで肝臓組織をミンチにします。溶液をPotter-Elvehjem組織ホモジナイザーチューブに入れ、ミンチ組織を毎分390回転の低速で少なくとも10回均質化します。

次に、均質化した溶液を円錐形のチューブに移し、摂氏4度で600Gで10分間遠心分離します。遠心分離後、上清を新しい円錐形のチューブに慎重に注ぎます。上清を7, 000Gで摂氏4度で10分間再度遠心分離し、得られた上清を廃棄します。

単離したミトコンドリアペレットをBSAを含まない2ミリリットルの単離緩衝液に再懸濁します。実験の1週間前に、ネッタイシマカの卵がろ過された脱塩素水を入れたトレイで孵化しているかどうかを確認し、幼虫の脱皮過程を監視します。幼虫がL3段階に到達したら、最大12時間待ってから収集します。

パスツールピペットを使用して、インスターL3からL4で少なくとも100匹のネッタイシマカの幼虫を約30ミリリットルの塩素を含まない水に集めます。ろ過後、幼虫を含む溶液をPotter-Elvehjem組織ホモジナイザーチューブに移し、毎分約390回転で少なくとも10回慎重に均質化します。均質化された組織をグラスウールシリンジに移し、大きな外骨格残留物をろ過します。

まず、ラット肝臓のミトコンドリアと均質化されたネッタイシマカL3、L4幼虫を入手します。ポーラログラフアッセイの場合は、アッセイを開始する前に、製造元の指示に従って、毎日高解像度呼吸計を校正してください。反応媒体をチャンバーに追加し、標準的な実験チャンバーの容積である2ミリリットルを少なくとも0.2ミリリットル上回るようにします。

酸素消費量をモニターして、反応バッファー、0.1ミリグラムのタンパク質、および基質を添加した後のNADHおよびコハク酸オキシダーゼ活性を測定します。酸素濃度信号が安定するまで待ってから記録してください。電子伝達タンパク質阻害剤をチャンバーに添加して、観察された酸素消費がミトコンドリア呼吸鎖によるものであることを確認します。

NADHデヒドロゲナーゼ活性については、まず必要なすべての成分を含む反応系を調製し、試薬を分光光度計セルに添加します。NADHデヒドロゲナーゼ活性をモニターし、フェロシアン化カリウムを420ナノメートルで減少させます。モル吸光係数 1.04 /ミリモル/センチメートルを使用して、濃度を計算します。

最後に、報告された活性を、特定の酵素活性を得るために使用したタンパク質濃度で割ります。同様に、コハク酸デヒドロゲナーゼとシトクロムcレダクターゼ、または複合体IIIの活性を適切な反応混合物を用いて評価します。シトクロムcオキシダーゼまたはコンプレックスIV活性を測定するには、反応システムを準備し、等モル量のシトクロムcとジチオン酸ナトリウムを混合して、完全な還元を確保します。

還元された混合物を、リン酸バッファーを移動相として使用して架橋デキストランゲルカラムに通します。分光光度計で550ナノメートルで収集されたフラクションを定量化します。最後に、ビールの法則を適用して、モル吸光係数19.8/ミリモル/センチメートルで濃度を計算します。

報告された活性をタンパク質濃度で割ると、特定の酵素活性結果が得られます。9.7ppmのカバクロールはNADHオキシダーゼ活性を約9.35%減少させ、10ppmのCymbopogon flexuosusエッセンシャルオイル、またはEOは、10ppmでNADH酸化と酸素減少を約34%減少させ、複合体Iと複合体IVとの間の電子輸送の阻害を示しました。 Cymbopogon flexuosus EOは、コハク酸オキシダーゼ活性を最大50%減少させた分離ラット肝臓ミトコンドリアで、コンプレックスIIとコンプレックスIV.Cavacrolとの間の阻害を示唆し、ネッタイシマカの幼虫のコンプレックスIVでNADHシトクロームcレダクターゼ活性とシトクロムc酸化と酸素減少を減少させ、Cymbopogon flexuosus EOはラット肝臓ミトコンドリアでシトクロムcオキシダーゼ活性を約58%減少させた。